SS es financiado por una Beca Clínica Wellcome Trust Intermedio, CW por un Fiduciario del Programa de Beca Wellcome.

1. Preparación MicroSlide <ol><li> Precapa un MicroSlide de seis canales con cola de rata colágeno de tipo I (RTC, diluido 1:100 en PBS dando una dilución de trabajo de 220 g / ml). Esto se realiza mediante la inyección de 30 l de solución diluida de RTC directamente en los canales e incubando durante 2 horas a 37 ° C, seguido de tres lavados con PBS. </li></ol> 2. La siembra de células en microportaobjetos <ol><li> Disociar un matraz T75 confluente de células hepáticas humanas cultivadas endoteliales sinusoidales (HSEC) (aislado a partir de tejido de hígado como se ha descrito previamente 13) en tripsina-EDTA, lavar en PBS, y se resuspende en 3 x 10 6 células / ml en medio completo (endotelial humana medios basal suplementada con mM de L-glutamina 2, 100 U / ml de penicilina y estreptomicina 100μg/ml, 10% inactivado por calor suero AB humano, 10 ng / ml de factor de crecimiento endotelial vascular y 10 ng / ml de factor de crecimiento de hepatocitos). Inyectar 30 l de suspensión celular nefastasctly en cada canal. </li><li> Deja células se adhieran durante 1 hora en un incubador humidificado a 37 ° C con una atmósfera de CO2 al 5% en una parrilla corrediza. Después de permitir que las células se adhieran a llenar los puertos en cada lado de cada canal con medio completo (Figura 1). </li></ol> 3. Citoquinas estimulación de las células <ol><li> Deja las células en una incubadora durante 24 horas. Evaluar el crecimiento de células usando un microscopio de contraste de fase invertida. 24 horas antes del ensayo de adhesión, estimular las monocapas endoteliales con citoquinas mediante la sustitución de los medios de cultivo con medio completo suplementado por el factor de necrosis tumoral alfa y el interferón gamma, tanto a 10 ng / ml. </li></ol> 4. Aislamiento de linfocitos de sangre periférica <ol><li> Aislar los linfocitos de sangre periférica de sangre completa mediante la purificación de la fracción mononuclear inicialmente por centrifugación en gradiente de densidad sobre un medio de centrifugación de separación de células apropiada durante 25 min a 800x g. Se incuban las células en el plástico durante 1 hora para permitir la adherencia de los monocitos. </li><li> Después de la adhesión a plástico aspirado de la enriquecida con linfocitos sobrenadante. Lavar los linfocitos y resuspender ellos (típicamente 1 x 10 6 células / ml en medio de flujo (medios basales endoteliales que contienen 0,1% (v / v) de albúmina de suero bovino (BSA)). </li></ol> 5. El tratamiento previo de endotelio o leucocitos con inhibidores <ol><li> Preparar las diluciones recomendadas de anticuerpos de función de bloqueo o de inhibidores de moléculas pequeñas en media/0.1 endotelial% (v / v) de BSA. Reemplazar medio completo con solución de bloqueo de anticuerpo / inhibidor en el canal elegido MicroSlide 30 min antes de ensayo de flujo. </li><li> Cuando se han previsto pretratamiento de los receptores de quimioquinas en linfocitos, leucocitos aislados resuspender en solución RPMI que contenía 0,1% (v / v) de BSA y se incuban con 200 ng / ml de toxina pertussis para bloquear la actividad de receptores acoplados a proteína G de los receptores de quimioquinas; alternativamente diluir específica funciónanticuerpos bloqueantes o inhibidores de molécula pequeña de receptores de quimioquinas en la dilución recomendada. Incubar leucocitos a 37 ° C durante 30 min, a continuación, lavar y resuspender en medio de flujo. </li></ol> 6. Configuración de flujo del sistema de ensayo <ol><li> Precalentar una cámara transparente controlado por termostato a 37 ° C. La cámara debe tener puertos para la inserción de tubo de silicona y de alimentación electrónica para una válvula de solenoide electrónico que permite la conmutación entre las células y los medios de comunicación con prácticamente ningún volumen muerto. La cámara está montada en un microscopio invertido para permitir que la microscopía de contraste de fase. Figura 2 muestra la cámara de ensayo de flujo y microscopio y MicroSlide colocado en la platina del microscopio. </li><li> Prellenado una jeringa de vidrio de 50 ml con un cierre luer con 10 ml de agua destilada estéril y adjuntar una longitud de tubo de silicona de 25 cm del puerto de jeringa. Inserte en una bomba de jeringa. Alterar la velocidad de retirada de la bomba de jeringa de acuerdo con lalas instrucciones del fabricante MicroSlide para mantener una tensión de cizalla de 0,05 Pa (0,5 dinas / cm 2, Figura 3). </li><li> Tome dos jeringas de 5 ml, deseche los émbolos y adjuntar los barriles a los dos puertos de flujo de una válvula de solenoide electrónico utilizando un tubo de silicona. <ol><li> Adjuntar 12 cm de tubo de silicona a la válvula de flujo de salida. La válvula permite la alternancia entre un tampón libre de células de lavado (media/0.1 endotelial% (v / v) de BSA) y la suspensión de linfocitos. </li><li> Limpie la válvula de solenoide electrónico mediante la inserción de tampón de lavado en los dos cilindros de jeringas y la garantía de búfer está fluyendo desde un barril a través de la válvula y en el tubo de silicona de flujo de salida. </li><li> Utilice el interruptor de la válvula para alternar a la otra barril y garantizar el tampón está fluyendo y que todas las burbujas se eliminan del sistema. Retirar el tampón de lavado de uno de los barriles y reemplazar con suspensión de linfocitos Figura 4a. </li></ol></li><li> Conecte el tubin siliconag de la bomba de jeringa a un puerto de un canal microportaobjetos elegido a través de un adaptador de microportaobjetos. A continuación, conecte el tubo de silicona de la válvula de salida al puerto opuesto a través de un adaptador de microportaobjetos. Asegúrese de que el tubo de silicona y los adaptadores están llenos de tampón de lavado antes de la conexión para evitar las burbujas de aire que entra en el sistema (Figura 4b). </li><li> Una vez conectado al sistema de flujo, coloque el microportaobjetos en la platina del microscopio y fije con cinta adhesiva o clips para evitar el movimiento. Ajuste el microscopio con el objetivo 10X junto con la configuración de la fase correspondiente. Asegúrese de que la monocapa endotelial se visualiza como en enfoque utilizando la lente ocular. Asegurar que las imágenes pueden ser capturadas a través de una cámara que está unida al microscopio mediante el cual las imágenes pueden ser transmitidas a un monitor y se registran. </li></ol> 7. Flujo técnica de ensayo y grabación de Adhesión para el Análisis <ol><li> Perfundir la capa endotelial con tampón de lavado durante 2 min iniciando withdrawal de la bomba de jeringa para eliminar cualquier residuo o anticuerpo bloqueante unido y luego cambiar la válvula para permitir a 5 min bolo de solución de leucocitos en una tensión de cizallamiento constante de 0,05 Pa. </li><li> Durante los últimos 2 minutos del bolo de leucocitos, grabar 10 campos al azar a lo largo de la longitud de la microportaobjetos. Esto permite análisis fuera de línea de linfocitos balanceo / tethering en la monocapa endotelial. Registre cada campo durante aproximadamente 10 segundos antes de pasar a la siguiente y asegúrese de que las grabaciones se hacen en contra de la dirección del flujo para evitar el registro de la misma célula de laminación dos veces en rápida sucesión. </li><li> Siga el bolo de leucocitos con un bolo de 5 min de tampón de lavado mediante la devolución de la válvula a su posición inicial. Durante el final de 2 min de este bolo llevar a cabo una segunda fase de grabación por la elección de al menos 10 campos seleccionados al azar a lo largo de la longitud de la MicroSlide. Registre cada campo durante unos 5 segundos antes de pasar a la siguiente y asegurarse de que la monocapa endotelial y leucoc adherenteytes están en foco claro. Esto permite análisis fuera de línea del patrón de la adhesión. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. 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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia

