המחברים מודים קרן Armenise-הרווארד, מארי קירי טרנטינו COFUND (ACS), המחוז האוטונומי של טרנטו (Ecomm), וCIBIO למימון.

1. הכנת תבנית ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את הפלסמיד מזן מעבדה סטנדרטי של א &#39; coli, כגון א &#39; coli DH5a או נובה כחולה עם ערכה מסחרית. לחלופין, מוצר ה-PCR ליניארי יכול להיות מטוהר באופן דומה עם ערכה מסחרית. Elute DNA עם O H 2 בלבד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנול, כלורופורם לחלץ את פתרון ה-DNA 26. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קבע את ריכוז ה-DNA ובטהרה, לדוגמה על ידי ספיגת קרינת UV או שיטות מתאימות אחרות. חשוב להשתמש בדנ&quot;א טהור ביותר ליעיל שעתוק-תרגום. </li></ol> 2. הכנת סרט יפידים הדק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוקל אבקת שומנים בדם היבשה ומתמוסס בממס. עבור 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC), פתרונות מניות מוכנים בכלורופורם בריכוז של 40 מ&quot;ג / מ&quot;ל. הערה: ממסים אורגניים חייבים תמיד להיות מטופלים עם pipettes הזכוכית ובקבוקים. במילים אחרות, לא חייב להיות בשימוש פלסטיק. של החנותפתרונות טוק בבקבוקי אוויר חזק, ממס עמיד ענבר זכוכית ב -20 ° C, עדיף תחת ארגון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot μmol POPC 12 (220 μl של פתרון מניות מ&quot;ל 40 מ&quot;ג /) לתוך בקבוק תחתית עגול 5 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאדות הממס עם מאייד סיבובי (איור 1) על מנת ליצור את סרט השומנים בדם הדק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לצרף בקבוק תחתית העגול לצינור הזיקוק עם קליפ מעגלי ולהתחיל את הסיבוב של הבקבוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליזום את זרימת מים דרך סליל המעבה. שימוש באמבט חום הוא לא הכרחי, כי כלורופורם יש נקודת רתיחה נמוכה של 61.2 מעלות צלזיוס בלחץ אטמוספרי רגיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא כי המערכת אינו פתוחה לאטמוספרה על ידי בדיקת שהסתום פתוח. הפעל את משאבת הוואקום ולסגור את הברז כדי להחיל את הוואקום למערכת לאט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרט שומנים דק מופקד על קירות בקבוקון תחתית העגול במהלך אידוי סיבובי ויוצר סרט אטוםכי הוא גלוי על ידי העין. בואו נמשיך לאידוי הסיבובי 0.5-2 שעות. כדי לעצור את התהליך, לאט לאט לשחרר את לחץ הוואקום, להפסיק את הסיבוב, ולהסיר את בקבוק תחתית העגול. </li></ol></li></ol> 3. Resuspension שומנים בדם והשלפוחיות Homogenization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל 18.2 MΩ H 2 O לסרט השומנים הדק ישירות בבקבוק תחתית העגול. במרץ מערבולת הפתרון במהירות המרבית, כ 3,200 סל&quot;ד, עד שסרט השומנים מתנתק מהזכוכית, אשר נצפית על ידי העין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את פיזור השומנים לתוך צינור microcentrifuge 2 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת טבעת עומדת להחזיק homogenizer עם טיפ 5 מ&quot;מ. הנח דוכן microcentrifuge מתחת homogenizer להחזיק היטב את פיזור השומנים בדם. יש לשטוף את אלמנט פיזור של homogenizer ידי טבילה בקצה 18.2 MΩ H 2 O והפעלתו במשך כמה שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את אלמנט פיזור ישירות לפיזור השומנים הבטחת הבקצה לא נוגע בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Homogenize דקות 1 ברמת העצמה 4 או 14,000 סל&quot;ד. </li></ol> 4. חול שלפוחית ​​וlyophilization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את החלקים של אגוז מקדמה כי בתים דו קרום טפלון פנימי תומך, שתי טבעות אטימות, ומסב טפלון אחד מיני מכבש (איור 2), אשר מורכב ממעטפת חיצונית ו. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שתי טבעות האטימות לתוך החריצים של תומך בממברנה הפנימי. מסנני Prewet שני וקרום אחד 400 ננומטר. את המסננים יוצבו נגד הטפלון פנימי של טבעות O-עם הקרום ביניהם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הקרום תומך למעטפת החיצונית מכבש עם הקרום מוקף בשני מסננים בין הטבעות האטימות. הנח את נושא הטפלון בתוך המעטפת ולצרף את האום המייצבת ולהדק ביד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש לשטוף את שני מזרקים ולמלא אחד עם 18.2 MΩ מים. הכנס את מחטי המזרק לתוך שעות קטנותOles בטפלון על כל צד של ההרכבה מכבש. המחטים צריכה להחליק בקלות, אל תכריחו את המחטים. אבטח את מכבש עם המזרקים לתוך דיור מכבש ולהדק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעביר את המים דרך מכבש על ידי דחיפת המים לאט ממזרק אחד לתוך השני. זה מייצג את מעבר אחד. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלושה קטעים להבטיח כי אין נזילות בהווה. הוצא את המזרק במים ולסלק את המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא מזרק אחד עם המדגם, לצרף למכבש, ולהעביר את פתרון השלפוחית ​​לאט דרך הקרום כמתואר לעיל בשלב 4.3. חזור על 10x עבור סכום כולל של 11 קטעים. ככל שמתקדם תהליך שחול, המדגם יהיה פחות עכור ויותר קל לדחוף על פני הקרום. ירידה פתאומית בהתנגדות, לעומת זאת, בדרך כלל מצביעה על פקיעת של הקרום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את פתרון השלפוחית ​​הנמתח ולעשות 40 aliquots μl של שלפוחית ​​לצינורות microcentrifuge.