SS wird durch ein Wellcome Trust Zwischen Clinical Fellowship, CW durch ein Wellcome-Trust-Programm Zuschuss finanziert.

1. Mikroobjekt Vorbereitung <ol><li> Vorstrich ein Sechskanal-Mikroobjekt mit Rattenschwanz-Kollagen Typ I (RTC, in PBS 1:100 verdünnt geben eine Arbeitsverdünnung von 220 pg / ml). Dies wird durch Einspritzen von 30 &amp;mgr; l verdünnt RTC-Lösung direkt in die Kanäle und Inkubation für 2 h bei 37 ° C, gefolgt von drei Waschungen mit PBS durchgeführt. </li></ol> 2. Seeding Zellen in Mikroobjekt <ol><li> In Trypsin-EDTA dissoziiert einer konfluenten T75-Flasche von kultivierten humanen hepatischen sinusoidalen Endothelzellen (HSEC) (aus Lebergewebe isoliert, wie zuvor beschrieben, 13), Waschen mit PBS und Resuspendieren in 3 × 10 6 Zellen / ml in Komplettmedium (human endothelial Grundmedium mit 2 mM L-Glutamin, 100 U / ml Penicillin und 100μg/ml Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertes AB Humanserum, 10 ng / ml vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor und 10 ng / ml an Hepatozyten-Wachstumsfaktor) supplementiert. Spritzen Sie 30 ul Zellsuspension directly in jeden Kanal. </li><li> Lassen Zellen für 1 Stunde in einem befeuchteten Inkubator bei 37 anhaften ° C mit 5% CO 2-Atmosphäre auf einer Folie Rack. Nachdem die Zellen anhaften zu füllen die Ports auf jeder Seite jedes Kanals mit Vollmedium (Fig. 1). </li></ol> 3. Cytokin-Stimulation von Zellen <ol><li> Lassen Zellen in Inkubator für 24 Stunden. Bewerten Zellwachstum mit einem inversen Phasenkontrastmikroskop. 24 Stunden vor dem Adhäsionstest, Stimulation der endothelialen Monoschichten mit Cytokin durch Austausch des Wachstumsmediums mit Vollmedium von Tumor-Nekrose-Faktor alpha und Interferon-gamma ergänzt, die beide bei 10 ng / ml. </li></ol> 4. Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut <ol><li> Isolierung von Lymphozyten aus peripherem Blut Vollblut durch anfängliches Reinigen der einkernigen Fraktion durch Dichtegradientenzentrifugation über eine geeignete Zelltrennmittel Zentrifugation für 25 min bei 800x g. Die Zellen auf Kunststoff für 1 h inkubiert, um die Einhaltung von Monozyten zu ermöglichen. </li><li> Nach Einhaltung der Kunststoff absaugen Lymphozyten angereicherten Überstand. Waschen der Lymphozyten und resuspendieren sie (üblicherweise 1 x 10 6 Zellen / ml in Strömungsmedium (Endothelial Basal Medium, enthaltend 0,1% (v / v) Rinderserumalbumin (BSA)). </li></ol> 5. Vorbehandlung von Endothel oder Leukozyten mit Inhibitoren <ol><li> Vorbereitung empfohlenen Verdünnungen Funktion blockierende Antikörper oder niedermolekularen Inhibitoren der endothelialen media/0.1% (v / v) BSA. Ersetzen Sie Vollmedium mit blockierenden Antikörper / Inhibitor-Lösung in ausgewählten Mikroobjekt Kanal 30 min vor Test fließen. </li><li> Wobei die Vorbehandlung von Chemokin-Rezeptoren auf Lymphozyten sind geplant, resuspendieren isolierten Leukozyten in RPMI-Lösung, die 0,1% (v / v) BSA und Inkubation mit 200 ng / ml Pertussistoxin auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoraktivität von Chemokin-Rezeptoren blockieren, alternativ verdünnen spezifischen Funktionblockierenden Antikörpern oder niedermolekularen Inhibitoren von Chemokin-Rezeptoren bei den empfohlenen Verdünnung. Leukozyten Bei 37 ° C für 30 Minuten, dann waschen und resuspendieren in Strömungsmedium. </li></ol> 6. Setup-Flow-Testsystem <ol><li> Vorwärmen eine thermostatisch gesteuerte transparente Kammer 37 ° C. Die Kammer sollte Öffnungen zum Einführen Silikonschlauch und Elektronikversorgung für eine elektronische Schaltmagnetventil, das zwischen den Zellen und Medien können praktisch ohne Totvolumen. Die Kammer ist auf einem inversen Mikroskop, damit montiert Phasenkontrastmikroskopie. Fig. 2 zeigt die Strömungsanalysekammer und Mikroobjekt Mikroskop und auf dem Mikroskoptisch platziert. </li><li> Prefill eine 50 ml Glasspritze mit Luer-Lock mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser und legen eine Länge von 25 cm Silikonschlauch mit