ويتم تمويل SS من قبل الزمالة ويلكوم ترست المتوسطة السريرية، CW من قبل ويلكوم ترست برنامج المنح.

1. إعداد شريحة مجهرية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Precoat على شريحة مجهرية ستة قناة مع ذيل فأر نوع الكولاجين الأول (RTC، مخففة في برنامج تلفزيوني 1:100 إعطاء تخفيف العمل من 220 ميكروغرام / مل). يتم تنفيذ هذا عن طريق حقن 30 ميكرولتر من المخفف حل RTC مباشرة في القنوات واحتضان لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية، تليها ثلاث غسلات مع برنامج تلفزيوني. </li></ol> 2. بذر خلايا في Microslides <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل ومتكدسة T75 قارورة من الخلايا الكبدية البشرية المستزرعة الجيبية البطانية (HSEC) (معزولة من أنسجة الكبد كما هو موضح سابقا 13) في التربسين EDTA-، وغسل في برنامج تلفزيوني، و resuspend في 3 × 10 6 خلية / مل في وسائل الإعلام كاملة (البطانية الإنسان وسائل الاعلام القاعدية تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / مل البنسلين والستربتوميسين 100μg/ml، و 10٪ الحرارة المعطل المصل AB الإنسان، 10 نانوغرام / مل من عامل النمو البطاني الوعائي و 10 نانوغرام / مل من عامل النمو الكبدية). ضخ 30 ميكرولتر من تعليق خلية وخيمةctly في كل قناة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك خلايا الالتزام لمدة 1 ساعة في حاضنة ترطيب عند 37 ° C مع 5٪ CO 2 الغلاف الجوي على رف الشريحة. بعد السماح للخلايا الالتزام ملء منافذ على جانبي كل قناة مع المتوسطة كاملة (الشكل 1). </li></ol> 3. خلوى تحفيز خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك الخلايا في الحاضنة لمدة 24 ساعة. تقييم نمو الخلايا باستخدام المجهر النقيض من المرحلة مقلوب. 24 ساعة قبل التصاق مقايسة، وتحفيز الطبقات الوحيدة البطانية مع خلوى عن طريق استبدال وسائط النمو مع وسائل الإعلام كاملة تكملها عامل نخر الورم ألفا انترفيرون جاما و، سواء في 10 نانوغرام / مل. </li></ol> 4. عزل الخلايا اللمفاوية في الدم المحيطي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي من الدم الكامل عن طريق تنقية البداية الكسر وحيدات النوى من قبل التدرج الكثافة الطرد المركزي عبر وسائل الإعلام الطرد المركزي فصل الخلية المناسبة لمدة 25 دقيقة في 800ز خ. احتضان الخلايا على البلاستيك لمدة 1 ساعة للسماح للانضمام وحيدات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الانضمام إلى نضح البلاستيك اللمفاويات المخصب طاف. غسل الخلايا الليمفاوية و resuspend لهم (عادة 1 × 10 6 خلية / مل في تدفق المتوسطة (وسائل الإعلام القاعدية البطانية تحتوي على 0.1٪ (ت / ت) ألبومين المصل البقري (BSA)). </li></ol> 5. المعالجة من البطانة Endothelium أو كريات الدم البيضاء مع مثبطات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير التخفيفات الموصى بها من وظيفة حجب الأضداد أو مثبطات جزيء صغير في البطانية media/0.1٪ (V / V) BSA. استبدال المتوسطة كاملة مع عرقلة الحل الضد / المانع في اختيار قناة شريحة مجهرية 30 دقيقة قبل أن تتدفق مقايسة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حيث يتم التخطيط المعالجة من المستقبلات chemokine على الخلايا الليمفاوية، في resuspend كريات الدم البيضاء المعزولة في حل RPMI تحتوي على 0.1٪ (ت / ت) BSA واحتضان مع 200 نانوغرام / مل من السعال الديكي السمية لمنع G-البروتين يقترن نشاط مستقبلات مستقبلات chemokine؛ تمييع بدلا محددة وظيفةمنع الأجسام المضادة أو مثبطات جزيء صغير من مستقبلات chemokine في التخفيف الموصى بها. كريات الدم البيضاء احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة، ثم يغسل و resuspend في تدفق المتوسطة. </li></ol> 6. الإعداد للتدفق نظام الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Prewarm غرفة شفافة يسيطر حراريا إلى 37 ° C. ينبغي أن يكون للغرفة منافذ لإدخال أنابيب