פלאש להקפיא כל aliquot באו קרח יבש או בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lyophilize כל aliquot עם מאייד צנטריפוגלי לילה בשעה 30 ° C. אחסן את שלפוחית ​​ריקה lyophilized ב -20 ° C. </li></ol> 5. Encapsulating מכונות תמלול-תרגום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את המרכיבים של תגובת שעתוק-התרגום ולהוסיף 20 יחידות של מעכב RNase. דגירה על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את תבנית ה-DNA. לתגובת שליטה, 250 ng של mVenus קידוד פלסמיד או חלבון פלואורסצנטי דומה מאחורי אמרגן T7 תעתיק וא חזק אתר מחייב הריבוזום coli מומלץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את הנפח הסופי ל -25 μl עם מים RNase חינם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מימה aliquot של שלפוחית ​​lyophilized (משלב 4.6) עם 10 μl של התגובה התאסף בשלב 5.3. מערבולת בקצרה את התערובת עד שהשלפוחית ​​היא resuspended. זה אמור לקחת פחות מ -30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התגובה על קרח 30 דקות, כדי לאפשר את שלפוחית ​​להתנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את תערובת השלפוחית ​​פי 20 לנפח סופי של 30 על ידי הוספת 1.5 μl μl של שלפוחית ​​ל27.0 μl של 50 מ&quot;מ טריס-HCl, 50 מ&quot;מ NaCl, pH 7.4 ו 1.5 μl של 20.2 מ&quot;ג / מיליליטר proteinase ק DNase וRNase ניתן גם להוסיף בשלב זה כאלטרנטיבה לproteinase K להשפיל חומר extravesicular. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של לפחות 2.5 שעות ב 37 ° C. </li></ol> 6. מיקרוסקופיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון את שלפוחית ​​ואת ההתקדמות של ייצור חלבון פלואורסצנטי בנקודות זמן שונים. שלפוחית ​​תהיה בקוטר גדול יותר מאשר 400 ננומטר נקבובית בגודל של קרום שלפוחית ​​משמש להבלטה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מדגם קאמרי על ידי הצבת spacer מ&quot;מ 20 X 5 סיליקון לשקופית מיקרוסקופ רגיל. פיפטה μl 10 של שלפוחית ​​לתוך תא המדגם. במקום להחליק כיסוי זכוכית siliconized על קאמרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב לשלפוחית ​​עם פיזור שמן o 63Xמטרה דומה על ידי R שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערכת הסינון המתאימה לחלבון פלואורסצנטי ניצלו. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Forster, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+synthesis+of+a+minimal+cell.">Towards synthesis of a minimal cell.</a> Mol. Syst. Biol. 2, 1-10 (2006).</li><li>Noireaux, V., Maeda, Y. T., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+an+artificial+cell,+from+self-organization+to+computation+and+self-reproduction.">Development of an artificial cell, from self-organization to computation and self-reproduction.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 3473-3480 (2011).</li><li>Harris, D. C., Jewett, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+biology:+Exploiting+the+interface+between+synthetic+biology+and+synthetic+chemistry.">Cell-free biology: Exploiting the interface between synthetic biology and synthetic chemistry.</a> Curr. Opin. Biotech. 23, (2012).</li><li>Nishikawa, T., Sunami, T., Matsuura, T., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+Evolution+of+Proteins+through+In+Vitro+Protein+Synthesis+in+Liposomes.">Directed Evolution of Proteins through In Vitro Protein Synthesis in Liposomes.</a> J. Nucleic Acids. 2012, 1-11 (2012).</li><li>Forlin, M., Lentini, R., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+imitations.">Cellular imitations.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 586-592 (2012).</li><li>Chiarabelli, C., Stano, P., Anella, F., Carrara, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Approaches+to+chemical+synthetic+biology.">Approaches to chemical synthetic biology.</a> FEBS Lett. 586, 2138-2145 (2012).</li><li>Noireaux, V., Shin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70.">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> J. Biol. Eng. 4, 1-9 (2010).</li><li>Fujiwara, K., Nomura, S. -. i. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Condensation+of+an+Additive-Free+Cell+Extract+to+Mimic+the+Conditions+of+Live+Cells.">Condensation of an Additive-Free Cell Extract to Mimic the Conditions of Live Cells.</a> PLoS ONE. 8, e54155 (2013).</li><li>Shimizu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components.">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li><li>Hosoda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Study+of+the+Structure+of+Multilamellar+Giant+Liposomes+As+a+Container+of+Protein+Synthesis+Reaction.">Quantitative Study of the Structure of Multilamellar Giant Liposomes As a Container of Protein Synthesis Reaction.</a> Langmuir. 24, 13540-13548 (2008).</li><li>Sunami, T., Matsuura, T., Suzuki, H., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protiens+Within+Liposomes.">Synthesis of Functional Protiens Within Liposomes.</a> Methods Mol. Biol. 607, 243-256 (2010).</li><li>Murtas, G., Kuruma, Y., Bianchini, P., Diaspro, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+synthesis+in+liposomes+with+a+minimal+set+of+enzymes.">Protein synthesis in liposomes with a minimal set of enzymes.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 363, 12-17 (2007).</li><li>Pereira de Souza, T., Stano, P., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Minimal+Size+of+Liposome-Based+Model+Cells+Brings+about+a+Remarkably+Enhanced+Entrapment+and+Protein+Synthesis.">The Minimal Size of Liposome-Based Model Cells Brings about a Remarkably Enhanced Entrapment and Protein Synthesis.</a> ChemBioChem. 10, 1056-1063 (2009).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Programmed+Vesicle+Fusion+Triggers+Gene+Expression.">Programmed Vesicle Fusion Triggers Gene Expression.</a> Langmuir. 27, 13082-13090 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Godefroy, J., Salman, H., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+an+artificial+cell+based+on+gene+expression+in+vesicles.">Toward an artificial cell based on gene expression in vesicles.