dem Spritzenkanal. Legen Sie in eine Spritzenpumpe. Verändern die Abzugsgeschwindigkeit des Spritzenpumpe nachAnweisungen des Herstellers Mikrodia einer Scherbelastung von 0,05 Pa (0,5 dyn / cm 2, Fig. 3) zu halten. </li><li> Nehmen Sie zwei 5-ml-Spritzen, entsorgen Sie die Kolben und befestigen Sie die Fässer mit den beiden in-Flussöffnungen eines elektronischen Magnetventil mit Silikonschlauch. <ol><li> Bringen 12 cm Silikonschlauch an den Abfluss Ventil. Das Ventil ermöglicht Wechsel zwischen einem zellfreien Waschpuffer (endothelial media/0.1% (v / v) BSA) und der Lymphozytensuspension. </li><li> Spülen der elektronischen Magnetventils durch Einsetzen Waschpuffer in beiden Spritzenzylinder und die Gewährleistung Puffer aus einem Zylinder durch das Ventil und in den Abfluss Silikonschlauch fließt. </li><li> Verwenden Sie den Ventilschalter auf die andere Trommel abwechselnd und sicherzustellen, dass die Puffer fließt und dass alle Luftblasen aus dem System entfernt. Entfernen Waschpuffer von einem der Fässer und ersetzen mit Lymphozytensuspension 4a. </li></ol></li><li> Schließen Sie das Silikon Tubing aus der Spritzenpumpe an einem Port eines ausgewählten Mikroobjektkanal über einen Mikroobjektteil. Dann verbinden Sie den Silikonschlauch von der Ablaufventil auf der gegenüberliegenden Hafen über einen Mikroobjektteil. Stellen Sie sicher, dass die Silikonschlauch und die Adapter mit Waschpuffer vor der Verbindung gefüllten Luftblasen in das System (Abbildung 4b) zu verhindern. </li><li> Einmal auf das Flusssystem angeschlossen, stellen Sie den Mikroobjekt auf dem Mikroskoptisch und bringen mit Clips oder Klebeband auf die Bewegung zu verhindern. Stellen Sie das Mikroskop auf die 10X-Objektiv zusammen mit der entsprechenden Phase-Einstellung. Sicherstellen, dass die endotheliale Monolayer visualisiert und Fokus mit der Augenlinse. Bilder sorgen kann über eine Kamera, die mit dem Mikroskop, wobei Bilder auf einem Monitor weitergeleitet und aufgezeichnet werden angebracht erfasst werden. </li></ol> 7. Flow-Assay-Technik und Aufzeichnung der Haftung für Analysis <ol><li> Perfundieren das Endothel mit Waschpuffer für 2 min von Beginn withdrawal der Spritzenpumpe, um jeglichen Schmutz oder ungebundenen Antikörper zu entfernen Sperrung und wechseln Sie dann das Ventil, um eine 5 min Bolus von Leukozyten-Lösung bei einer konstanten Wandschubspannung von 0,05 Pa ermöglichen </li><li> Während der letzten 2 min der Leukozyten-Bolus, notieren 10 Zufallsfelder entlang der Länge des Mikroobjekt. Dies ermöglicht die Offline-Analyse von Lymphozyten-Roll / Tethering auf dem Endothel-Monolayer. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 10 Sek., bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass Aufnahmen gegen die Strömungsrichtung der Aufnahme den gleichen Roll Zelle zweimal schnell hintereinander zu vermeiden. </li><li> Folgen der Leukozyten Bolus mit einem 5 min Bolus Waschpuffer durch Rückkehr des Ventils in seine Startposition. Während der letzten 2 Minuten des Bolus Durchführung einer zweiten Aufnahmephase durch die Wahl mindestens 10 zufällig ausgewählten Bereichen entlang der Länge des Mikroobjekt. Nehmen Sie jedes Feld für ca. 5 sec, bevor Sie zum nächsten und sicherzustellen, dass die endotheliale Monolayer und haft leucocytes sind in klaren Fokus. Dies ermöglicht die Offline-Analyse des Musters der Adhäsion. </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Wong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+minimal+role+for+selectins+in+the+recruitment+of+leukocytes+into+the+inflamed+liver+microvasculature.">A minimal role for selectins in the recruitment of leukocytes into the inflamed liver microvasculature.</a> Clin. Invest. , 2782-2790 (1997).</li><li>Braet, F., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+functional+aspects+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrae:+a+review.">Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review.</a> Compar. Hepatol. 1, 1 (2002).