نحن نعترف مساهمة في تصور سانو ريناتا البروتوكول الأولي. Ad&#39;A. يحمل جواهرجية للأطفال (JFC) هبوا الرئيس في علم الوراثة والعلاج الجيني. وقد تم تمويل هذا العمل في جزء من المعاهد الوطنية للصحة منح GM60905، وDK52025 CA021764، والجمعيات الخيرية اللبنانية السورية الأمريكية المرتبطين بها (ALSAC).

<html> ويهدف البروتوكول التالي لعزل وتنقية والأحجار الكريمة MAMs من مخ الفأر الحلول المطلوبة لعزل MAMs، الميتوكوندريا والأحجار الكريمة تجزئة للحصول على إعداد الميتوكوندريا الخام: الحل: 0.32 M السكروز، 1 ملم NaHCO 3، 1 ملم MgCl 2، 0.5 مم CaCl 2 + مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة) الحل B: 0.32 M السكروز، 1 ملم 3 + NaHCO مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة) MAMs العزل: متوسطة العزلة: 250 ملم المانيتول، 5 ملي درجة الحموضة HEPES 7.4، 0.5 مم EGTA، 0.1٪ BSA التدرج العازلة: 225 المانيتول مم، 25 مم درجة الحموضة HEPES 7.5، 1 ملم EGTA، 0.1٪ BSA (تركيز النهائي) الأحجار الكريمة العزل: محتوى &quot;استخراج GEM&gt; الاحتياطي: 25 مم HEPES 7.5 درجة الحموضة، 0.15 M كلوريد الصوديوم، 1٪ تريتون X-100 + مثبطات الأنزيم البروتيني (إضافة جديدة، حسب الحاجة) الاحتياطي GEM Solubilising: 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 8.8، 5 ملم EDTA، 1٪ SDS + مثبطات البروتيز (إضافة جديدة، حسب الحاجة). 1. أول خطوة تجزئة التحت خلوية: إزالة النواة، خلايا Unlysed والحطام الخلوية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء الماوس في الدائرة 2 CO. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على الفور إزالة الدماغ، النصف، ضع في أنابيب 2 مل على الجليد والوزن. </li></ol> ملاحظة: حافظ على نصفين الدماغ منفصلة في جميع أنحاء الإجراء بأكمله. ما يلي ينطبق على معاملة نصف الدماغ واحد. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان النصف في الدماغ ما قبل المبردة الزجاج 2 مل طاحونة الأنسجة Dounce يحتوي على 1 مل A. الحل الباردة التجانس مع 15 السكتات الدماغية الإجمالية لإزالة مدقة كبيرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب 15 مل الصقر، على الجليد، وتمييعالخليط يصل إلى 10 مجلدا ث / ت، على سبيل المثال G 0،225 إلى 2.25 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 1400 XG عينة لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف ونقل إلى 30 مل ذهابا وأسفل الزجاج أنبوب الطرد المركزي، على الجليد. تأكد من عدم تعكير صفو بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في مجلدات 10 من نفس الحل. التجانس في طاحونة نفسه، مع 3-6 من السكتات الدماغية إزالة مدقة صغيرة، 1 مل في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل إلى أنبوب جديد 15 مل فالكون وأجهزة الطرد المركزي في 710 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. وهذا يؤدي إلى بيليه نواة الخلية والحطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف مع حمام وطاف بحفظه في الخطوة 1.6. </li></ol> 2. الخطوة الثانية: عزل الميتوكوندريا الخام <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 13800 XG supernatants لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف إلى أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، على الجليد </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه في الحل حجم 10 A. التجانس في طاحونة نفسه، مع 3-6 من السكتات الدماغية إزالة مدقة صغيرة، 1 مل في كل مرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي كخطوة 2.