El paso más crítico para llevar a cabo con éxito un ensayo de flujo es asegurar que una monocapa sana y confluente de células endoteliales está listo antes de que el ensayo de adhesión de flujo. Células endoteliales primarias pueden ser difíciles de cultivar y sensibles a las alteraciones en los métodos de cultivo. Es importante que 1) cámaras de flujo están de manera adecuada y uniformemente recubiertas con células endoteliales en una monocapa; para HSEC usamos rata colágeno de tipo I, pero esta cola pueden ser diferentes para otras poblaciones endoteliales, 2) medio de cultivo es adecuado para el tipo de célula, para HSEC hemos descrito nuestro medio completo en la sección de protocolo. Otros pasos vitales incluyen el establecimiento de la bomba de jeringa a la velocidad apropiada para reflejar los niveles fisiológicos de esfuerzo de corte. Durante el ensayo de flujo es necesario para evitar burbujas de aire dentro del circuito de flujo que puede dañar la monocapa endotelial o de tiras de las células inmunes de la superficie endotelial. Esto se puede evitar por la norma ENsuring que todos los tubos y adaptadores de silicona son perfundidos con tampón de lavado antes de la conexión, que todas las burbujas de aire se eliminan y los medios de comunicación que se precalentaron antes de su uso. Al conectar los adaptadores a los puertos en el MicroSlide es muy importante que haya una interfaz de líquido / líquido durante la conexión, si hay alguna aire entonces esto va a formar un espacio de aire dentro del sistema que perturbar la monocapa endotelial durante la retirada de la jeringa paso. La solución de leucocitos en el cuerpo de la jeringa necesita agitación regular para asegurar que las células no se establecen, manteniendo así una densidad celular constante durante todo el experimento. Durante los pasos de grabación que es importante para garantizar que la imagen de la capa endotelial está adecuadamente enfocada y clara para permitir el análisis fuera de línea precisa, y que durante la segunda etapa del ensayo de flujo (mensaje de leucocitos en bolo) se deja que el tiempo suficiente durante el tampón de lavado fase antes de la grabación se reanudó para asegurar quese eliminan todos los leucocitos adherentes. Del mismo modo es esencial utilizar las células endoteliales en una monocapa de densidad adecuada para evitar la pérdida de las células que pueden interferir con los patrones de flujo en los capilares estrechos y también puede ser difícil de diferenciar de leucocitos adherentes más grandes bajo microscopía de contraste de fase. Hemos descrito la densidad óptima de siembra para las células endoteliales sinusoidales hepáticas humanas, pero esto puede variar entre diferentes poblaciones y especies endoteliales. Se han logrado avances significativos en el estudio de reclutamiento de leucocitos en modelos animales con microscopía intravital. La principal ventaja del método de ensayo de adhesión de flujo es que el reclutamiento de leucocitos puede ser estudiada en un sistema binario con células endoteliales humanas primarias. Además, estas interacciones pueden ser estudiados bajo niveles fisiológicos relevantes de la tensión de cizallamiento. Es importante para confirmar los resultados de los estudios en animales intravital con los sistemas celulares humanos ya que puede haber diferees en las propiedades endoteliales entre las especies. Una de las limitaciones del ensayo de flujo es que el reclutamiento de leucocitos se está estudiando en un entorno unicelular de la monocapa endotelial. Además una vez que los leucocitos se han adherido y transmigrado a través del endotelio que pueden no estar en presente en número suficiente para ser aislado y sometido a procesos posteriores. A pesar de estas limitaciones, una vez que el ensayo de adhesión flujo se ha dominado, se puede desarrollar para llevar a cabo un análisis más detallado de la cascada de adhesión de leucocitos y adaptado para recapitular un entorno multicelular. Grabación prolongada de campos individuales y el uso de software de seguimiento se puede utilizar para analizar el comportamiento de rastreo de los leucocitos. Además al finalizar el ensayo de flujo de los micro-portaobjetos pueden ser interrogados mediante microscopía confocal de barrido láser y el etiquetado de inmunofluorescencia para estudiar la adhesión y la transmigración en más detalle. Además, hemos desarrollar previamenteed un modelo in vitro, donde los leucocitos que fluyen podrían interactuar con endotelio hepático condicionada por la presencia de hepatocitos. Este ensayo también puede ser desarrollado para estudiar las subpoblaciones de leucocitos: nuestro grupo ha realizado estudios con subconjuntos tales como células reguladoras T, células B, y leucocitos de hígado infiltrante. Estos estudios son evidencia de que el ensayo de adhesión de flujo es una poderosa herramienta para estudiar el reclutamiento de leucocitos general y específica de órganos en los sistemas humanos.