السيليكون والعرض الإلكترونية لصمام الملف اللولبي الإلكترونية التي تمكن التبديل بين الخلايا وسائل الإعلام مع عمليا أي حجم القتلى. هي التي شنت الغرفة على مجهر مقلوب للسماح النقيض من المرحلة المجهري. يوضح الشكل 2 غرفة فحص التدفق والمجهر وشريحة مجهرية وضعت على المسرح المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء مسبق كوب 50 مل المحاقن مع قفل بالتركيبة مع 10 مل من الماء المقطر المعقم وإرفاق بطول 25 سم أنابيب السيليكون إلى ميناء حقنة. إدراج في ضخ حقنة. تغيير معدل انسحاب ضخ حقنة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة شريحة مجهرية في الحفاظ على إجهاد القص من 0.05 باسكال (0.5 داين / سم 2، الشكل 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأخذ اثنين من 5 مل المحاقن، تجاهل الغطاسون وإرفاق برميل إلى يومين في تدفق موانئ صمام الملف اللولبي الإلكترونية باستخدام أنابيب السيليكون. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق 12 سم من أنابيب السيليكون إلى خارج صمام التدفق. صمام يسمح التناوب بين خلية عازلة خالية غسل (البطانية media/0.1٪ (V / V) BSA) وتعليق اللمفاويات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدفق صمام الملف اللولبي الإلكترونية عن طريق إدراج غسل العازلة في كل حقنة برميل وضمان عازلة تتدفق من برميل واحد من خلال صمام وإلى خارج تدفق أنابيب السيليكون. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام مفتاح صمام بالتناوب لبرميل أخرى وضمان عازلة يتدفق وأن تتم إزالة كافة الفقاعات من النظام. إزالة غسل العازلة من أحد البراميل واستبدالها مع الخلايا اللمفاوية تعليق الشكل 4A. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ربط توبين سيليكونز من ضخ حقنة لمنفذ واحد من قناة شريحة مجهرية اختار عبر محول شريحة مجهرية. ثم قم بتوصيل أنابيب السيليكون من صمام تدفق إلى ميناء المعاكس عبر محول شريحة مجهرية. التأكد من أن أنابيب السيليكون ومحولات تمتلئ غسل العازلة قبل التوصيل لمنع فقاعات الهواء التي تدخل نظام (الشكل 4B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة موصولة إلى النظام التدفق، ووضع شريحة مجهرية على المسرح المجهر ونعلق مع مقاطع أو شريط لمنع الحركة. تعيين المجهر لهدف 10X جنبا إلى جنب مع الإعداد المرحلة المناسبة. ضمان تصور أحادي الطبقة البطانية والتركيز باستخدام عدسة العين. ضمان يمكن التقاط الصور عن طريق كاميرا التي تعلق على المجهر، حيث يمكن أن يتم ترحيل الصور إلى جهاز وتسجيلها. </li></ol> 7. تتدفق وتقنيات الفحص وتسجيل من التصاق لتحليل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي الطبقة البطانية مع غسل العازلة لمدة 2 دقيقة من خلال بدء withdrawal من ضخ حقنة لإزالة أي حطام أو غير منضم حجب الأضداد ثم تبديل صمام للسماح بلعة 5 دقائق من حل الكرية البيضاء في جدار القص الإجهاد المستمر لل0.05 بنسلفانيا </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلال 2 دقيقة الأخيرة من البلعة الكرية البيضاء، وسجل 10 حقول عشوائية على طول من شريحة مجهرية. وهذا يسمح حاليا تحليل الخلايا اللمفاوية المتداول / الربط على أحادي الطبقة البطانية. تسجيل كل حقل لحوالي 10 ثانية قبل الانتقال إلى أخرى، وضمان أن تتم التسجيلات ضد اتجاه تدفق لتجنب تسجيل الخلية المتداول نفسه مرتين في تتابع سريع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع بلعة البلعة الكرية البيضاء مع 5 دقائق من غسل العازلة من خلال العودة صمام لموقف بدايته. خلال المباراة النهائية 2 دقيقة من هذا بلعة تنفيذ المرحلة الثانية تسجيل عن طريق اختيار لا يقل عن 10 حقول تم اختيارها عشوائيا على طول من شريحة مجهرية. تسجيل كل حقل لحوالي 5 ثانية قبل الانتقال الى المرحلة التالية وتأكد من أن أحادي الطبقة البطانية وleucoc تمسكاytes في تركيز واضح. وهذا يسمح حاليا تحليل نمط الالتصاق. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