</a> Phys. Biol. 2, P1-P8 (2005).</li><li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox:+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells.">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> ACS Synth. Biol. 1, 29-41 (2012).</li><li>Kobori, S., Ichihashi, N., Kazuta, Y., Yomo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+controllable+gene+expression+system+in+liposomes+that+includes+a+postive+feedback+loop.">A controllable gene expression system in liposomes that includes a postive feedback loop.</a> Mol. Syst. Biol. 9, 1282-1285 (2013).</li><li>Martini, L., Mansy, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-like+Systems+with+Riboswitch+Controlled+Gene+Expression.">Cell-like Systems with Riboswitch Controlled Gene Expression.</a> Chem. Commun. 47, 10734-10736 (2011).</li><li>Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+cell-free+genetic+circuit+assembly.">Principles of cell-free genetic circuit assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12672-12677 (2003).</li><li>Sunami, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Association+and+Fusion+of+Giant+Vesicles+Using+a+Fluorescence-Activated+Cell+Sorter.">Detection of Association and Fusion of Giant Vesicles Using a Fluorescence-Activated Cell Sorter.</a> Langmuir. 26, 15098-15103 (2010).</li><li>Saito, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-Resolved+Tracking+of+a+Minimum+Gene+Expression+System+Reconstituted+in+Giant+Liposomes.">Time-Resolved Tracking of a Minimum Gene Expression System Reconstituted in Giant Liposomes.</a> ChemBioChem. 10, 1640-1643 (2009).</li><li>Lentini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+Proteins+and+in+Vitro+Genetic+Organization+for+Cell-Free+Synthetic+Biology.">Fluorescent Proteins and in Vitro Genetic Organization for Cell-Free Synthetic Biology.</a> ACS Synth. Biol. , (2013).</li><li>Du, L., Villarreal, S., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multigene+Expression+In+Vivo:+Supremacy+of+Large+Versus+Small+Terminators+for+T7+RNA+Polymerase.">Multigene Expression In Vivo: Supremacy of Large Versus Small Terminators for T7 RNA Polymerase.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1043-1050 (2011).</li><li>Trochilin, V. P., Weissig, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Liposomes: A Practical Approach. , (2003).</li><li>Walde, P., Cosentino, K., Engel, H., Stano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Giant+vesicles:+preparations+and+applications.">Giant vesicles: preparations and applications.</a> ChemBioChem. 11, 848-865 (2010).</li><li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Cloning. , (2001).</li><li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly.">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 17669-17674 (2004).</li><li>Yu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+Functional+Protein+in+Liposome.">Synthesis of Functional Protein in Liposome.</a> J. Biosci. Bioeng. 92, 590-593 (2001).</li><li>Caschera, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stable+vesicles+composed+of+monocarboxylic+or+dicarboxylic+fatty+acids+and+trimethylammonium+amphiphiles.">Stable vesicles composed of monocarboxylic or dicarboxylic fatty acids and trimethylammonium amphiphiles.</a> Langmuir. 27, 14078-14090 (2011).</li><li>Pereira de Souza, T., Steiniger, F., Stano, P., Fahr, A., Luisi, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+crowding+of+ribosomes+and+proteins+inside+vesicles:+a+possible+mechanism+for+the+origin+of+cell+metabolism.">Spontaneous crowding of ribosomes and proteins inside vesicles: a possible mechanism for the origin of cell metabolism.</a> ChemBioChem. 12, 2325-2330 (2011).</li><li>Niederholtmeyer, H., Xu, L., Maerkl, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-Time+mRNA+Measurement+during+an+in+Vitro+Transcription+and+Translation+Reaction+Using+Binary+Probes.">Real-Time mRNA Measurement during an in Vitro Transcription and Translation Reaction Using Binary Probes.</a> ACS Synth. Biol. 10, (2012).</li><li>St&#246;gbauer, T., Windhager, L., Zimmer, R., R&#228;dler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiment+and+mathematical+modeling+of+gene+expression+dynamics+in+a+cell-free+system.">Experiment and mathematical modeling of gene expression dynamics in a cell-free system.</a> Integr. Biol. 4, 494-501 (2012).</li><li>Lazzerini-Ospri, L., Stano, P., Luisi, P., Marangoni, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+emergent+properties+of+a+synthetic+quasi-cellular+system.">Characterization of the emergent properties of a synthetic quasi-cellular system.</a> BMC Bioinformatics. 13, 1-10 (2011).</li><li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+Replication,+Synthesis,+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction.">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> ACS Synth. Biol. 1, 408-413 (2012).</li><li>Zhu, T. F., Szostak, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Large+Monodisperse+Vesicles.">Preparation of Large Monodisperse Vesicles.</a> PLoS ONE. 4, 1-4 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