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 2،2-2،4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه هو جزء مما أثرى الميتوكوندريا. بركة supernatants (العصارة الخلوية وER)، مع تغطية parafilm والحفاظ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق بيليه مع 6 ضربات لإزالة مدقة صغيرة، في 4.8 مل / ز (ز يشار إلى الوزن الأصلي الدماغ) من B الحل، في homogeniser الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصات باستور باستخدام الزجاج، وإعداد التدرج السكروز متقطع في أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، مضيفا في وقت لاحق إلى أسفل الأنبوب على النحو التالي، بعناية، وضمان تتشكل الفقاعات لا: Resupended بيليه (0.32 M السكروز) 3 مل السكروز ملي 850 (ملم في NaHCO 1 3) 3 مل السكروز M 1 (في ملي NaHCO 1 3) 3 مل السكروز M 1.2 (في NaHCO مم 13) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 82500 XG لمدة 2 ساعة في C. ° 4 وفصل الناتجة في نهاية التدرج إنتاج ثلاثة نطاقات وبيليه ج: 1) المايلين والملوثات الأخرى غشاء (0.32 M - 0.85 M واجهة)، 2) ER، جولجي، الأغشية البلازما (0.85 M - 1 M واجهة)؛ 3) synaptosomes (1 M - 1.2 M واجهة)؛ 4) الخام الميتوكوندريا (بيليه) الذي يستخدم لتنقية الخطوات اللاحقة </li></ol> 3. عزل غشاء الميتوكوندريا ER-المرتبطة بها، MAMs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تعليق النفط الخام طازجة معزولة الميتوكوندريا من نصف الدماغ واحدة، في 2 مل تحتوي على عزل متوسطة مثبطات الأنزيم البروتيني وأضاف طازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد التدرج Percoll 30٪ مع التدرج 8 مل العازلة لكل نصف الدماغ، ووضعت في أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان. </li></ol> * ملاحظة: جعل التدرج العازلة أكثر تركيزا (1.43 مرة) لتحقيق تركيز النهائي الصحيحة بعد دiluting Percoll إلى 30٪. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التعليق طبقة الميتوكوندريا على رأس المعدة الانحدار ببطء لتجنب أي فقاعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي في 95000 XG لمدة 30 دقيقة، 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"><ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء الثقيلة (أقل الفرقة) FIRST مع ماصة باستور الزجاج ونقل إلى أنبوب زجاجي الطازجة جولة القاع، على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة جزء الخفيفة (الشريط العلوي) الثاني مع ماصة باستور الزجاج آخر ونقل إلى أنبوب زجاجي منفصل الطازجة جولة القاع، على الجليد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع كل من الكسور التي تم جمعها في الخطوة 3.5 مع 10 مل متوسطة العزل والطرد المركزي في 6300 x ج لمدة 10 دقيقة في 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف من الكسر الثقيلة التي تم الحصول عليها في الخطوة 3.6، إعادة تعليق بيليه مع وسيلة أخرى مل عزل 10 و أجهزة الطرد المركزي مرة أخرى، كخطوة 3.6. سوف يكون الناتج بيليه الكسر نقية الميتوكوندريا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طاف من جزء مخلفات الخفيفةنشوئها حصلت عليه في الخطوة 3.6 إلى أنبوب الطرد المركزي فائقة الوضوح بيكمان، على الجليد. تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة إلى عزل كافية متوسطة طاف حصلت عليه في الخطوة 3.8 إلى ملء الأنبوب وأجهزة الطرد المركزي في XG 100،000 ل1 ساعة، 4 ° C. سوف يكون الناتج بيليه الكسر MAMs. إزالة بعناية وتجاهل طاف. </li></ol> ملاحظة: في هذه الخطوة، قد أجهزة الطرد المركزي كما في 100،000 x ج لمدة 1 ساعة، 4 ° C طاف حفظ في الخطوة 2.6. سوف يكون بيليه الكسر ER وطاف الكسر عصاري خلوي. 4. استخراج Glycosphingolipid-المخصب الأحجار الكريمة، Microdomains <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز نقية الكسور الميتوكوندريا و / أو MAM في مل-1 ميكرولتر 500 من استخراج الاحتياطي لمدة 20 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي في 15300 XG لست] لمدة 2 دقيقة على 4 درجات مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع supernatants (تريتون X-100 المواد القابلة للذوبان) والكريات إعادة الطرد المركزيلمدة 2 دقيقة لإزالة المواد المتبقية القابلة للذوبان. (تريتون X استخراج-100 الميتوكوندريا و / أو تريتون X-100 MAMs استخراج). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الكريات في Solubilising الاحتياطي. هذه المواد solubilized يمثل الكسور GEM، ويمكن استخدامها لمزيد من التحليل. </li></ol>