الكتاب تعلن أي المصالح المالية المتنافسة

الخطوة الأكثر أهمية لأداء بنجاح فحص التدفق هو ضمان أن أحادي الطبقة صحية ومتموجة من الخلايا البطانية مستعدة قبل مقايسة التصاق التدفق. الخلايا البطانية الأولية يمكن أن يكون صعبا للثقافة وحساسية للتغييرات في أساليب زراعة. من المهم أن 1) يتم بشكل كاف وبشكل موحد المغلفة غرف تدفق مع الخلايا البطانية في أحادي الطبقة، لHSEC نستخدم الفئران الذيل نوع الكولاجين أنا ولكن هذا قد تختلف عن السكان البطانية الأخرى، 2) مستنبت مناسب لنوع من الخلايا، ل HSEC التي وصفناها لدينا المتوسطة كاملة في قسم البروتوكول. وتشمل الخطوات الحيوية الأخرى وضع ضخ حقنة بمعدل المناسبة لتعكس مستويات الفسيولوجية للإجهاد القص. أثناء فحص التدفق فمن الضروري لمنع فقاعات الهواء داخل الدائرة التدفق التي يمكن أن تتلف أحادي الطبقة البطانية أو تجريد الخلايا المناعية من سطح البطانية. هذا يمكن الوقاية منها عن طريق حماماتsuring أن جميع أنابيب السيليكون ومحولات و perfused مع غسل العازلة قبل الصدد، أن تتم إزالة جميع فقاعات الهواء والتي يتم prewarmed وسائل الإعلام قبل استخدامها. عند توصيل محولات لالمنافذ على شريحة مجهرية من المهم جدا أن هناك واجهة السائل / السائلة أثناء الاتصال، إذا كان هناك أي الهواء ثم وهذا سوف يشكل فجوة الهواء داخل النظام الذي سوف تعطل أحادي الطبقة البطانية أثناء الانسحاب حقنة الخطوة. الحل الكرية البيضاء في برميل حقنة يحتاج الانفعالات العادية للتأكد من أن الخلايا لا تسوية، وبالتالي الحفاظ على كثافة خلايا ثابتة طوال التجربة. خلال خطوات التسجيل فمن المهم لضمان تركيز الصورة من طبقة بطانة الأوعية الدموية على نحو كاف وواضح للسماح حاليا تحليل دقيق، وأنه خلال الخطوة الثانية من فحص تدفق (آخر الكرية البيضاء البلعة) أن يتم ترك ما يكفي من الوقت أثناء غسل العازلة واستأنف المرحلة قبل تسجيل للتأكد من أنتتم إزالة كافة كريات الدم البيضاء غير ملتصق. وبالمثل فإنه من الضروري استخدام الخلايا البطانية في أحادي الطبقة من الكثافة المناسبة لمنع فقدان الخلايا التي يمكن أن تتداخل مع أنماط التدفق في الشعيرات الدموية الضيقة وأيضا يمكن أن يكون من الصعب أن تميز من كريات الدم البيضاء الملتصقة أكبر تحت النقيض من المرحلة المجهري. وصفناها الأمثل كثافة البذر للخلايا البطانية الجيبية كبدي الإنسان، ولكن هذا قد تختلف بين السكان وأنواع مختلفة البطانية. وقد تم إحراز تقدم كبير في دراسة التجنيد الكرية البيضاء في النماذج الحيوانية مع intravital المجهري. والميزة الرئيسية لطريقة الفحص التصاق تدفق هو أن التوظيف الكرية البيضاء يمكن دراستها في النظام الثنائي مع الخلايا البطانية الإنسان الأساسية. وعلاوة على ذلك، فإن هذه التفاعلات يمكن دراستها تحت المستويات الفسيولوجية ذات الصلة من إجهاد القص. من المهم أن تؤكد نتائج الدراسات حيوي داخلي في الحيوانات مع الأنظمة الخلوية الإنسان ما قد يكون هناك differencوفاق في خصائص البطانية بين الأنواع. واحدة من القيود المفروضة على تدفق مقايسة هو أن التوظيف الكرية البيضاء ويجري درس في بيئة وحيدة الخلية من أحادي الطبقة البطانية. بالإضافة مرة واحدة انضمت في كريات الدم البيضاء وtransmigrated عبر البطانة أنها قد لا تكون في موجودة بأعداد كافية لتكون معزولة وتعرض لعمليات المصب. على الرغم من هذه القيود، بمجرد يتقن مقايسة التصاق تدفق يمكن وضعها لتنفيذ مزيد من التحليل للتتالي التصاق الكرية البيضاء وتكييفها مع بيئة متعددة الخلايا ألخص. تسجيل فترات طويلة من الحقول واحد واستخدام برامج تتبع يمكن استخدامها لتحليل السلوك الزحف من كريات الدم البيضاء. وعلاوة على ذلك عند الانتهاء من فحص التدفق يمكن استجواب microslides باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤر المجهري ووضع العلامات مناعي لدراسة التصاق والتهجير في مزيد من التفاصيل. بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتطوير سابقاإد نموذجا في المختبر حيث يمكن كريات الدم البيضاء التي تتدفق التفاعل مع البطانة الكبدي مكيفة من وجود خلايا الكبد. كما يمكن تطوير هذا الفحص لدراسة المجموعات السكانية الفرعية من كريات الدم البيضاء: كان أداء مجموعتنا الدراسات مع مجموعات فرعية مثل الخلايا التنظيمية T والخلايا B، والكبد التسلل كريات الدم البيضاء. هذه الدراسات هي دليل على أن مقايسة التصاق تدفق هو أداة قوية لدراسة العامة والجهاز التوظيف الكرية البيضاء محددة في النظم البشرية.

