Los autores agradecen a la Fundación Armenise-Harvard, la Marie-Curie Trentino COFUND (ACS), la Provincia Autónoma de Trento (Ecomm) y CIBIO de financiación.

1. Preparación de la plantilla de ADN <ol><li> Purificar plásmido a partir de una cepa de laboratorio estándar de E. coli, tales como E. coli DH5a o Nova azul con un kit comercial. Alternativamente, un producto de la PCR lineal se puede purificar de manera similar con un kit comercial. Eluir el ADN con H 2 O solamente. </li><li> Fenol-cloroformo extracto de la solución de ADN 26. </li><li> Determinar la concentración de ADN y la pureza, por ejemplo, mediante la absorbancia UV u otros métodos adecuados. Es importante la utilización de ADN altamente puro para una eficiente transcripción-traducción. </li></ol> 2. Preparación de la película delgada de lípidos <ol><li> Pesar el polvo de lípido seca y se disuelve en el disolvente. Para 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (POPC), soluciones madre se prepararon en cloroformo a una concentración de 40 mg / ml. Nota: Disolventes orgánicos siempre deben manipularse con pipetas de vidrio y botellas. En otras palabras, nunca debe ser utilizado plástico. S Storesoluciones tac, en botellas de aire ajustados resistente a los disolventes de vidrio ámbar a -20 ° C, preferiblemente en atmósfera de argón. </li><li> Alícuota de 12 mol POPC (220 l de 40 mg / ml de solución madre) en un matraz de fondo redondo de 5 ml. </li><li> Se evapora el disolvente con un evaporador rotatorio (Figura 1) para generar la película delgada de lípido. <ol><li> Fije firmemente el matraz de fondo redondo al tubo de destilación con un clip circular y comenzar la rotación del matraz. </li><li> Iniciar la circulación de agua a través del serpentín del condensador. El uso de un baño de calor no es necesario, porque cloroformo tiene un bajo punto de ebullición de 61,2 ° C a la presión atmosférica normal. </li><li> Asegúrese de que el sistema está abierto a la atmósfera por la comprobación de que la llave de paso está abierta. Encienda la bomba de vacío y cierre lentamente la llave de paso para aplicar el vacío al sistema. </li><li> Una película delgada de lípido se deposita sobre las paredes del matraz de fondo redondo durante la evaporación rotatorio formando una película opacaque es visible por el ojo. Deje que la evaporación rotatoria continuará por 0.5-2 horas. Para detener el proceso, suelte lentamente la presión de vacío, detener la rotación, y retire el matraz de fondo redondo. </li></ol></li></ol> 3. La resuspensión de lípidos y homogeneización Vesícula <ol><li> Añadir 1 ml 18.2 mW H 2 O a la película lipídica delgada directamente en el matraz de fondo redondo. Vórtice vigorosamente la solución a la velocidad máxima, aproximadamente 3.200 rpm, hasta que la película lipídica se separa de la copa, que es observable por el ojo. </li><li> Transferir la dispersión de lípidos en un tubo de microcentrífuga de 2 ml. </li><li> Puesta en marcha de un anillo de soporte para mantener un homogeneizador con una punta de 5 mm. Coloque un soporte debajo de la microcentrífuga homogeneizador para sostener con seguridad la dispersión de lípidos. Enjuague el elemento de dispersión del homogeneizador sumergiendo la punta de 18,2 mW H 2 O y en funcionamiento durante unos segundos. </li><li> Coloque el elemento de dispersión directamente en la dispersión de lípidos asegurar ªen la punta no toque el fondo del tubo de microcentrífuga. Mezclar durante 1 minuto a potencia 4 ó 14.000 rpm. </li></ol> 4. Extrusión de vesículas y liofilización <ol><li> Montar las partes de la mini-extrusora (Figura 2), que consta de una carcasa exterior y una tuerca de retención que alberga dos membrana interna de teflón apoya, dos juntas tóricas, y un cojinete de teflón. <ol><li> Coloque las dos juntas tóricas en las ranuras de los soportes de membrana internas. Prehumedecido dos filtros y una membrana de 400 nm. Los filtros se colocarán en contra del Teflon interior de las juntas tóricas con la membrana entre ellos. </li><li> Coloca la membrana apoya en la carcasa exterior extrusora con la membrana rodeada por dos filtros entre en las juntas tóricas. Coloque el cojinete de teflón interior de la carcasa y coloque la tuerca de retención y apriete a mano. </li></ol></li><li> Enjuague dos jeringas y llenar uno con 18,2 mW agua. Inserte las agujas de las jeringas en el pequeño holes en el teflón en cada extremo del conjunto de extrusor. Las agujas deben deslizarse con facilidad, no fuerce las agujas. Asegure la extrusora con las jeringas en la carcasa del extrusor y asegurar. </li><li> Pasar el agua a través de la extrusora empujando lentamente el agua de una jeringa y en el otro. Esto representa un pasaje. Repita el procedimiento para un total de tres pasos necesarios para garantizar que no hay fugas presentes. Retire la jeringa de agua y deseche el agua. </li><li> Llene una jeringa con la muestra, adjuntar a la extrusora, y pasar lentamente la solución de la vesícula a través de la membrana como se describe anteriormente en el paso 4.3. Repita 10 veces para un total de 11 pasajes. A medida que avanza el proceso de extrusión, la