<ol>
	<li>Poburko, D., Kuo, K. H., Dai, J., Lee, C. H., van Breemen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organellar+junctions+promote+targeted+Ca2++signaling+in+smooth+muscle:+why+two+membranes+are+better+than+one.">Organellar junctions promote targeted Ca2+ signaling in smooth muscle: why two membranes are better than one.</a> Trends Pharmacol. Sci. 25 (1), 8-15 (2004).</li><li>Pani, B., Ong, H. L., Liu, X., Rauser, K., Ambudkar, I. S., Singh, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+rafts+determine+clustering+of+STIM1+in+endoplasmic+reticulum-plasma+membrane+junctions+and+regulation+of+store-operated+Ca2++entry+(SOCE.">Lipid rafts determine clustering of STIM1 in endoplasmic reticulum-plasma membrane junctions and regulation of store-operated Ca2+ entry (SOCE.</a> J. Biol. Chem. 283 (25), 17333-17340 (2008).</li><li>Levine, T., Rabouille, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum:+one+continuous+network+compartmentalized+by+extrinsic+cues.">Endoplasmic reticulum: one continuous network compartmentalized by extrinsic cues.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 17 (4), 362-368 (2005).</li><li>Sano, R., Annunziata, I., Patterson, A., Moshiach, S., Gomero, E., Opferman, J., Forte, M., d'Azzo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GM1-ganglioside+accumulation+at+the+mitochondria-associated+ER+membranes+links+ER+stress+to+Ca(2+)-dependent+mitochondrial+apoptosis.">GM1-ganglioside accumulation at the mitochondria-associated ER membranes links ER stress to Ca(2+)-dependent mitochondrial apoptosis.</a> Mol. Cell. 36 (3), 500-511 (2009).</li><li>Raturi, A., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Where+the+endoplasmic+reticulum+and+the+mitochondrion+tie+the+knot:+The+mitochondria-associated+membrane+(MAM).">Where the endoplasmic reticulum and the mitochondrion tie the knot: The mitochondria-associated membrane (MAM).</a> Biochim. Biophys. Acta. , (2012).</li><li>Giorgi, C., De Stefani, D., Bononi, A., Rizzuto, R., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+link+between+the+mitochondrial+network+and+the+endoplasmic+reticulum.">Structural and functional link between the mitochondrial network and the endoplasmic reticulum.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 41 (10), 1817-1827 (2009).</li><li>d'Azzo, A., Tessitore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sano+Gangliosides+as+apoptotic+signals+in+ER+stress+response.">Sano Gangliosides as apoptotic signals in ER stress response.</a> Cell Death Differ. 13, 404-414 (2006).</li><li>Kroemer, G., Galluzzi, L., Brenner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+membrane+permeabilization+in+cell+death.">Mitochondrial membrane permeabilization in cell death.</a> Physiol. Rev. 87, 99-163 (2007).</li><li>Rizzuto, R., Brini, M., Murgia, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microdomains+with+high+Ca2++close+to+IP3-sensitive+channels+that+are+sensed+by+neighboring+mitochondria.">Microdomains with high Ca2+ close to IP3-sensitive channels that are sensed by neighboring mitochondria.</a> Science. 262, 744-747 (1993).</li><li>Lynes, E. M., Bui, M., Yap, M. C., Benson, M. D., Schneider, B., Ellgaard, L., Berthiaume, L. G., Simmen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palmitoylated+TMX+and+calnexin+target+to+the+mitochondria-associated+membrane.">Palmitoylated TMX and calnexin target to the mitochondria-associated membrane.</a> EMBO J. 31 (2), 457-470 (2011).</li><li>Fujimoto, M., Hayashi, T., Su, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+cholesterol+in+the+association+of+endoplasmic+reticulum+membranes+with+mitochondria.">The role of cholesterol in the association of endoplasmic reticulum membranes with mitochondria.</a> Biochem. Biophys. Res. Commun. 417 (1), 635-639 (2012).</li><li>Grimm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ER-mitochondria+interface:+the+social+network+of+cell+death.">The ER-mitochondria interface: the social network of cell death.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1823 (2), 327-334 (2012).</li><li>Vance, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipid+synthesis+in+a+membrane+fraction+associated+with+mitochondria.">Phospholipid synthesis in a membrane fraction associated with mitochondria.</a> J. Biol. Chem. 265, 7248-7256 (1990).</li><li>Wieckowski, M. R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat. Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Pizzo, P., Viola, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+lipid+rafts:+structure+and+function.">Lymphocyte lipid rafts: structure and function.</a> Curr. Opin. Immunol. 15 (3), 255-260 (2003).</li></ol>