Está bien establecido que el reclutamiento de leucocitos en general sigue el paradigma de la cascada de adhesión de varios pasos 1. Esto implica la captura de leucocitos de la sangre que fluye por las células endoteliales que recubren la pared del vaso. Inicialmente, los leucocitos se someten a una etapa de laminación que está mediada por selectina o los receptores de los miembros de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Esto permite que los receptores acoplados a proteína G (GPCRs) expresados ​​en la superficie de leucocitos para ser activados por quimiocinas presentados en el glicocálix endotelial. Esto conduce a la alteración de la confirmación de la integrina a un estado de &quot;alta afinidad&quot; en la superficie de leucocitos y el arresto y la firma de adhesión al endotelio. Adherencia firme es seguido por un cambio de forma y de rastreo del leucocito en el buque. El paso final es la transmigración a través de la monocapa endotelial, que puede ocurrir a través de paracelular o transcelular rutas. Mientras que la cascada de adhesión de varios pasos describirs el mecanismo general de reclutamiento de leucocitos en el cuerpo hay diferencias específicas de órganos. En el hígado la mayoría de reclutamiento de leucocitos se produce dentro de los sinusoides hepáticos en contraste con otros órganos donde el reclutamiento generalmente se produce dentro de las vénulas post-capilares 2. Los sinusoides hepáticos son un entorno de baja cizalladura y leucocitos sufren un breve paso tethering con anterioridad a la adhesión firme que se selectina independiente 2. Estos canales están revestidos por el endotelio sinusoidal hepático que es discontinua y contiene fenestras, poros abiertos 100-200 nm de diámetro, y carecen de una membrana basal 3. Elucidar los mecanismos moleculares que median el reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano podría identificar de órganos dianas terapéuticas específicas para las enfermedades inflamatorias del hígado. Ensayos de adhesión de flujo son herramientas esenciales en el estudio de reclutamiento de leucocitos. Ellos permiten la reconstrucción de recru leucocitositment en presencia de la tensión de cizallamiento para analizar la adherencia bajo fuerzas bien definidos. El uso más frecuente para el ensayo es la adherencia de leucocitos estudio a monocapas endoteliales cultivadas o sustratos purificados. Cámaras de flujo comercialmente disponibles se utilizan para perfundir células bajo condiciones de flujo laminar entre dos superficies planas y luego visualizar el proceso dinámico de la adhesión en un microscopio 4. Grupos anteriores han demostrado que ciertas interacciones adhesivas sólo tienen lugar bajo flujo y no pueden ser estudiados en ensayos estáticos 5,6. Hemos utilizado esta técnica para recapitular los sinusoides hepáticos y estudiar el reclutamiento de leucocitos en condiciones de baja tensión de cizallamiento. HSEC humana primarios se cultivaron en microportaobjetos y leucocitos puede entonces ser perfundido más de esta monocapa a una velocidad de flujo calculado para reproducir el esfuerzo cortante dentro de los sinusoides hepáticos. La tensión de cizallamiento es una tensión que se aplica en paralelo o tangencial a una superficie como OPPosed al estrés normal, que es perpendicular. Cualquier líquido que se mueve a lo largo de una frontera ejercerá una tensión de corte en esa frontera. El esfuerzo cortante ha demostrado ser un componente esencial de la transmigración de linfocitos 7. En estas condiciones, cada paso de la cascada de adhesión puede ser visualizada por microscopía de contraste de fase. Este método ha permitido importantes conocimientos sobre el reclutamiento de leucocitos dentro del hígado incluyendo el estudio de moléculas de adhesión convencionales 8, el papel de las quimioquinas y receptores de quimioquinas 9-11, y moléculas de adhesión atípicos tales como la proteína de adhesión vascular 1 (VAP-1 ) 8,12 y linfática común y endotelial vascular receptor-1 (Clever-1) 13. Mientras que este ensayo ha sido mencionado en varias de las publicaciones de nuestro Grupo, su descripción ha sido breve y hemos aprovechado esta oportunidad para ofrecer un detallado paso a paso guía para ayudar en la solución de problemas y prevenir errores técnicos cuando intentoción del ensayo. Además, se ha cambiado recientemente la compra de componentes de las cámaras MicroSlide que permite modificaciones precisas en el estrés de cizalla. Creemos que esto amplía la aplicabilidad del ensayo a otras células endoteliales e inmunes. El siguiente método describe la preparación y la técnica para llevar a cabo un ensayo de adherencia basado en el flujo con células sinusoidales hepáticas humanas endoteliales y linfocitos de sangre periférica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