muestra se convertirá en menos turbia y más fácil de empujar a través de la membrana. Una disminución repentina en la resistencia, sin embargo, por lo general indica una ruptura de la membrana. </li><li> Transferir la solución vesícula extruido y hacer 40 alícuotas de las vesículas en tubos de microcentrífuga.Congelación cada alícuota en cualquier hielo seco o nitrógeno líquido. </li><li> Liofilizar cada alícuota con un evaporador centrífugo durante la noche a 30 ° C. Guarde las vesículas vacías liofilizadas a -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulación de transcripción-traducción Machinery <ol><li> Mezclar los componentes de la reacción de transcripción-traducción y añadir 20 unidades de inhibidor de RNasa. Incubar en hielo. </li><li> Añadir la plantilla de ADN. Para una reacción de control, 250 ng de un plásmido de codificación mVenus o una proteína fluorescente similares detrás de un promotor transcripcional T7 y una fuerte E. Se recomienda sitio de unión a ribosoma coli. </li><li> Llevar el volumen final a 25 l de agua libre de RNasa. </li><li> Hidratar una alícuota de vesículas liofilizadas (del paso 4.6) con 10 l de la reacción montado en el paso 5.3. Vortex brevemente la mezcla hasta que se vuelven a suspender las vesículas. Esto debería tomar menos de 30 segundos. </li><li> Incubar la reacción en hielo durante 30 min para permitir que las vesículas se hinchen. </li><li> Diluir la mezcla de vesículas 20 veces hasta un volumen final de 30 l mediante la adición de 1,5 l de vesículas en 27,0 l de 50 mM de Tris-HCl, 50 mM de NaCl, pH 7,4 y 1,5 l de 20,2 mg / ml de proteinasa K. DNasa y RNasa también se puede añadir en este punto como una alternativa a la proteinasa K para degradar material de extravesicular. </li><li> Incubar durante al menos 2,5 horas a 37 ° C. </li></ol> 6. Microscopía <ol><li> Examine las vesículas y el progreso de la producción de proteínas fluorescentes en diferentes puntos de tiempo. Las vesículas tendrán un diámetro mayor que los 400 nm de tamaño de poro de la membrana utilizada para la extrusión de las vesículas. <ol><li> Preparar una cámara de muestra, colocando una x 5 mm espaciador 20 de silicio sobre un portaobjetos de microscopio estándar. Pipetear 10 l de vesículas en la cámara de muestra. Coloque una hoja de cubierta de vidrio siliconado sobre la cámara. </li><li> Tenga en cuenta las vesículas con un aceite de dispersión 63X or objetivo similar de campo claro y microscopía de fluorescencia utilizando el conjunto de filtro apropiado para la proteína fluorescente explotados. </li></ol></li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Aunque la biología sintética libre de células se encuentra todavía en su infancia, los avances han establecido una base de la cual se pueden realizar sistemas similares a células cada vez más complejas. La reconstitución de la maquinaria de transcripción-traducción de la definición completa de componentes 9 dentro de las vesículas 28 fue particularmente importante para facilitar los esfuerzos posteriores de la construcción artificial sensible ambientalmente cells17, 18. Del mismo modo, los estudios con células artificiales se han utilizado para investigar los procesos evolutivos 4,29,30, los detalles de la mecánica de ARN y la síntesis de proteínas 22,31, las influencias de metabólica load32, 33, y el ensamblaje de las partículas virales 34. Es importante destacar que el conocimiento suficiente ahora existe esa función celular básica se puede reconstituir el interior de vesículas en el laboratorio siguiendo estos informes anteriores y los protocolos descritos en este documento. Además de ser fácil, la encapsulación se describe procedure tiene varios beneficios. Por ejemplo, muchos, alícuotas liofilizadas vesículas vacías se pueden hacer con antelación y se almacenan a -20 ° C para su uso posterior. El protocolo hace moléculas biológicas que no estén sujetos a los disolventes orgánicos, los cambios drásticos de temperatura, o largos períodos de diálisis. Esperamos que la dulzura del procedimiento facilitará la incorporación de componentes adicionales, según sea necesario. Tampoco hemos observado efectos adversos a los cambios de la composición lipídica de la membrana en la encapsulación o la eficiencia de transcripción-traducción. Por lo tanto, los lípidos más susceptibles a la incorporación de proteínas de membrana, morfologías específicas, o visualización concebiblemente podrían ser explotadas. La principal limitación del método descrito es que las vesículas resultantes no son homogéneas en tamaño o lamelaridad. Para muchas aplicaciones, estas dificultades no interfieren con la interpretación de los datos. Sin embargo, si es necesario, los pasos adicionales se pueden incorporar a th estrechadistribución de tamaño de correo y disminuir las capas de membranas, tales como nuevas rondas de extrusión después de la encapsulación, congelación-descongelación, o diálisis 35. Sin duda, los mejores métodos que evitan estos y otros problemas se desarrollarán. Hasta entonces, nos encontramos con el protocolo descrito aquí ser muy adecuado para la construcción de imitadores celulares.