למרות שביולוגיה סינטטי ללא תא היא עדיין בחיתוליו, התקדמות הניחה בסיס שממנו ניתן לבצע מערכות כמו תאים מורכבות יותר ויותר. הכינון מחדש של מכונות שעתוק-תרגום מוגדר באופן מלא בתוך 9 רכיבים של שלפוחית ​​28 היה משמעותי במיוחד בקידום מאמצים מאוחרים יותר בבנייה מלאכותית מגיב לסביבה cells17, 18. כמו כן, נעשו שימוש במחקרים בתאים מלאכותיים כדי לחקור תהליכים אבולוציוניים 4,29,30, הפרטים מכניסטית של RNA והסינתזה של חלבוני 22,31, את ההשפעות של load32 חילוף חומרים, בת 33, ואת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים 34. חשוב מכך, קיים כיום מספיק ידע שהתפקוד הבסיסי של התא ניתן מחדש פנימי של שלפוחית ​​במעבדה בעקבות דוחות קודמים אלו ואת הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה. בנוסף להיותו קל, אנקפסולציה תאר יחסי הציבוריש ocedure מספר יתרונות. לדוגמה, רבים aliquots שלפוחית ​​ריק, lyophilized יכול להתבצע מראש ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הפרוטוקול עושה מולקולות ביולוגיות אינו כפופות לממסים אורגניים, שינויי טמפרטורה קיצוניות, או תקופות ארוכות של דיאליזה. אנו מצפים כי עדינותו של הנוהל תאפשר שילוב של רכיבים נוספים לפי צורך. יש לנו גם לא נצפו תופעות לוואי לשינוי בהרכב השומנים של הקרום על אנקפסולציה או יעילות שעתוק-תרגום. לכן, שומנים נוחים יותר לשילוב של חלבונים בממברנה, מורפולוגיות ספציפיות, או להדמיה יכולים להעלות על הדעת ניתן לנצל. המגבלה העיקרית של השיטה היא שתארה את שלפוחית ​​כתוצאה מכך הם אינם הומוגני בגודל או lamellarity. עבור יישומים רבים, הקשיים אלה לא מפריעים לפרשנות של נתונים. עם זאת, במידת הצורך, ניתן לשלב בצעדים נוספים ל הצרההתפלגות גודל הדואר ולהקטין את השכבות של ממברנות, כגון סבב נוסף של חול לאחר אנקפסולציה, הקפאת הפשרה, או דיאליזה 35. אין ספק ששיטות טובות יותר לעקוף בעיות אלה ואחרות תפותח. עד אז, אנו מוצאים את הפרוטוקול מתואר כאן כדי להיות מתאים גם לבניית מחקה סלולרי.