</li><li>Lawrence, M. B., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocytes+roll+on+a+selectin+at+physiologic+flow+rates:+distinction+from+and+prerequisite+for+adhesion+through+integrins.">Leukocytes roll on a selectin at physiologic flow rates: distinction from and prerequisite for adhesion through integrins.</a> Cell. 65, 859-873 (1991).</li><li>Finger, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+through+L-selectin+requires+a+threshold+hydrodynamic+shear.">Adhesion through L-selectin requires a threshold hydrodynamic shear.</a> Nature. 379, 266-269 (1996).</li><li>Lawrence, M. B., Kansas, G. S., Kunkel, E. J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Threshold+levels+of+fluid+shear+promote+leukocyte+adhesion+through+selectins+(CD62L,P,E).">Threshold levels of fluid shear promote leukocyte adhesion through selectins (CD62L,P,E).</a> J. Cell biol. 136, 717-727 (1997).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shear+forces+promote+lymphocyte+migration+across+vascular+endothelium+bearing+apical+chemokines.">Shear forces promote lymphocyte migration across vascular endothelium bearing apical chemokines.</a> Nat. Immunol. 2, 515-522 (2001).</li><li>Lalor, P. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+adhesion+protein-1+mediates+adhesion+and+transmigration+of+lymphocytes+on+human+hepatic+endothelial+cells.">Vascular adhesion protein-1 mediates adhesion and transmigration of lymphocytes on human hepatic endothelial cells.</a> J. Immunol. 169, 983-992 (2002).</li><li>Aspinall, A. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX(3)CR1+and+vascular+adhesion+protein-1-dependent+recruitment+of+CD16(+)+monocytes+across+human+liver+sinusoidal+endothelium.">CX(3)CR1 and vascular adhesion protein-1-dependent recruitment of CD16(+) monocytes across human liver sinusoidal endothelium.</a> Hepatology. 51, 2030-2039 (2010).</li><li>Curbishley, S. M., Eksteen, B., Gladue, R. P., Lalor, P., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CXCR+3+activation+promotes+lymphocyte+transendothelial+migration+across+human+hepatic+endothelium+under+fluid+flow.">CXCR 3 activation promotes lymphocyte transendothelial migration across human hepatic endothelium under fluid flow.</a> Am. J. Pathol. 167, 887-899 (2005).</li><li>Oo, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+CCR4+and+CXCR3+in+the+recruitment+and+positioning+of+regulatory+T+cells+in+the+inflamed+human+liver.">Distinct roles for CCR4 and CXCR3 in the recruitment and positioning of regulatory T cells in the inflamed human liver.</a> J. Immunol. 184, 2886-2898 (2010).</li><li>Weston, C. J., Shepherd, E. L., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+and+trafficking+of+vascular+adhesion+protein-1+as+revealed+by+an+N-terminal+GFP+fusion+protein.">Cellular localization and trafficking of vascular adhesion protein-1 as revealed by an N-terminal GFP fusion protein.</a> J. Neural Transm. , (2013).</li><li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium.">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> J. Immunol. 186, 4147-4155 (2011).</li></ol>

Die Autoren erklären, keine konkurrierenden finanziellen Interessen

Der kritischste Schritt für eine erfolgreiche Durchführung Flow-Assay wird sichergestellt, dass eine gesunde und konfluente Monoschicht von Endothelzellen bereit ist vor der Durchfluss Adhäsionstest. Primäre Endothelzellen schwierig, Kultur und sensibel auf Veränderungen in der Kultivierungsverfahren sein kann. Es ist wichtig, dass 1) Strömungskammern ausreichend und gleichmäßig mit endothelialen Zellen in einer Monoschicht beschichtet ist, für HSEC wir Rattenschwanzkollagen vom Typ I, aber dies kann für andere endotheliale Populationen unterscheiden, 2) Kulturmedium für die Zelltyp geeignet, für HSEC haben wir unsere Komplettmedium in der Protokoll-Abschnitt beschrieben. Weitere wichtige Schritte sind die Festlegung der Spritzenpumpe mit der entsprechenden Rate auf physiologische Werte der Scherspannung zu reflektieren. Während des Flow-Assay