Libre de células, in vitro reacciones de transcripción-traducción y la generación de vesículas de lípidos sintéticos no son nada nuevo. Sin embargo, la combinación de los dos en un celular imitar es significativamente más challenging1-6. E. extractos de células de E. coli con o sin ARN polimerasa de T7 se pueden utilizar como una fuente de maquinaria de transcripción-traducción 7,8. Los extractos celulares se benefician de la presencia de componentes celulares adicionales que pueden facilitar la expresión de la proteína y plegable. Alternativamente, una mezcla de ARN purificados individualmente y moléculas de proteínas, es decir, el sistema PURE 9, se puede utilizar para mediar en la síntesis de proteínas intravesicular 4,10-14. El sistema PURE permite para la construcción de imita celulares totalmente definidos y no sufre de la actividad nucleasa que se encuentra en extractos de células. Prácticamente, esto significa que se requiere mucha menos plantilla de ADN, facilitando así los procesos con baja eficiencia de encapsulación 11 </sup&gt;. Aunque se usa con menos frecuencia, imita celulares pueden ser construidos con extractos de células derivadas de eucariotas cells15. Hasta el momento, cascadas encapsulados codificados genéticamente e imita celulares que detectan el entorno se han reportado 16-18. La forma más sencilla de controlar las reacciones de transcripción-traducción es para medir la fluorescencia o luminiscencia de elementos codificados genéticamente. Típicamente, la luciferasa de luciérnaga 19 o GFP se utilizan, aunque en reacciones in vitro se miden con frecuencia por radiomarcaje. Detección de fluorescencia permite, además, para el seguimiento de las poblaciones de vesículas 20,21 través de métodos basados ​​en citometría, lo que ofrece una idea de la naturaleza estocástica de los procesos biológicos similares. Estos métodos de seguimiento se han utilizado para definir un pequeño conjunto de reglas de diseño y una biblioteca de partes desde la que construir a partir de, incluyendo una colección de proteínas fluorescentes que son compatibles con in in vitro de transcripción-traducción 22, la influencia de la organización genética en la expresión 22, la actividad de los factores sigma 16, y la eficiencia de los terminadores de la transcripción 23. Sin embargo, aún queda mucho que hay que hacer para aumentar la capacidad de construir predecible in vitro, dispositivos codificados genéticamente allí. Hay muchos métodos disponibles para hacer vesículas. Los métodos más comunes dependen de la generación de una película delgada de lípido sobre una superficie de vidrio seguido de resuspensión en solution24 acuosa. Si la solución acuosa contiene maquinaria de transcripción-traducción, por ejemplo, a continuación, una fracción de las vesículas formadas habría contener los componentes necesarios para la producción de proteínas. Sin embargo, la eficiencia de encapsulación de tales métodos es baja, lo que significa que sólo un pequeño porcentaje de vesículas están activos. Muchos de los métodos alternativos caracterizados por mucho más ef encapsulacióniciency explotar la conversión de gotitas de la emulsión agua-en-aceite a las vesículas. Si bien es probable que tales métodos serán comunes en el futuro, en la actualidad estos métodos adolecen de la necesidad de equipo especializado y dan vesículas de membrana con composiciones alteradas 25. Una clara ventaja de agua-en-aceite a los métodos de vesículas es el potencial para controlar lamelaridad membrana. El método descrito en este documento se basa en el protocolo de película delgada de lípido descrito por el laboratorio Yomo 11 con ligeras modificaciones, incluyendo una etapa de homogeneización adicional. Este método es fácil, barato y da vesículas robustos y adecuados para la encapsulación de la maquinaria de transcripción-traducción.