ללא תא, במבחנה תגובות שעתוק-תרגום והדור של שלפוחית ​​משומנים סינטטיים אינם דבר חדש. עם זאת, שילוב של שתיים לתוך הסלולר לחקות הוא באופן משמעותי יותר challenging1-6. א תמציות סלולריים coli עם או בלי RNA פולימראז T7 יכולות לשמש כמקור של מכונות שעתוק-תרגום 7,8. תמציות סלולריים נהנות מהנוכחות של רכיבים סלולריים נוספים שיכול להקל ביטוי חלבון ומתקפל. לחלופין, שילוב של RNA בנפרד מטוהר ומולקולות חלבון, כלומר את מערכת PURE 9, יכול לשמש כדי לתווך סינתזת חלבון intravesicular 4,10-14. מערכת PURE מאפשרת לבניית מחקה סלולרי שהוגדר באופן מלא ואינו סובלת מפעילות nuclease מצאה בתמציות סלולריים. מבחינה מעשית, זה אומר שנדרש הרבה פחות תבנית ה-DNA, ובכך להקל על תהליכים עם יעילות נמוכה אנקפסולציה 11 </sup&gt;. למרות ששימוש בתדירות נמוך יותר, ניתן לבנות מחקה סלולרי עם תמציות תאים שמקורם מcells15 אוקריוטים. עד כה, דווחו מפלים כמוס מקודדים גנטי ומחק סלולריים שלחוש את סביבת 16-18. הדרך הפשוטה כדי לעקוב אחר תגובות שעתוק-תרגום היא למדוד את הקרינה או הארה של אלמנטים גנטי מקודדים. בדרך כלל, גחלילית לוציפראז 19 או GFP משמשים, אם כי במבחנה תגובות נמדדות לעתים קרובות על ידי radiolabeling. גילוי הקרינה בנוסף הוא מאפשר ניטור של אוכלוסיות של שלפוחית ​​20,21 באמצעות שיטות מבוססות cytometry, ובכך מציע כמה תובנות לגבי האופי האקראי של תהליכים דמויי ביולוגיים. שיטות ניטור אלה כבר משמשים להגדרת קבוצה קטנה של כללי עיצוב וספרייה של חלקים ממנו ניתן לבנות, כולל אוסף של חלבוני ניאון התואמים אותיn מבחנת שעתוק-תרגום 22, בהשפעת הארגון על ביטוי גנטי 22, הפעילות של גורמי סיגמא 16, ואת היעילות של Terminators תעתיק 23. עם זאת, יש עדיין הרבה דברים שצריך לעשות כדי להגדיל את היכולת של הבנייה צפויה במבחנה, מכשירים מקודדים גנטי. ישנן שיטות רבות זמינות כדי להפוך שלפוחית. השיטות הנפוצות ביותר תלויות בדור של שומנים בדם סרט דק על משטח זכוכית ואחריו resuspension בsolution24 המימית. אם התמיסה המימית מכילה מכונות שעתוק-תרגום, למשל, אז חלק של שלפוחית ​​שנוצר היה להכיל את כל מרכיבים הדרושים לייצור חלבון. עם זאת, את היעילות של אנקפסולציה שיטות כאלה היא נמוכה, כלומר, רק אחוז קטן של שלפוחית ​​הם פעיל. רבים מהשיטות החלופיות מאופיינים EFF אנקפסולציה הרבה יותר גבוהiciency לנצל את ההמרה של טיפות מים בתחליב שמן לשלפוחית. אמנם סביר להניח כי שיטות כאלה תהיה דבר שבשגרה בעתיד, כיום שיטות אלה סובלים מהצורך של ציוד מיוחד ולתת לי שלפוחית ​​עם קרום קומפוזיציות שהשתנו 25. יתרון בולט מים בתוך שמן של שיטות לשלפוחית ​​הוא הפוטנציאל לשלוט lamellarity הממברנה. השיטה המתוארת במסמך זה מבוססת על פרוטוקול סרט שומנים בדם הדק שתואר על ידי Yomo 11 המעבדה עם שינויים קלים ביניהם צעד homogenization נוסף. שיטה זו היא קלה, זולה, ונותנת שלפוחית ​​חזקה גם מתאימה לאנקפסולציה של מכונות שעתוק-תרגום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="745">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Quick Spin Mini-prep kit</td>
			<td style="width:243px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">27104</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:243px;">NanoDrop 1000</td>
			<td style="width:119px;">NDB767ND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">770557</td>
			<td style="width:167px;">MW 760 g/mol 
			Transition Temp -2 &#176;C 
			CAS# 26853-31-6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Ethanol</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">459836</td>
			<td>Anhydrous, &#62;99.5%</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P3803-100mL</td>
			<td>Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Chloroform</td>
			<td>Biotech Grade Fluka</td>
			<td style="width:119px;">496189-1L</td>
			<td>Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Brown amber glass bottles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89043-518</td>
			<td>55X 48 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi Rotovapor R-210/Sigma</td>
			<td>Z563846EU-1EA</td>
			<td>With jack and water bath, 29/32 joint 240 V</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Analog vortex mixer</td>
			<td style="width:243px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">945300</td>
			<td>Speed 1,000-3,200 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Homogenizer</td>
			<td>IKA T10 Basic Ultra-Turbax</td>
			<td style="width:119px;">3420000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-extruder</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">610020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Extruder filters</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">610014</td>
			<td>drain disc 10 mm&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Extruder polycarbonate membrane 400 nm</td>
			<td>Whatman</td>
			<td style="width:119px;">61007</td>
			<td>nuclepore polycarbonate&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Speed vacuum</td>
			<td>Labconco</td>
			<td style="width:119px;">7970011</td>
			<td>Centritrap DNA concentrator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PURExpress kit</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">NRM #E6800S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNAse inhibitor (40,000 U/ml)</td>
			<td style="width:243px;">New England Biolabs</td>
			<td style="width:119px;">#M0307S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Proteinase K (20.2 mg/ml)</td>
			<td style="width:243px;">Fermentas</td>
			<td style="width:119px;">#EO0491</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:243px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microscope</td>
			<td height="42" style="height:42px;width:243px;">Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RealTime</td>
			<td style="width:243px;">CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad)</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Silicon press to seal&#160;&#160;-Molecular Probe</td>
			<td style="width:243px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">P18174</td>
			<td>Resistant from&#160; -25-30 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Siliconized glass circle cover slides</td>
			<td style="width:243px;">Hampton Research</td>
			<td style="width:119px;">HR3-231</td>
			<td>&#160;&#160; Diameter= 22 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ImageJ</td>
			<td style="width:243px;">NIH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