والآن راسخة بأن التوظيف الكرية البيضاء في العام التالي نموذج للالتصاق سلسلة متعددة الخطوات 1. وهذا ينطوي على الاستيلاء على كريات الدم البيضاء من الدم يتدفق من قبل الخلايا البطانية المبطنة لجدار الوعاء الدموي. في البداية، كريات الدم البيضاء الخضوع خطوة المتداول الذي selectin بوساطة المستقبلات أو أعضاء الفصيلة المناعي. وهذا يسمح أعرب G-بروتين المستقبلات إلى جانب (GPCRs) على سطح الكرية البيضاء ليتم تفعيلها من خلال كيموكينات عرضت على الكنان السكري البطانية. وهذا يؤدي إلى تغيير تأكيد إنتغرين إلى حالة &#39;تقارب عالية&#39; على سطح الكرية البيضاء واعتقال والتصاق شركة إلى البطانة. ثم تبعتها شركة التصاق بسبب تغير الشكل والزحف من الكرية البيضاء على متن السفينة. والخطوة الأخيرة هي التهجير من خلال أحادي الطبقة البطانية، والتي يمكن أن تحدث عبر طرق paracellular أو العابر للخلايا. في حين أن تتالي التصاق متعددة الخطوات تصفق الآلية العامة للتوظيف الكرية البيضاء داخل الجسم هناك اختلافات محددة الجهاز. في الكبد غالبية التوظيف الكرية البيضاء يحدث داخل الجيوب الكبدية وعلى النقيض من الأجهزة الأخرى التي يحدث فيها التجنيد عموما داخل الأوردة الشعرية بعد 2. الجيوب الكبدية هي بيئة منخفضة القص وكريات الدم البيضاء الخضوع خطوة الربط وجيزة قبل أن يرسخ التصاق التي selectin مستقلة 2. تصطف هذه القنوات من قبل البطانة الجيبية الكبدي الذي هو متقطع ويحتوي نافذي، المسام مفتوحة 100-200 نانومتر في القطر، وتفتقر إلى الغشاء القاعدي 3. يمكن توضيح الآليات الجزيئية التي تتوسط التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية الكبدي تحديد الجهاز الأهداف العلاجية محددة لأمراض الكبد الالتهابية. فحوصات التصاق تدفق هي أدوات أساسية في دراسة التجنيد الكرية البيضاء. أنها تسمح إعادة بناء الكرية البيضاء recruitment في وجود إجهاد القص لتحليل التصاق تحت قوات محددة جيدا. الاستخدام الأكثر شيوعا لفحص هو التصاق الكرية البيضاء الدراسة إلى الطبقات الوحيدة البطانية مثقف أو ركائز المنقى. وتستخدم الدوائر تدفق المتاحة تجاريا ليروي الخلايا تحت ظروف تدفق الصفحي بين اثنين من الأسطح المسطحة ثم تصور عملية دينامية للالتصاق على المجهر 4. وقد أثبتت جماعات السابقة أن بعض التفاعلات لاصقة فقط تجري تحت التدفق ولا يمكن دراستها في المقايسات ثابتة 5،6. وقد استخدمنا هذه التقنية لألخص الجيوب الكبدية ودراسة توظيف الكرية البيضاء تحت ظروف إجهاد القص منخفضة. HSEC الإنسان الأساسية هي تربيتها في microslides وكريات الدم البيضاء ثم يمكن perfused على هذا أحادي الطبقة بمعدل تدفق المحسوبة لإنتاج إجهاد القص داخل الجيوب الكبدية. إجهاد القص هو الإجهاد التي يتم تطبيقها بالتوازي أو عرضية إلى السطح كما مقابلosed الإجهاد الطبيعي الذي هو عمودي. فإن أي السائل الذي يتحرك على طول حدود ممارسة إجهاد القص على تلك الحدود. وقد تبين إجهاد القص لتكون عنصرا أساسيا في الخلايا اللمفاوية التهجير 7. في ظل هذه الظروف كل خطوة من تتالي التصاق يمكن تصور من قبل النقيض من المرحلة المجهري. هذه الطريقة سمحت معلومات هامة عن تجنيد كريات الدم البيضاء داخل الكبد بما في ذلك دراسة جزيئات الالتصاق التقليدية 8، ودور كيموكينات ومستقبلات chemokine 9-11، وجزيئات الالتصاق شاذة مثل التصاق الأوعية الدموية البروتين 1 (VAP-1 ) 8،12 اللمفاوية والأوعية الدموية شيوعا والبطانية مستقبلات 1 (CLEVER-1) 13. في حين تم ذكر هذا الاختبار في العديد من المنشورات مجموعتنا، وقد تم وصفه وجيزة واتخذنا هذه الفرصة لتقديم مفصلة خطوة خطوة الدليل لمساعدتك في استكشاف الأخطاء وإصلاحها ومنع الأخطاء الفنية عند محاولةجي الفحص. وعلاوة على ذلك، ونحن قد تغيرت مؤخرا الحصول على مصادر للغرف شريحة مجهرية الذي يسمح تعديلات دقيقة في إجهاد القص. نحن نعتقد أن هذا يوسع تطبيق الفحص على الخلايا البطانية والمناعية الأخرى. يصف الطريقة التالية إعداد وتقنية لتنفيذ تدفق استنادا التصاق مقايسة مع الخلايا البطانية الجيبية كبدي الإنسان والخلايا الليمفاوية في الدم المحيطي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