La infiltración de leucocitos en el tejido de hígado humano es un proceso común en todas las enfermedades inflamatorias del hígado adultas. Infiltración crónica puede conducir al desarrollo de la fibrosis y la progresión a cirrosis. La comprensión de los mecanismos moleculares que median el reclutamiento de leucocitos hacia el hígado podría identificar dianas terapéuticas importantes para la enfermedad hepática. La interacción clave durante el reclutamiento de leucocitos es la de las células inflamatorias con endotelio en condiciones de estrés de cizallamiento. El reclutamiento para el hígado se produce dentro de los canales de cizallamiento bajas de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas (HSEC). Las condiciones dentro de los sinusoides hepáticos pueden recapitulan perfundiendo leucocitos a través de canales revestidos por monocapas HSEC humanos con caudales específicos. En estas condiciones leucocitos se someten a un breve paso inmovilización seguido por la activación y adhesión firme, seguido de una etapa de rastreo y la posterior transmigración a través de la endotelialcapa. Usando microscopía de contraste de fases, cada paso de este &quot;cascada de adhesión&quot; se puede visualizar y grabó seguido de análisis fuera de línea. Las células endoteliales o los leucocitos pueden ser tratados previamente con inhibidores para determinar el papel de las moléculas específicas durante este proceso.