أي من الكتاب لديها أي تضارب في المصالح لإعلان.

مواقع الاتصال بين الخلايا أو الأغشية بين العضيات غشاء البلازما والخلايا تمثل دينامية منصات إشارة للعمليات الخلوية الأساسية. توصيف دقيق لوظيفتها تكوين وتحت كل الظروف الفسيولوجية والمرضية تتطلب بروتوكولات تنقية موثوق بها وقابلة للتكرار. تم الأساليب بالتفصيل هنا عل?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> الكواشف </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> تجزئة </td></tr><tr><td> سكر القصب </td><td> فيشر العلمية </td><td> S5-500 </td><td></td></tr><tr><td> بيكربونات الصوديوم </td><td> سيغما الدريخ </td><td> S-5761 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد المغنيسيوم، هيدرات </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP214-500 </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الكالسيوم، تبلور </td><td> سيغما الدريخ </td><td> C-5080 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> MAM </td></tr><tr><td> D-المانيتول </td><td> سيغما الدريخ </td><td> M9546-250G </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP310-500 </td><td></td></tr><tr><td> EGTA </td><td> سيغما الدريخ </td><td> E4378-250G </td><td></td></tr><tr><td> BSA، V الكسر، الصدمة الحرارية، Lyophilizate </td><td> روش </td><td> 03-116-964-001 </td><td></td></tr><tr><td> Percoll </td><td> GE </td><td> 17-0891-02 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> GEM </td></tr><tr><td> تريتون X-100 </td><td> سيغما الدريخ </td><td> T9284-500 مل </td><td></td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> فيشر العلمية </td><td> S271-3 </td><td></td></tr><tr><td> تريس قاعدة </td><td> روش </td><td> 03-118-142-001 </td><td></td></tr><tr><td> حمض الهيدروكلوريك </td><td> فيشر العلمية </td><td> A144S-500 </td><td></td></tr&gt; <tr><td> EDTA </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP120-500 </td><td></td></tr><tr><td> كبريتات الصوديوم دوديسيل (SDS) </td><td> فيشر العلمية </td><td> BP166-500 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> مشترك </td></tr><tr><td> مثبطات الأنزيم البروتيني أقراص، كاملة EDTA خالية </td><td> روش </td><td> 11-873-580-001 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> EQUIPMENT </td></tr><tr><td> 2 مل المطاحن دوس الأنسجة بالكامل من الزجاج </td><td> كيمبل تشيس </td><td> 885300-0002 </td><td></td></tr><tr><td> 15 مل أنابيب البولي بروبلين جهاز طرد مركزي مخروطي، BD الصقر </td><td> BD </td><td> 352097 </td><td></td></tr><tr><td> 30 مل جهاز طرد مركزي زجاج مستديرة أنابيب أسفل </td><td> كيمبل تشيس </td><td> 45500-30 </td><td></td></tr><tr><td> 15 مل جولة أسفل الزجاج Centrifuge أنابيب </td><td> كيمبل تشيس </td><td> 45500-15 </td><td></td></tr><tr><td> أنابيب نابذة فائقة السرعة، فائقة الوضوح، Thinwall، 14x89 ملم </td><td> بيكمان كولتر، </td><td> 344059 </td><td></td></tr><tr><td> Parafilm </td><td> كول-Parmer </td><td> PM996 </td><td></td></tr><tr><td> البورسليكات الزجاج القابل للتصرف باستور Pipets، 9 &quot; </td><td> فيشر العلمية </td><td> 13-678-20C </td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondria-associated er membranes (mams) and glycosphingolipid enriched microdomains (gems): isolation from mouse brain