ist es notwendig, Luftblasen innerhalb des Strömungskreislaufs, der die endotheliale Monoschicht beschädigen oder Streifen Immunzellen aus dem Endothel Oberfläche zu verhindern. Dies kann durch en verhindert werdenSüring, dass alle Silikonschlauch und Adapter sind mit Waschpuffer vor der Verbindung durchblutet, dass alle Luftblasen entfernt werden und dass die Medien vor der Verwendung vorgewärmt. Wenn die Adapter an die Anschlüsse auf der Mikroobjekt ist es sehr wichtig, dass es eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche während der Verbindung, wenn es irgendeine Luft, dann wird dies einen Luftspalt innerhalb des Systems, die den endothelialen Monoschicht während der Spritze Rückzug stören wird auszubilden Schritt. Die Leukozyten-Lösung in den Spritzenzylinder regelmässige Bewegung zu gewährleisten, dass die Zellen sich nicht absetzen, wodurch die Aufrechterhaltung einer konstanten Zelldichte während des gesamten Experiments. Während der Aufzeichnungsschritte ist es wichtig, sicherzustellen, dass das Bild der endothelialen Schicht ausreichend scharf und klar, präzise Offline-Analyse zu ermöglichen, und dass während des zweiten Schritts des Flow-Assay (post Leukozyten-Bolus), dass genügend Zeit während des Waschpuffer übrig Phase vor der Aufzeichnung wieder aufgenommen wird, um sicherzustellen, dassAlle nicht-adhärenten Leukozyten entfernt werden. Ebenfalls ist es wichtig, Endothelzellen Verwendung in einer Monoschicht von geeigneter Dichte, um den Verlust von Zellen, die mit Strömungsmuster in engen Kapillaren stören können, zu verhindern und auch schwer aus größeren anhaftenden Leukozyten unter Phasenkontrastmikroskopie diskriminiert werden. Wir haben optimale Aussaatdichte für den menschlichen Lebersinus Endothelzellen beschrieben, aber das kann zwischen verschiedenen Populationen und Arten endothelialen variieren. Bedeutende Fortschritte bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung in Tiermodellen mit Intravitalmikroskopie gemacht worden. Der Hauptvorteil der Strömungshafttestverfahren ist, dass Leukozyten-Rekrutierung in einem binären System mit primären humanen Endothelzellen untersucht werden. Darüber hinaus können diese Wechselwirkungen unter physiologischen Ebenen in die Scherbeanspruchung untersucht werden. Es ist wichtig, Ergebnisse der Intravital-Studien an Tieren mit menschlichen Zellsysteme zu bestätigen, da es sein kann differences in Endothelzellen Eigenschaften zwischen den Arten. Eine der Einschränkungen des Flow-Assay ist, dass Leukozytenrekrutierung ist in einem einzelligen Umgebung der endothelialen Monoschicht untersucht. Darüber hinaus, wenn die Leukozyten haben halten und durch das Endothel transmigrierten sie nicht in ausreichender Zahl in den isoliert und nachgelagerten Prozessen unterzogen werden anwesend sein. Trotz dieser Einschränkungen, wenn die Strömungs Adhäsionstest bewältigt wurde sie entwickelt werden können, um eine weitere Analyse der Leukozytenadhäsion Kaskade durchzuführen und geeignet ist, einen multizellulären Umgebung zu rekapitulieren. Längerer Aufnahme von einzelnen Feldern und den Einsatz von Tracking-Software verwendet werden, um kriechen Verhalten der Leukozyten zu analysieren. Ferner nach Beendigung des Flow-Assay kann unter Verwendung der Mikroobjekt konfokalen Laserrastermikroskopie und Immunfluoreszenz-Markierung zur Adhäsion und Trans genauer zu untersuchen abgefragt werden. Zusätzlich entwickeln wir bereits habened ein in vitro-Modell, bei dem fließenden Leukozyten konnte mit Leber Endothel durch die Anwesenheit von Hepatozyten Anlage interagieren. Dieser Test kann auch entwickelt, um Subpopulationen von Leukozyten zu untersuchen: hat unsere Gruppe mit Teilmengen, wie regulatorische T-Zellen, B-Zellen und Leber infiltrieren Leukozyten durchgeführten Studien. Diese Studien belegen, dass die Strömung Haftung Assay ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur allgemeinen und organspezifische Leukozytenrekrutierung in menschlichen Systemen zu studieren.