the encapsulation of cell-free transcription and translation machinery in vesicles for the construction of cellular mimics

כמשמרות ריבית ממולקולות בודדות למערכות של מולקולות, מספר גדל והולך של מעבדות ביקשו לבנות מלמטה למעלה מחקה סלולרי שמייצגים טובים יותר את המורכבות של חיים תאיים. נכון להיום יש מספר המסלולים שניתן לנקוט כדי לבנות מחקה סלולרי ממודר, כולל ניצול של תחליבים מים בשמן, התקני microfluidic, ושלפוחית. כל אחת מהאפשרויות הזמינות יש יתרונות וחסרונות מסוימים. לדוגמה, תחליבים מים בשמן לתת יעילות גבוהה אנקפסולציה אבל לא לחקות היטב את מחסום החדירות של תאי חיים. היתרון העיקרי של השיטות שתוארו במסמך זה הוא שהם כולם קלים וזולים ליישום. מכונות תמלול-תרגום היא כמוסות פנימית של שלפוחית ​​פוספוליפידים באמצעות תהליך המנצל את המכשור משותף, כגון מאייד הצנטריפוגלי ומכבש. תגובות מנוטרות על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה. הפרוטוקולים יכול להיות מותאם לביטוי חלבון רקומביננטי, הבנייה מחקה סלולרי, החקירה של דרישות המינימום לחיים הסלולר, או ההרכבה של מעגלים גנטיים.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הקרינה שנצפתה רק החלק פנימי של שלפוחית, כי החומר הוא extravesicular enzymatically מושפל (איור 3). לביטוי של mVenus, intravesicular הקרינה מתחילה להיות שנצפתה לאחר 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס ומגיעה לעוצמת הקרינה המרבית בתוך 6 שעות. הטמפרטורה האופטימלית וזמן דגירה יכולות להשתנות בהתאם למבנים הספציפיים בשימוש. לדוגמה, חלבוני ניאון שונים להבשיל באופן שונה לגמרי באופן תלוי בטמפרטורה. במילים אחרות, ההתבוננות של ייצור חלבון היא לא תלויה אך ורק על סינתזה של חלבונים וקיפול, אלא גם על היווצרות chromophore. סינתזה של חלבון באופן כללי יכולה להיות מוגברת על ידי שילוב של חלבון קרום נקבוביות כדי לאפשר לזרם של רכיבים מדולדלים הדרושים לשעתוק ותרגום 27. מומלץ לבצע שעתוק-תרגומים מקבילים<html> תגובת tion בהעדר שלפוחית ​​כדי להבטיח שהמבנה הגנטי ניצלו הוא פונקציונלי. תגובת שליטה זו היא פיקוח בקלות רבה יותר על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה ולא מיקרוסקופית. איור 4 מראה בתגובת שעתוק-תרגום חוץ גופית של mVenus קידוד לבנות. תגובות unencapsulated לתת הרבה יותר גבוה עוצמות הקרינה הכולל יותר מאשר תגובות intravesicular דומות. זאת בשל יעילות אנקפסולציה וכי סך נפח intravesicular הוא הרבה פחות מאשר נפח extravesicular (כלומר אפקט דילול). <img alt="איור 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig1.jpg" width="600px" /> איור 1. המאייד הסיבובי ומשאבת ואקום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig1highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> עבור: לשמור-together.within עמודים = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig2.jpg" width="600px" /> איור 2. הדיור ובחלקים מהמכבש מוצגים בנפרד. משמאל לימין, מזרק, אגוז שכר טרחה, ועליו טפלון, הקרום פנימי תומך עם טבעות אטימות שחורות פונות אחד לשני, מעטפת חיצונית מכבש, ומזרק שני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig2highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig3.jpg" width="600px" /> איור 3. תמונות הקרינה של ייצור חלבון בmVenus יפוזומים וC:.. תמונות שדה בהירות של שלפוחית ​​multilamellar לאחר 1.5 שעות ו -2.5 שעות B ו &amp;# 160; D: הייצור של mVenus הוא דמיינו ידי (בצבע הירוק), לאחר 1.5 ו -2.5 שעות, בהתאמה פלואורסצנטי. בר סולם הוא 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig3highres.jpg" target="_blank">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51304/51304fig4.jpg" width="600px" /> איור 4. בתגובה שליטה במבחנה של nonencapsulated בשעתוק במבחנה ותרגום של mVenus. עוצמת הקרינה שנמדדה בכל 5 דקות במשך 4 שעות. הנתונים נרכשו עם מכשיר Real-Time PCR. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51304/51304fig4highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a>

Watch this Scientific Journal Video about The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics at JoVE.com

The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

As interest shifts from individual molecules to systems of molecules, an increasing number of laboratories have sought to build from the bottom up ...

the-encapsulation-cell-free-transcription-translation-machinery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.9K Views.  University of Trento.  בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר. 

Video: The Encapsulation of Cell-free Transcription and Translation Machinery in Vesicles for the Construction of Cellular Mimics

A Method for Ovarian Follicle Encapsulation and Culture in a Proteolytically Degradable 3 Dimensional System

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro follicle techniques provide a tool to model follicle development in order to investigate basic biology, and are further being developed as a technique to preserve fertility in the clinic1-4. Our in vitro culture system employs hydrogels in order to mimic the native ovarian environment by maintaining the 3D follicular architecture, cell-cell interactions and paracrine signaling that direct follicle development 5. Previously, follicles were successfully cultured in alginate, an inert algae-derived polysaccharide that undergoes gelation with calcium ions6-8. Alginate hydrogels formed at a concentration of 0.25% w/v were the most permissive for follicle culture, and retained the highest developmental competence 9. Alginate hydrogels are not degradable, thus an increase in the follicle diameter results in a compressive force on the follicle that can impact follicle growth10. We subsequently developed a culture system based on a fibrin-alginate interpenetrating network (FA-IPN), in which a mixture of fibrin and alginate are gelled simultaneously. This combination provides a dynamic mechanical environment because both components contribute to matrix rigidity initially; however, proteases secreted by the growing follicle degrade fibrin in the matrix leaving only alginate to provide support. With the IPN, the alginate content can be reduced below 0.25%, which is not possible with alginate alone 5. Thus, as the follicle expands, it will experience a reduced compressive force due to the reduced solids content. Herein, we describe an encapsulation method and an in vitro culture system for ovarian follicles within a FA-IPN. The dynamic mechanical environment mimics the natural ovarian environment in which small follicles reside in a rigid cortex and move to a more permissive medulla as they increase in size11. The degradable component may be particularly critical for clinical translation in order to support the greater than 106-fold increase in volume that human follicles normally undergo in vivo .

A new method for ovarian follicle encapsulation in a 3D fibrin-alginate interpenetrating network is described. This system combines structural support with proteolytic degradation to support the development of immature follicles to produce mature oocytes. This method may be applied to culture cell aggregates to maintain cell-cell contacts without limiting expansion.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

The ovarian follicle is the functional unit of the ovary that secretes sex hormones and supports oocyte maturation. In vitro  follicle techniques provide ...