عضيات داخل الخلايا هي هياكل ديناميكية للغاية مع اختلاف الشكل والتكوين، التي تخضع لخلية محددة العظة الجوهرية وخارجي. وجنبا إلى جنب في كثير من الأحيان الأغشية في مواقع محددة الاتصال، والتي أصبحت مراكز لتبادل جزيئات إشارة، مكونات غشاء 1،2،3،4. وmicrodomains غشاء بين العضيات التي تتشكل بين الشبكة الإندوبلازمية (ER) والميتوكوندريا في افتتاح كا IP3 حساسة 2 + قناة معروفة والأغشية المرتبطة-ER أو الميتوكوندريا MAMs 4،5،6. تم تكوين البروتين / والدهون خصائص البيوكيميائية من هذه المواقع الاتصال غشاء درس على نطاق واسع ولا سيما فيما يتعلق بدورها في تنظيم الكالسيوم داخل الخلايا 2 + 4،5،6. وER بمثابة المخزن الأساسي من الكالسيوم داخل الخلايا 2 +، وبهذه الصفة ينظم عدد لا يحصى من العمليات الخلوية المصب من الكالسيوم 2 + إشارات، بما فيuding بعد متعدية للطي البروتين والبروتين maturation7. الميتوكوندريا، من ناحية أخرى، والحفاظ على التوازن الكالسيوم + 2، من خلال التخزين المؤقت عصاري خلوي الكالسيوم تركيز + 2 وبالتالي منع بدء مسارات أفكارك المصب من الكالسيوم 2 + 4،8 عدم الاتزان. الطبيعة الديناميكية للMAMs يجعلها مثالية لمواقع تشريح الآليات الخلوية الأساسية، بما في ذلك إشارات الكالسيوم + 2 وتنظيم الكالسيوم الميتوكوندريا 2 + تركيز الدهون الحيوي، والنقل، والطاقة والأيض الخلوي بقاء 4،9،10،11،12. وقد وصفت عدة بروتوكولات لتنقية هذه microdomains من أنسجة الكبد والخلايا المستزرعة 13،14. اتخاذ أساليب المنشورة سابقا في الحسبان، تكيفنا بروتوكول لعزل الميتوكوندريا وMAMs من مخ الفأر الكبار. لهذا الإجراء واضاف لدينا خطوة اضافية تنقية، وهما X100 تريتون استخراج، والتي هنابلس عزل جزء المخصب glycosphingolipid (GEM) microdomain من MAMs. هذه الاستعدادات GEM مشاركة العديد من مكونات البروتين مع الدهون والطوافات caveolae، والمستمدة من غشاء البلازما أو الأغشية داخل الخلايا الأخرى، واقترح أن تعمل على تجميع نقاط لتجميع البروتينات المستقبلة للبروتين والبروتين التفاعلات 4،15.

بناء على خبرتنا في استخدام هذا البروتوكول يمكن أن نوصي بأمان لعزل وتنقية MAMs، والأحجار الكريمة والكسور الميتوكوندريا من مخ الفأر. الإجراء على النحو المبين هو تكرار للغاية ومتسقة. في الشكل 1 نعرض صورة ممثل طبقة نقية طريقة الميتوكوندريا وMAMs على التدرج Percoll (الخ...