الكرية البيضاء التسلل إلى أنسجة الكبد الإنسان هو عملية مشتركة في جميع أمراض الكبد التهابات الكبار. تسلل مزمن يمكن أن تدفع تطور التليف والتقدم إلى تليف الكبد. يمكن فهم الآليات الجزيئية التي تتوسط التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد تحديد الأهداف العلاجية الهامة لمرض الكبد. التفاعل الرئيسية خلال تجنيد الكرية البيضاء هو أن الخلايا الالتهابية مع البطانة تحت ظروف إجهاد القص. التوظيف في الكبد يحدث داخل قنوات القص منخفضة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية كبدي (HSEC). الظروف داخل الجيوب الكبدية يمكن تلخيصها بواسطة perfusing كريات الدم البيضاء من خلال قنوات مبطنة من قبل الطبقات الوحيدة HSEC الإنسان في معدلات تدفق محددة. في هذه الظروف يخضع كريات الدم البيضاء خطوة الربط قصيرة تليها تفعيل والتصاق شركة، تليها خطوة الزحف والتهجير لاحقة عبر البطانيةالطبقة. باستخدام مجهر تباين الطور، كل خطوة من هذا &#39;تتالي التصاق&#39; يمكن تصور وسجلت تليها تحليل غير متصل. الخلايا البطانية أو كريات الدم البيضاء يمكن سابقة التجهيز مع مثبطات لتحديد دور جزيئات محددة خلال هذه العملية.