Construction of Modular Hydrogel Sheets for Micropatterned Macro-scaled 3D Cellular Architecture

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue geometry. The resulting 3D hydrogel-based cellular constructs have been introduced as an alternative to animal experiments for advanced biological studies, pharmacological assays and organ transplant applications. Although hydrogel-based particles and fibers can be easily fabricated, it is difficult to manipulate them for tissue reconstruction. In this video, we describe a fabrication method for micropatterned alginate hydrogel sheets, together with their assembly to form a macro-scale 3D cell culture system with a controlled cellular microenvironment. Using a mist form of the calcium gelling agent, thin hydrogel sheets are easily generated with a thickness in the range of 100 - 200 &#181;m, and with precise micropatterns. Cells can then be cultured with the geometric guidance of the hydrogel sheets in freestanding conditions. Furthermore, the hydrogel sheets can be readily manipulated using a micropipette with an end-cut tip, and can be assembled into multi-layered structures by stacking them using a patterned polydimethylsiloxane (PDMS) frame. These modular hydrogel sheets, which can be fabricated using a facile process, have potential applications of in vitro drug assays and biological studies, including functional studies of micro- and macrostructure and tissue reconstruction.

We describe the fabrication of micropatterned hydrogel sheets using a simple process, which can be assembled and manipulated in a freestanding form. Using these modular hydrogel sheets, a simple macro-scaled 3D cell culture system can be generated with a controlled cellular microenvironment.

בנייה של גיליונות מודולרי Hydrogel לאדריכלות סלולרית 3D המוקטן מאקרו micropatterned

Hydrogels can be patterned at the micro-scale using microfluidic or micropatterning technologies to provide an in vivo-like three-dimensional (3D) tissue ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

הדחקת שעתוק גנים על ידי ניתוב מחדש מכונות הסלולר עם המגבילים Epigenetic כימי

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Flash NanoPrecipitation for the Encapsulation of Hydrophobic and Hydrophilic Compounds in Polymeric Nanoparticles

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can improve bioavailability and modify drug distribution within the body. For hydrophilic drugs like peptides or proteins, encapsulation within NPs can also provide protection from natural clearance mechanisms. There are few techniques for the production of polymeric NPs that are scalable. Flash NanoPrecipitation (FNP) is a process that uses engineered mixing geometries to produce NPs with narrow size distributions and tunable sizes between 30 and 400 nm. This protocol provides instructions on the laboratory-scale production of core-shell polymeric nanoparticles of a target size using FNP. The protocol can be implemented to encapsulate either hydrophilic or hydrophobic compounds with only minor modifications. The technique can be readily employed in the laboratory at milligram scale to screen formulations. Lead hits can directly be scaled up to gram- and kilogram-scale. As a continuous process, scale-up involves longer mixing process run time rather than translation to new process vessels. NPs produced by FNP are highly loaded with therapeutic, feature a dense stabilizing polymer brush, and have a size reproducibility of &#177; 6%.

Flash NanoPrecipitation (FNP) is a scalable approach to produce polymeric core-shell nanoparticles. Lab-scale formulations for the encapsulation of hydrophobic or hydrophilic therapeutics are described.

פלאש NanoPrecipitation בשביל העטיפה של תרכובות הידרופוביות, הידרופילית חלקיקים פולימרים

The formulation of a therapeutic compound into nanoparticles (NPs) can impart unique properties. For poorly water-soluble drugs, NP formulations can ...

Preparing Protein Producing Synthetic Cells using Cell Free Bacterial Extracts, Liposomes and Emulsion Transfer

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell mimicking environment. Furthermore, the development of cell-free expression systems has demonstrated the ability to reconstitute the protein production, transcription and translation processes (DNA&#8594;RNA&#8594;protein) in a controlled manner, harnessing synthetic biology. Here we describe a protocol for preparing a cell-free expression system, including the production of a potent bacterial lysate and encapsulating this lysate inside cholesterol-rich lipid-based giant unilamellar vesicles (GUVs) (i.e., stable liposomes), to form synthetic cells. The protocol describes the methods for preparing the components of the synthetic cells including the production of active bacterial lysates, followed by a detailed step-by-step preparation of the synthetic cells based on a water-in-oil emulsion transfer method. These facilitate the production of millions of synthetic cells in a simple and affordable manner with a high versatility for producing different types of proteins. The obtained synthetic cells can be used to investigate protein/RNA production and activity in an isolated environment, in directed evolution, and also as a controlled drug delivery platform for on-demand production of therapeutic proteins inside the body.

This protocol describes the method, materials, equipment and steps for bottom-up preparation of RNA and protein producing synthetic cells. The inner aqueous compartment of the synthetic cells contained the S30 bacterial lysate encapsulated within a lipid bilayer (i.e., stable liposomes), using a water-in-oil emulsion transfer method.

הכנת חלבון הפקת תאים סינתטיים באמצעות שולפת תא חינם בקטריאלי, ליפוזומים והעברת אמולסיה

The bottom-up assembly approach for construction of synthetic cells is an effective tool for isolating and investigating cellular processes in a cell ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

מידול אלמנט סופי של מיקרו-סביבה חשמלית תאית

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Labeling of Extracellular Vesicles for Monitoring Migration and Uptake in Cartilage Explants

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their cellular source, such as platelet lysate (PL). When used as treatment, EVs are expected to enter the target cells and effect a response from these. In this research, PL-derived EVs have been studied as a cell-free treatment for osteoarthritis (OA). Thus, a method was set up to label EVs and test their uptake on cartilage explants. PL-derived EVs are labeled with the lipophilic dye PKH26, washed twice through a column, and then tested in an in vitro inflammation-driven&#160;OA model for 5 h after particle quantification by nanoparticle tracking analysis (NTA). Hourly, cartilage explants are fixed, paraffined, cut into 6 &#181;m sections to mount on slides, and observed under a confocal microscope. This allows verification of whether EVs enter the target cells (chondrocytes) during this period and analyze their direct effect.