Watch this Scientific Journal Video about Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain at JoVE.com

Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

هذا الإجراء يوضح كيفية عزل من مخ الفأر الكبار الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER أو MAMs وglycosphingolipid التخصيب microdomain الكسور من MAMs والاستعدادات الميتوكوندريا.

الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER (MAMs) وGlycosphingolipid Microdomains المخصب (GEMS): عزل من مخ الفأر

Intracellular organelles are highly dynamic structures with varying shape and composition, which are subjected to cell-specific intrinsic and extrinsic ...

mitochondria-associated-er-membranes-mams-glycosphingolipid-enriched

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Mitochondria-associated ER Membranes (MAMs) and Glycosphingolipid Enriched Microdomains (GEMs): Isolation from Mouse Brain

24.2K Views.  St Jude Children's Research Hospital. هذا الإجراء يوضح كيفية عزل من مخ الفأر الكبار الميتوكوندريا المرتبطة الأغشية ER أو MAMs وglycosphingolipid التخصيب microdomain الكسور من MAMs والاستعدادات الميتوكوندريا.

Video: Mitochondria-associated ER Membranes MAMs and Glycosphingolipid Enriched Microdomains GEMs: Isolation from Mouse Brain

Isolation and Culture of Endothelial Cells from the Embryonic Forebrain

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two vascular networks of the embryonic forebrain, pial and periventricular, are spatially distinctive and have different origins and growth patterns. Endothelial cells from the pial and periventricular vascular networks have unique gene expression profiles and functions. Here we present a step-by-step protocol for isolation, culture, and verification of pure populations of endothelial cells from the periventricular vascular network (PVECs) of the embryonic forebrain (telencephalon). In this approach, telencephalon devoid of pial membrane obtained from embryonic day 15 mice is minced, digested with collagenase/dispase, and dispersed mechanically into a single cell suspension. PVECs are purified from cell suspension using positive selection with anti-CD-31/PECAM-1 antibody conjugated to MicroBeads using a strong magnetic separation method. Purified cells are cultured on collagen 1&#160;coated culture dishes in endothelial cell culture medium until they become confluent and further subcultured. PVECs obtained with this protocol exhibit cobblestone and spindle shaped phenotypes, as visualized by phase-contrast light microscopy and fluorescence microscopy. Purity of PVEC cultures was established with endothelial cell markers. In our hands, this method reliably and consistently yields pure populations of PVECs. This protocol will benefit studies aimed at gaining mechanistic insights into forebrain angiogenesis, understanding PVEC interactions, and cross-talks with neuronal cell types and holds tremendous potential for therapeutic angiogenesis.

This video demonstrates an easy and reliable strategy for preparation of pure cultures of endothelial cells from the embryonic forebrain within 10-12 days and will be useful for research focused on many aspects of cerebral angiogenesis.

العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم

Embryonic brain endothelial cells can serve as an important tool in the study of angiogenesis and neurovascular development and interactions. The two ...

Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic strategies that hold the promise to enhance brain drug delivery, improve brain protection, and treat brain disorders. However, studying the human blood-brain barrier function is challenging. Thus, there is a critical need for appropriate models. In this regard, brain capillaries isolated from human brain tissue represent a unique tool to study barrier function as close to the human in vivo situation as possible. Here, we describe an optimized protocol to isolate capillaries from human brain tissue at a high yield and with consistent quality and purity. Capillaries are isolated from fresh human brain tissue using mechanical homogenization, density-gradient centrifugation, and filtration. After the isolation, the human brain capillaries can be used for various applications including leakage assays, live cell imaging, and immune-based assays to study protein expression and function, enzyme activity, or intracellular signaling. Isolated human brain capillaries are a unique model to elucidate the regulation of the human blood-brain barrier function. This model can provide insights into central nervous system (CNS) pathogenesis, which will help the development of therapeutic strategies for treating CNS disorders.

Isolated brain capillaries from human brain tissue can be used as a preclinical model to study barrier function under physiological and pathophysiological conditions. Here, we present an optimized protocol to isolate brain capillaries from fresh human brain tissue.