هذا الاختبار لديه القدرة على تصور متعددة الخطوات التصاق تدفق شلال وتوضيح الآليات الجزيئية الكامنة من خلال مقارنة نتائج التجارب السيطرة على تلك مع مثبطات الجزيئية. سرير مختلف الأوعية الدموية يمكن تلخيصها من خلال دمج الخلايا البطانية محددة وتغيير ظروف إجهاد القص. كل خطوة من تتالي التصاق يمكن تحليلها حاليا باتباع طريقة التسجيل الواردة في البروتوكول. الخطوة الأولى من تتالي التصاق هو المتداول من كريات الدم البيضاء والتي يمكن التعبير عنها كنسبة مئوية من مجموع الخلايا الملتصقة. تحليل متواجد حاليا يسمح عدد من الخلايا الملتصقة أن المعددة في كل حقل سجلت خلال بلعة الكرية البيضاء. قراءة الصورة يسمح للمقارنة بين الخلايا التي هي ملتصقة بقوة وتلك التي تشهد حركة المتداول عبر البطانة. يمكن تصور الحركة المتداول باستخدام هذه التقنية، يتم تسجيل كل حقل لا يقل عن 10 ثانية. يتم تحديد الخلايا المتداول عن طريق تخفيض سرعتها على سطح البطانية مقارنة تتدفق الخلايا. يجب أن يظهر هذا السلوك لا يقل عن 5 ثوانى دون انفصال. تتالي التصاق داخل الجيوب الكبدية يحدث في بيئة منخفضة القص والدراسات المجراة وقد أكدت الحد الأدنى المتداول مع مجرد خطوة الربط وجيزة. لقد أكد أن فحص التدفق يعكس البيئة في الجيوب الكبدية من خلال إظهار أن أقل من 10٪ من كريات الدم البيضاء ملتصقة لفة باستمرار على حفز HSEC في هذه المقايسات. الخطوة التالية من تتالي التصاق التصاق الشركة. ويمكن حساب مجموع الالتزام من المرحلة الثانية من خلال تسجيل بلعة غسل العازلة (الخطوة 7.3). تحليل متواجد حاليا يسمح للعدد الكلي للخلايا ملتصقة بقوة لفرزها في كل حقل (الشكل 5). يتم تعريف الخلايا الملتصقة بقوة كما الخلايا التي هي ثابتة أو shapechanged مع السلوك الزحف البطيء.ومن ثم يمكن حساب متوسط ​​عدد الخلايا في الميدان. ويمكن بعد هذا الرقم يمكن استخدامها، بالتزامن مع المساحة الإجمالية للمجال الرؤية (مصرة باستخدام graticule أو ما يعادلها)، وتركيز الخلايا الليمفاوية (عادة 1 × 10 6 خلية / مل) ومعدل التدفق للتعبير عن مدى الالتزام اللمفاويات كما الخلايا الملتصقة / مم 2/10 6 خلايا perfused. دراسة نمط التصاق ينطوي على تحليل الخطوات الأخيرين من تتالي التصاق بما في ذلك الشكل تغير، والزحف والهجرة transendothelial. تظهر كريات الدم البيضاء ملتصقة على السطح العلوي للأحادي الطبقة HSEC تظهر مرحلة مشرقة في حين تلك التي هاجرت من خلال أحادي الطبقة المرحلة المظلمة (الشكل 6). ويمكن بعد ذلك أن تصنف الخلايا كما نستعرض التصاق &#39;ثابت&#39; (nonmigrated / جولة)، مورفولوجيا &#39;تغيير شكل&#39; أو &#39;هاجر&#39; ومن ثم يتم التعبير عن الفئات الفردية كنسبة مئوية منمجموع السكان لاصقة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> الشكل 1. أحادي الطبقة من الخلايا الكبدية الإنسان الأساسية الجيبية البطانية داخل غرفة التدفق. A) Microslides مليئة سائل الإعلام التي تحتوي على أحادي الطبقة من الخلايا البطانية قبل بدء تدفق التصاق الفحص. ب) المرحلة صورة النقيض من متكدسة البطانية أحادي الطبقة، ينبغي المصنفة الخلايا البطانية في شريحة مجهرية والتي تم precoated (للخلايا البطانية كبدي الإنسان وهذا ينبغي أن يكون مع نوع ذيل فأر الكولاجين 1) وأنه من الضروري أن الخلايا