Este ensayo tiene la capacidad de visualizar la cascada de adhesión de varios pasos de flujo y elucidar los mecanismos moleculares subyacentes mediante la comparación de los resultados de los experimentos de control para aquellos con inhibidores moleculares. Varios lechos vasculares se pueden recapitulan mediante la incorporación de células endoteliales específicos y la alteración de las condiciones de estrés de cizallamiento. Cada paso de la cascada de adhesión puede ser analizada fuera de línea, siguiendo el método de grabación se indica en el protocolo. El primer paso de la cascada de adhesión es la rodadura de leucocitos que pueden ser expresadas como un porcentaje del total de células adherentes. Análisis Desconectado permite que el número de células adherentes que se enumeró en cada campo registrada durante el bolo de leucocitos. La reproducción de la imagen permite la comparación de las células que están firmemente adheridas y los que están experimentando un movimiento de balanceo a través del endotelio. Movimiento de balanceo puede ser visualizado utilizando esta técnica, cada campo se graba durante al menos 10 seg. Células de laminación se identifican por su reducida velocidad sobre la superficie endotelial en comparación con las células que fluye. Este comportamiento se debe demostrar por lo menos durante 5 segundos y sin desprendimiento. La cascada de adhesión dentro de los sinusoides hepáticos se lleva a cabo en un entorno de bajo cizallamiento y en estudios in vivo han confirmado mínima de rodadura con sólo una breve etapa de inmovilización. Hemos confirmado que el ensayo de flujo refleja el entorno de los sinusoides hepáticos mediante la demostración de que menos del 10% de los leucocitos adherentes persistentemente rodar sobre estimulado HSEC en estos ensayos. El siguiente paso de la cascada de adhesión es la adhesión firme. La adhesión total puede calcularse a partir de la segunda etapa de grabación durante el bolo de tampón de lavado (paso 7.3). Análisis Desconectado permite que el número total de células firmemente adherentes que se cuentan en cada campo (Figura 5). Las células firmemente adherentes se definen como células que son estacionaria o shapechanged con el comportamiento de rastreo lento.El número medio de células por campo puede entonces calcularse. Esta figura a continuación, se puede utilizar, en combinación con el área de superficie total del campo de vista (determinado usando una retícula o equivalente), concentración de linfocitos (típicamente 1 x 10 6 células / ml) y la tasa de flujo para expresar el grado de la adhesión de linfocitos como células adherentes / mm 2/10 6 células perfundido. Estudiar el patrón de adhesión implica el análisis de los dos últimos pasos de la cascada de adhesión que incluye cambio de forma, el rastreo y la migración transendotelial. Los leucocitos adherentes a la superficie superior de la monocapa de HSEC aparecen en fase brillante, mientras que los que han migrado a través de la monocapa aparece fase de oscuridad (Figura 6). Las células pueden ser clasificados como exhibiendo adhesión &quot;estático&quot; (nonmigrated / vuelta), morfología &#39;forma-changed&#39; o como &#39;migra&#39; y categorías individuales se expresan como un porcentaje de lapoblación total del adhesivo. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Figura 1. Monocapa de células hepáticas humanas primarias endoteliales sinusoidales dentro de la cámara de flujo. A) microportaobjetos llenos de medio que contiene monocapa de células endoteliales antes del comienzo de. B) Imagen de contraste de fase de confluente endotelial monocapa flujo ensayo de adhesión, las células endoteliales deben ser sembradas en MicroSlide que han sido pre-revestido (para las células endoteliales hepáticas humanas esto debería ser con colágeno tipo cola de rata 1) y es esencial que las células endoteliales son saludables en la cultura y confluente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; Figura 2. Flujo cámara de ensayo. Una cámara de ensayo de flujo de configuración se puede ver aquí, que consiste en una cámara transparente que está montada en un microscopio invertido. Un calentador se coloca en la cámara y debe ser controlada por termostato para mantener una temperatura de 37 ° C. No debe haber puertos disponibles para conectar un tubo de silicona de una MicroSlide dentro de la cámara a una bomba de jeringa que se encuentra fuera. El microportaobjetos se coloca directamente sobre la platina del microscopio. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> Figura 3. La jeringa de la bomba. Una bomba de jeringa es conectared a través de tubo de silicona a la cámara de flujo. La bomba está ajustada a una tasa de retirada específica en función de la tensión de corte deseada requerida para el ensayo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> Figura 4. Conexión de la válvula a la cámara de flujo. A) una válvula de solenoide electrónica permite la conmutación entre dos cuerpos de jeringa que contienen cualquiera de las células o los medios de comunicación con prácticamente ningún espacio muerto. B) Una vez que la válvula se vacía y los dos barriles están configurados, el tubo de silicona de la válvula está conectado a la cámara de flujo. Es muy importante que cuando se conecte el adaptador en el tubo de silicona para el puerto de la cámara de flujo existe una interfase líquido / líquido. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver la imagen más grande. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> Figura 5. Medición de la total adhesión de leucocitos Durante los últimos dos minutos del paso del bolo tampón de lavado (como se indica en el protocolo), un mínimo de diez campos aleatorios debe ser registrada.. Estos se pueden analizar fuera de línea y el número total de células firmemente adherentes se pueden contar en cada campo. La adhesión total de leucocitos se puede comparar entre las cámaras de control y los tratados previamente con anticuerpos de bloqueo, aquí se muestra un campo de representante de una corredera de control y una diapositiva pretratado con molécula de adhesión intracelular-1 (ICAM-1) de bloqueo de anticuerpos. Las flechas se han añadido para resaltar los leucocitos adherentes, en la representacióntiva campo de la corredera de control hay un total de 25 leucocitos identificado y en el ICAM-1 diapositiva bloque hay un total de 13 leucocitos identificados. Las barras de escala = 100 micras. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver la imagen más grande</a> . <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> Figura 6. Análisis del patrón de adhesión de leucocitos sobre monocapas endoteliales por microscopía de contraste de fase. Desconectado análisis de los campos grabados también se puede utilizar para estudiar la dirección y velocidad de adhesión de leucocitos. Los pasos específicos de la cascada de adhesión se pueden visualizar y cuantificar el uso de imágenes de contraste de fase. Brillante células de fase que son firmemente adherente pero no activado se puede llamar la adhesión &quot;ronda&quot;, las células que se activand y la fase luminosa se puede llamar &quot;forma cambiado&quot; y las células que son oscuras fase son las células que han sido sometidos a la migración transendotelial y puede denominarse &#39;migrado&#39;. La imagen muestra ejemplos de cada patrón de adhesión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande</a> .