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		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

Como los cambios de interés a partir de moléculas individuales a los sistemas de moléculas, un número cada vez mayor de laboratorios han intentado construir de abajo hacia arriba imita celulares que representan mejor la complejidad de la vida celular. Hasta la fecha, hay una serie de caminos que se pueden tomar para construir imita celulares compartimentados, incluida la explotación de emulsiones de agua en aceite, dispositivos de microfluidos y vesículas. Cada una de las opciones tiene sus ventajas y desventajas específicas. Por ejemplo, emulsiones de agua-en-aceite dan de alta eficiencia de encapsulación, pero no imitan bien la barrera de permeabilidad de las células vivas. La principal ventaja de los métodos descritos en este documento es que todos ellos son fácil y barato de implementar. Maquinaria de transcripción-traducción está encapsulado en el interior de vesículas de fosfolípidos a través de un proceso que explota la instrumentación común, tal como un evaporador centrífugo y un extrusor. Las reacciones se controlan por espectroscopia de fluorescencia. El protocolos puede ser adaptado para la expresión de proteínas recombinantes, la construcción de imitadores celulares, la exploración de los requisitos mínimos para la vida celular, o el montaje de circuitos genéticos.

Microscopía de fluorescencia revela que la fluorescencia sólo se observa en el interior de las vesículas, ya que el material extravesicular se degrada enzimáticamente (Figura 3). Para la expresión de mVenus, intravesicular fluorescencia comienza a ser observado después de 1,5 horas a 37 ° C y llega a la intensidad de la fluorescencia máxima dentro de 6 horas. La temperatura óptima y el tiempo de incubación pueden variar dependiendo de los constructos específicos utilizados. Por ejemplo, diferentes proteínas fluorescentes maduran muy diferente en una manera dependiente de la temperatura. En otras palabras, la observación de la producción de proteínas no depende únicamente de la síntesis de proteínas y el plegamiento, pero también en la formación de cromóforo. En general la síntesis de proteína se puede aumentar mediante la incorporación de proteínas de membrana poros para permitir una afluencia de los componentes agotados necesarios para la transcripción y la traducción 27. Se recomienda llevar a cabo un análogo de transcripción-traducciónción de reacción en ausencia de vesículas para asegurar que la construcción genética explotados es funcional. Esta reacción de control se controla más fácilmente por espectroscopia de fluorescencia en lugar de microscopía. Figura 4 muestra in vitro una reacción de transcripción-traducción de una construcción mVenus codificación. Reacciones no encapsulado dan mucho más altas intensidades de fluorescencia totales que las reacciones intravesiculares similares. Esto es debido a la eficiencia de encapsulación y debido a que el volumen total intravesicular es mucho menor que el volumen extravesicular (es decir, un efecto de dilución). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. El evaporador rotatorio y la bomba de vacío. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . Figura 2. La carcasa y las partes de la extrusora se muestran por separado. De izquierda a derecha, la jeringa, la tuerca de retención, teflón rodamiento, la membrana interna compatible con anillos negros frente a la otra, la caja exterior extrusora y segunda jeringa. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> . Figura 3 imágenes de fluorescencia de la producción de proteínas en liposomas mVenus A y C:.. Imágenes de campo claro de vesículas multilamelares después de 1,5 horas y 2,5 horas, y B y# 160, D: La producción de mVenus es visualizado por fluorescencia (color verde) después de 1,5 y 2,5 h, respectivamente. Barra de escala es de 20 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. En la reacción de control in vitro de no encapsulada en la transcripción y traducción in vitro de mVenus. La intensidad de fluorescencia se midió cada 5 min durante 4 h. Los datos fueron obtenidos con un instrumento de PCR en tiempo real. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas.

La encapsulación de la transcripción en células libres y las máquinas de traducción en vesículas para la Construcción de Imitadores celulares

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K vistas.  University of Trento.  En este documento se describen los métodos simples para la preparación de vesículas, la encapsulación de la transcripción y la maquinaria de traducción, y el seguimiento de la producción de proteínas. Los sistemas libres de células resultantes se pueden utilizar como un punto de partida para construir imita celulares cada vez más complejas. 

Video: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

Un método para la encapsulación de los folículos ováricos y la Cultura en un proteolíticamente degradables tres dimensiones del sistema

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Investigación

Bioingeniería

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

Construcción de Hojas modular de hidrogel para la arquitectura celular 3D a escala macro micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimiendo la transcripción genética redirigiendo la maquinaria celular con modificadores químicos de epigenéticas

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

Flash NanoPrecipitation para la encapsulación de compuestos hidrofóbicos e hidrofílicos en nanopartículas poliméricas

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

Preparación de células sintéticas productoras de proteínas mediante extractos bacterianos libres de células, liposomas y transferencia de emulsión

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Modelado de elementos finitos de un microambiente eléctrico celular

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

Etiquetado de vesículas extracelulares para monitorear la migración y absorción en explantes de cartílago

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

De las células a la síntesis de proteínas libres de células en 24 horas utilizando el flujo de trabajo de autoinducción sin células

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

Un kit de herramientas de transcripción y traducción de Streptomyces de alto rendimiento para aplicaciones de biología sintética y productos naturales

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...