البطانية في صحة جيدة في الثقافة ومتموجة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; سرك = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; الشكل 2. تدفق غرفة الفحص. وغرفة فحص تدفق مجموعة المتابعة يمكن أن ينظر إليه هنا، وتتكون من غرفة الشفافة التي شنت على مجهر مقلوب. يتم وضع سخان في الغرفة ويجب أن يسيطر حراريا للحفاظ على درجة حرارة 37 درجة مئوية. ينبغي أن يكون هناك المنافذ المتاحة للاتصال أنابيب السيليكون من شريحة مجهرية داخل غرفة إلى ضخ حقنة الذي يقع خارج. يتم وضع شريحة مجهرية مباشرة على المسرح المجهر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> الرقم 3. محقنة مضخة. مضخة الحقنة هو الاتصالإد عبر أنابيب السيليكون إلى غرفة التدفق. يتم تعيين مضخة إلى معدل الانسحاب محددة تبعا لإجهاد القص المطلوب المطلوبة للمقايسة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> الشكل 4. ربط صمام لتدفق الغرفة. أ) صمام الملف اللولبي الإلكترونية يسمح التبديل بين اثنين برميل حقنة تحتوي إما خلايا أو وسائل الإعلام مع عمليا أي الفضاء الميت. B) مرة واحدة صمام يتم مسح ويتم تعيين اثنين من البراميل تصل، أنابيب السيليكون من صمام متصلة غرفة التدفق. فمن الأهمية بمكان أن عند توصيل محول على أنابيب السيليكون إلى ميناء على غرفة تدفق هناك واجهة السائل / السائل. &lt;وأ href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; الهدف = &quot;_blank&quot;&gt; اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> الرقم 5. قياس مجموع الالتزام الكرية البيضاء. خلال آخر دقيقتين من الخطوة بلعة غسل العازلة (كما هو موضح في البروتوكول)، ينبغي تسجيل ما لا يقل عن عشرة حقول عشوائي. هذه يمكن تحليلها خارج الخط ويمكن الاعتماد على العدد الكلي للخلايا ملتصقة بقوة في كل حقل. التصاق مجموع كريات الدم البيضاء يمكن مقارنة بين غرف التحكم وتلك سابقة التجهيز مع منع الأجسام المضادة، وهنا نعرض حقل ممثل عن شريحة تحكم وشريحة سابقة التجهيز مع التصاق الخلايا جزيء-1 (ICAM-1) منع الأجسام المضادة. تم إضافة الأسهم لتسليط الضوء على الكريات البيض ملتصقة في التمثيلTIVE حقل من الشريحة السيطرة هناك ما مجموعه 25 الكريات البيض التي تم تحديدها وفي كتلة الشريحة ICAM-1 وهناك ما مجموعه 13 الكريات البيض التي تم تحديدها. أشرطة النطاق = 100 ميكرومتر. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> . <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> الرقم 6. ويمكن أيضا تحليل نمط الكرية البيضاء على التصاق الطبقات الوحيدة البطانية التي كتبها النقيض من المرحلة المجهري. تحليل غير متصل حقول سجلت استخدامها لدراسة اتجاه وسرعة الكرية البيضاء الالتصاق. خطوات محددة من تتالي التصاق يمكن تصور وكميا باستخدام التصوير النقيض المرحلة. المرحلة الخلايا مشرق التي هي ملتصقة بقوة ولكن لا يمكنهم أن توصف التصاق &#39;جولة&#39;، والخلايا التي هي تنشيطد والمرحلة مشرق يمكن أن يطلق عليه &quot;تغيير شكل&quot; والخلايا التي هي مرحلة مظلمة هي الخلايا التي خضعت الهجرة transendothelial ويمكن أن يطلق عليه &quot;هاجر&quot;. يظهر الصورة أمثلة من كل نمط من الالتصاق. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر</a> .