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso.

Un ensayo de adhesión de flujo para estudiar Leucocyte Reclutamiento para hepático humano sinusoidales endotelio en condiciones de estrés de cizalla

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.3K vistas.  University of Birmingham.  El reclutamiento de leucocitos en el hígado se produce dentro de los canales especializados de los sinusoides hepáticos que se alinean por las células endoteliales sinusoidales hepáticas únicas. Microscopía de contraste de fase de reclutamiento de leucocitos a través del endotelio sinusoidal hepático humano en condiciones de tensión de cizallamiento fisiológica puede facilitar la elucidación de los mecanismos moleculares que subyacen a este proceso. 

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Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imágenes de la adhesión de leucocitos al endotelio vascular en la presión intraluminal de alta

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Investigación

Inmunología e Infección

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

La introducción de la tensión de cizallamiento en el Estudio de la adhesión bacteriana

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Aislamiento de células endoteliales de vena umbilical y su uso en el Estudio de la transmigración de neutrófilos bajo condiciones de flujo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Un<em&gt; In vitro</em&gt; Modelo para estudiar la heterogeneidad de diferenciación de los macrófagos humanos y polarización

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Cuantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensayo para medir la adhesión de neutrófilos al Activado Primaria células endoteliales microvasculares humanas en condiciones estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Ensayo de adhesión de neutrófilos Cámara de flujo humano

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Ensayo de adherencia estática para el Estudio de la integrina activación en linfocitos T

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro e in vivo modelo para estudiar la adhesión bacteriana a la pared del recipiente en condiciones de flujo

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Ensayo de adhesión en condiciones de estrés de cizalla para el Estudio de linfocitos T-molécula de adhesión Interacciones

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...