عزل من الشعيرات الدموية الدماغية من أنسجة المخ البشري الطازج

Understanding blood-brain barrier function under physiological and pathophysiological conditions is critical for the development of new therapeutic ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

العزلة واستخراج الحمض النووي الريبي للخلايا العصبية والضامة وميكروجليا من العقول الزرد اليرقات

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Isolation of Region-specific Microglia from One Adult Mouse Brain Hemisphere for Deep Single-cell RNA Sequencing

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive human diseases. Considerable advances have been made to uncover the molecular signatures of homeostatic microglia as well as alterations of their gene expression in response to environmental stimuli. With the advent and maturation of single-cell genomic methodologies, it is increasingly recognized that heterogenous microglia may underlie the diverse roles they play in different developmental and pathological conditions. Further dissection of such heterogeneity can be achieved through efficient isolation of microglia from a given region of interest, followed by sensitive profiling of individual cells. Here, we provide a detailed protocol for the rapid isolation of microglia from different brain regions in a single adult mouse brain hemisphere. We also demonstrate how to use these sorted microglia for plate-based deep single-cell RNA sequencing. We discuss the adaptability of this method to other scenarios and provide guidelines for improving the system to accommodate large-scale studies.

We provide a protocol for isolation of microglia from different dissected regions of an adult mouse brain hemisphere, followed by semi-automated library preparation for deep single-cell RNA sequencing of full-length transcriptomes. This method will help to elucidate functional heterogeneity of microglia in health and disease.

عزل ميكروليا الخاصة بالمنطقة من واحد الكبار الفار الدماغ نصف الكره لعمق خليه واحده التسلسل RNA

As resident macrophages in the central nervous system, microglia actively control brain development and homeostasis, and their dysfunctions may drive ...

Studying Pre-formed Fibril Induced &#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with immunostaining and unbiased automated image analysis, this model allows for the analysis of the effects of drugs and genetic manipulations on &#945;-synuclein aggregation in neuronal cultures. Primary midbrain cultures provide a reliable source of bona fide embryonic dopamine neurons. In this protocol, the hallmark histopathology of Parkinson&#8217;s disease, Lewy bodies (LB), is mimicked by the addition of &#945;-synuclein pre-formed fibrils (PFFs) directly to neuronal culture media. Accumulation of endogenous phosphorylated &#945;-synuclein in the soma of dopamine neurons is detected by immunostaining already at 7 days after the PFF addition. In vitro cell culture conditions are also suitable for the application and evaluation of treatments preventing &#945;-synuclein accumulation, such as small molecule drugs and neurotrophic factors, as well as lentivirus vectors for genetic manipulation (e.g., with CRISPR/Cas9). Culturing the neurons in 96 well plates increases the robustness and power of the experimental setups. At the end of the experiment, the cells are fixed with paraformaldehyde for immunocytochemistry and fluorescence microscopy imaging. Multispectral fluorescence images are obtained via automated microscopy of 96 well plates. These data are quantified (e.g., counting the number of phospho-&#945;-synuclein-containing dopamine neurons per well) with the use of free software that provides a platform for unbiased high-content phenotype analysis. PFF-induced modeling of phosphorylated &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons provides a reliable tool to study the underlying mechanisms mediating formation and elimination of &#945;-synuclein inclusions, with the opportunity for high-throughput drug screening and cellular phenotype analysis.

Studying Pre-formed Fibril Induced &amp;#945;-Synuclein Accumulation in Primary Embryonic Mouse Midbrain Dopamine Neurons

Here, we present a detailed protocol to study neuronal &#945;-synuclein accumulation in primary mouse dopamine neurons. Phosphorylated &#945;-synuclein aggregates in neurons are induced with pre-formed &#945;-synuclein fibrils. Automated imaging of immunofluorescently labeled cells and unbiased image analysis make this robust protocol suitable for medium-to-high throughput screening of drugs that inhibit &#945;-synuclein accumulation.