Watch this Scientific Journal Video about A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress at JoVE.com

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد يحدث داخل القنوات المتخصصة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية الكبدي فريدة من نوعها. المرحلة المجهر النقيض من التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية كبدي تحت ظروف إجهاد القص الفسيولوجية يمكن أن يسهل توضيح الآليات الجزيئية التي تكمن وراء هذه العملية.

تدفق التصاق الفحص لدراسة توظيف الكرية البيضاء لالكبدي الإنسان جيبية البطانة Endothelium تحت ظروف إجهاد القص

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

a-flow-adhesion-assay-to-study-leucocyte-recruitment-to-human-hepatic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.2K Views.  University of Birmingham.  التوظيف الكرية البيضاء إلى الكبد يحدث داخل القنوات المتخصصة من الجيوب الكبدية التي تصطف من قبل الخلايا البطانية الجيبية الكبدي فريدة من نوعها. المرحلة المجهر النقيض من التوظيف عبر الكرية البيضاء البشرية البطانة الجيبية كبدي تحت ظروف إجه?...

Video: A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

التصوير التصاق كريات بيضاء لبطانة الأوعية الدموية في الضغط داخل اللمعة السامية

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

عزل خلايا الإنسان الوريد السري غشائي واستخدامها في دراسة التهجير تحت ظروف تدفق العدلات

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

على<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة عدم تجانس التمايز بلعم الإنسان والاستقطاب

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

كمي<em&gt; في المختبر</em&gt; الفحص لقياس التصاق العدلات إلى تنشيط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة الإنسان الأساسية بموجب الشروط ثابت

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

غرفة تدفق العدلات الإنسان التصاق الفحص

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

ثابت التصاق الفحص لدراسة إنتغرين تنشيط الخلايا اللمفية تي في

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

A Simple and Rapid Protocol to Non-enzymatically Dissociate Fresh Human Tissues for the Analysis of Infiltrating Lymphocytes

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted as an important hallmark of cancer. Our research on breast cancer focuses on the active role that tumor infiltrating lymphocytes play in tumor progression and patient outcome. Toward this goal, we developed a methodology for the rapid isolation of intact lymphoid cells from normal and abnormal tissues in an effort to evaluate them proximate to their native state. Homogenates prepared using a mechanical dissociator show both increased viability and cell recovery while preserving surface receptor expression compared to enzyme-digested tissues. Furthermore, enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells indicating that quantitative and qualitative measurements in the primary homogenate likely genuinely reflect infiltrating subpopulations in the tissue fragment. The lymphoid cells in these homogenates can be easily characterized using immunological (phenotype, proliferation, etc.) or molecular (DNA, RNA and/or protein) approaches. CD45+ cells can also be used for subpopulation purification, in vitro expansion or cryopreservation. An additional benefit of this approach is that the primary tissue supernatant from the homogenates can be used to characterize and compare cytokines, chemokines, immunoglobulins and antigens present in normal and malignant tissues. This protocol functions extremely well for human breast tissues and should be applicable to a wide variety of normal and abnormal tissues.

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

The ability of malignant cells to evade the immune system, characterized by tumor escape from both innate and adaptive immune responses, is now accepted ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

في المختبر والمجراة نموذج لدراسة التصاق البكتيريا إلى سفينة ستريت تحت ظروف التدفق

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...