Here, we present a protocol to label platelet lysate-derived extracellular vesicles to monitor their migration and uptake in cartilage explants used as a model for osteoarthritis.

תיוג של שלל חוץ-תאי לניטור הגירה וספיגה של סחוס

Extracellular vesicles (EVs) are used in different studies to prove their potential as a cell-free treatment due to their cargo derived from their ...

From Cells to Cell-Free Protein Synthesis within 24 Hours Using Cell-Free Autoinduction Workflow

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous developments have made the CFPS platform more accessible to new users and have expanded the range of applications. For lysate based CFPS systems, cell extracts can be generated from a variety of organisms, harnessing the unique biochemistry of that host to augment protein synthesis. Within the last 20 years, Escherichia coli (E. coli) has become one of the most widely used organisms for supporting CFPS due to its affordability and versatility. Despite numerous key advances, the workflow for E. coli cell extract preparation has remained a key bottleneck for new users to implement CFPS for their applications. The extract preparation workflow is time-intensive and requires technical expertise to achieve reproducible results. To overcome these barriers, we previously reported the development of a 24 hour cell-free autoinduction (CFAI) workflow that reduces user input and technical expertise required. The CFAI workflow minimizes the labor and technical skill required to generate cell extracts while also increasing the total quantities of cell extracts obtained. Here we describe that workflow in a step-by-step manner to improve access and support the broad implementation of E. coli based CFPS.

This work describes the preparation of cell extract from Escherichia coli (E. coli) followed by cell-free protein synthesis (CFPS) reactions in under 24 hours. Explanation of the cell-free autoinduction (CFAI) protocol details improvements made to reduce researcher oversight and increase quantities of cell extract obtained.

מתאים לסינתזת חלבונים ללא תאים תוך 24 שעות באמצעות זרימת עבודה של אינדוקציה אוטומטית ללא תאים

Cell-free protein synthesis (CFPS) has grown as a biotechnology platform that captures transcription and translation machinery in vitro. Numerous ...

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a natural producer of chloramphenicol, jadomycin, and pikromycin, which makes it an attractive candidate&#160;as a next-generation synthetic biology chassis. Therefore, genetic tools that accelerate the development of S. venezuelae ATCC 10712, as well as other Streptomyces spp. models, are highly desirable for natural product engineering and discovery. To this end, a dedicated S. venezuelae ATCC 10712 cell-free system is provided in this protocol to enable high-yield heterologous expression of high G+C (%) genes. This protocol is suitable for small-scale (10-100 &#956;L) batch reactions in either 96-well or 384-well plate format, while reactions are potentially scalable. The cell-free system is robust and can achieve high yields (~5-10 &#956;M) for a range of recombinant proteins in a minimal setup. This work also incorporates a broad plasmid toolset for real-time measurement of mRNA and protein synthesis, as well as in-gel fluorescence staining of tagged proteins. This protocol can also be integrated with high-throughput&#160;gene expression characterization workflows or the study of enzyme pathways from high G+C (%) genes present in Actinomycetes genomes.

A High-Yield Streptomyces Transcription-Translation Toolkit for Synthetic Biology and Natural Product Applications

This protocol details an enhanced method for synthesizing high yields of recombinant proteins from a Streptomyces venezuelae cell-free transcription-translation (TX-TL) system.

ערכת כלים לתרגום תמלול סטרפטומיצ'ס בתפוקה גבוהה לביולוגיה סינתטית ויישומי מוצרים טבעיים

Streptomyces spp. are a major source of clinical antibiotics and industrial chemicals. Streptomyces venezuelae ATCC 10712 is a fast-growing strain and a ...

Rapid Encapsulation of Reconstituted Cytoskeleton Inside Giant Unilamellar Vesicles

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular processes in vitro. In recent years, encapsulation within GUVs has proven to be a helpful approach for reconstitution experiments in cell biology and related fields. It better mimics confinement conditions inside living cells, as opposed to conventional biochemical reconstitution. Methods for encapsulation inside GUVs are often not easy to implement, and success rates can differ significantly from lab to lab. One technique that has proven to be successful for encapsulating more complex protein systems is called continuous droplet interface crossing encapsulation (cDICE). Here, a cDICE-based method is presented for rapidly encapsulating cytoskeletal proteins in GUVs with high encapsulation efficiency. In this method, first, lipid-monolayer droplets are generated by emulsifying a protein solution of interest in a lipid/oil mixture. After being added into a rotating 3D-printed chamber, these lipid-monolayered droplets then pass through a second lipid monolayer at a water/oil interface inside the chamber to form GUVs that contain the protein system. This method simplifies the overall procedure of encapsulation within GUVs and speeds up the process, and thus allows us to confine and observe the dynamic evolution of network assembly inside lipid bilayer vesicles. This platform is handy for studying the mechanics of cytoskeleton-membrane interactions in confinement.

This article introduces a simple method for expeditious production of giant unilamellar vesicles with encapsulated cytoskeletal proteins. The method proves to be useful for bottom-up reconstitution of cytoskeletal structures in confinement and cytoskeleton-membrane interactions.

אנקפסולציה מהירה של שלד ציטוסקי משוחזר בתוך בועיות יונילאמלריות ענקיות

Giant unilamellar vesicles (GUVs) are frequently used as models of biological membranes and thus are a great tool to study membrane-related cellular ...

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית לבניית מחקה סלולרי