دراسة ما قبل تشكيلها فيبريل الناجمة عن تراكم α-Synuclein في الخلايا العصبية الدوبامين الماوس الجنينية الأولية

The goal of this protocol is to establish a robust and reproducible model of &#945;-synuclein accumulation in primary dopamine neurons. Combined with ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

تشريح وعزل الفئران الدبقية من مناطق الجهاز العصبي المركزي المتعددة

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

A Fibrin-Enriched and tPA-Sensitive Photothrombotic Stroke Model

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent infarction size and location, precipitation of platelet:fibrin intermixed blood clots similar to those in patients, and an adequate sensitivity to fibrinolytic treatment. The rose bengal (RB) dye-based photothrombotic stroke model meets the first two requirements but is highly refractory to tPA-mediated lytic treatment, presumably due to its platelet-rich, but fibrin-poor clot composition. We reason that combination of RB dye (50 mg/kg) and a sub-thrombotic dose of thrombin (80 U/kg) for photoactivation aimed at the proximal branch of middle cerebral artery (MCA) may produce fibrin-enriched and tPA-sensitive clots. Indeed, the thrombin and RB (T+RB)-combined photothrombosis model triggered mixed platelet:fibrin blood clots, as shown by immunostaining and immunoblots, and maintained consistent infarct sizes and locations plus low mortality. Moreover, intravenous injection of tPA (Alteplase, 10 mg/kg) within 2 h post-photoactivation significantly decreased the infarct size in T+RB photothrombosis. Thus, the thrombin-enhanced photothrombotic stroke model may be a useful experimental model to test novel thrombolytic therapies.

Traditional photothrombotic stroke (PTS) models mainly induce dense platelet aggregates of a high resistance to tissue plasminogen activator (tPA)-lytic treatment. Here a modified murine PTS model is introduced by co-injecting thrombin and photosensitive dye for photoactivation. The thrombin-enhanced PTS model produces mixed platelet:fibrin clots and is highly sensitive to tPA-thrombolysis.

نموذج السكتة الدماغية الضوئية الخثارية المخصبة بالفيبرين والحساسة ل tPA

An ideal thromboembolic stroke model requires certain properties, including relatively simple surgical procedures with low mortality, a consistent ...

القياس الكمي لتعديل هيستون دماغ الفأر باستخدام قياس التدفق الخلوي

Quantification of Global Histone Post Translational Modifications Using Intranuclear Flow Cytometry in Isolated Mouse Brain Microglia

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to histone tails. Histone post-translational modifications (HPTMs) can either facilitate gene expression or repression. For example, acetylation of histone tail lysine residues neutralizes the positive charge and reduces interactions between the tail and negatively charged DNA. The decrease in histone tail-DNA interactions results in increased accessibility of the underlying DNA, allowing for increased transcription factor access. The acetylation mark also serves as a recognition site for bromodomain-containing transcriptional activators, together resulting in enhanced gene expression. Histone marks can be dynamically regulated during cell differentiation and in response to different cellular environments and stimuli. While next-generation sequencing approaches have begun to characterize genomic locations for individual histone modifications, only one modification can be examined concurrently. Given that there are hundreds of different HPTMs, we have developed a high throughput, quantitative measure of global HPTMs that can be used to screen histone modifications prior to conducting more extensive genome sequencing approaches. This protocol describes a flow cytometry-based method to detect global HPTMs and can be conducted using cells in culture or isolated cells from in vivo tissues. We present example data from isolated mouse brain microglia to demonstrate the sensitivity of the assay to detect global shifts in HPTMs in response to a bacteria-derived immune stimulus (lipopolysaccharide). This protocol allows for the rapid and quantitative assessment of HPTMs and can be applied to any transcriptional or epigenetic regulator that can be detected by an antibody.

تسليط الضوء على المؤلف: تحسينات في أبحاث تنظيم التعبير الجيني

This work describes a protocol for the quantification of global histone modifications using intranuclear flow cytometry in isolated brain microglia. The work also contains the microglia isolation protocol that was used for data collection.

القياس الكمي لتعديلات هيستون العالمية بعد الترجمة باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة لدماغ الفأر المعزول

Gene expression control occurs partially by modifications in chromatin structure, including the addition and removal of posttranslational modifications to ...