Es ist nun bekannt, dass Leukozytenrekrutierung im Allgemeinen folgt dem Paradigma der mehrstufigen Kaskadenhaftung ein. Dies beinhaltet die Erfassung von Leukozyten aus Blut fließt durch Endothelzellen der Gefäßwand. Zunächst Leukozyten durchlaufen einen Walzschritt, der durch Selektin-Rezeptoren oder Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie vermittelt wird. Dies ermöglicht G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs), das auf der Oberfläche von Leukozyten am Endothel Chemokine Glykokalyx dargestellt aktiviert. Dies führt zur Veränderung der Integrin-Bestätigung zu einem &quot;hohe Affinität&quot; Zustand auf der Oberfläche der Leukozyten und verhaften und feste Adhäsion an das Endothel. Firm Haftung wird dann durch Formänderung und Crawling der Leukozyten an der Gefäß gefolgt. Der letzte Schritt ist durch das Trans endothelialen Monoschicht, die über den parazellulären oder transzellulären Route erfolgen kann. Während der mehrstufigen Kaskadenhaftung beschreibens der allgemeine Mechanismus der Leukozyten-Rekrutierung innerhalb des Körpers gibt es organspezifische Unterschiede. In der Leber der Großteil der Leukozyten-Rekrutierung erfolgt innerhalb der Lebersinuskurven im Gegensatz zu anderen Organen, wo Rekrutierung innerhalb der Post-Venolen 2 tritt in der Regel. Die Lebersinuskurven sind ein niedriger Scher Umwelt und Leukozyten unterziehen eine kurze Tethering Schritt vor, um die Haftung, die Selektin wird unabhängig 2 festigen. Diese Kanäle werden durch die Lebersinus Endothel, die diskontinuierlich und enthält fenestrae, offenen Poren 100-200 nm im Durchmesser gefüttert, und es fehlt eine Basalmembran 3. Die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel vermitteln könnte organspezifische therapeutische Ziele für entzündliche Lebererkrankungen zu identifizieren. Flow-Adhäsions-Assays sind wesentliche Instrumente bei der Untersuchung Leukozytenrekrutierung. Sie erlauben die Rekonstruktion der Leukozyten recruitment in Gegenwart von Scherbeanspruchung, um die Haftung unter definierten Kräfte zu analysieren. Die häufigste Verwendung für den Test ist die Untersuchung Leukozytenadhäsion zu kultivierten Endothelzellen Monoschichten oder gereinigten Substraten. Im Handel erhältliche Strömungskammern werden verwendet, um Zellen unter Bedingungen einer laminaren Strömung zwischen zwei ebenen Flächen durchströmen und dann visualisieren den dynamischen Prozess der Haftung auf ein Mikroskop 4. Zurück Gruppen haben gezeigt, dass bestimmte adhäsive Wechselwirkungen unter Fluss nur stattfinden, und kann nicht in statischen Tests 5,6 sucht werden. Wir haben diese Technik verwendet, um die Lebersinuskurven zu rekapitulieren und zu studieren Leukozytenrekrutierung unter Bedingungen geringer Scherbeanspruchung. Primäre humane HSEC in Mikroobjekttragerglaschen Leukozyten kultiviert und kann dann über diese Monoschicht bei einer Fließgeschwindigkeit berechnet, um die Scherspannung in Sinusleber reproduzieren perfundiert werden. Die Scherspannung ist eine Spannung, die parallel oder tangential zu einer Oberfläche aufgebracht wird oppauf Normalspannung, die senkrecht osed. Jedes Fluid, das entlang einer Grenze bewegt wird eine Scherbeanspruchung auf dieser Grenze auszuüben. Scherbeanspruchung ist gezeigt worden, eine wesentliche Komponente der Lymphozytentrans 7 sein. Unter diesen Bedingungen wird jeder Schritt des Adhäsionskaskade durch Phasenkontrastmikroskopie visualisiert werden. Dieses Verfahren hat wichtige Einblicke in die Rekrutierung von Leukozyten in der Leber einschließlich der Untersuchung der herkömmlichen Adhäsionsmoleküle 8, die Rolle von Chemokinen und Chemokinrezeptoren 9-11 und atypische Adhäsionsmolekülen wie dem vaskulären Adhäsionsmolekül-1 (VAP-1 erlaubt ) 8,12 und gemeinsame Lymph-und vaskulären endothelialen Rezeptor-1 (CLEVER-1) 13. Während dieser Assay wurde in mehreren Publikationen unserer Gruppe erwähnt wurde, hat seine Beschreibung war kurz und wir haben diese Gelegenheit genutzt, um eine detaillierte Schritt für Schritt Anleitung zur Verfügung stellen, um bei der Fehlersuche helfen und verhindern, dass technische Fehler beim Versuch,ten des Assays. Darüber hinaus haben wir vor kurzem die Beschaffung von Mikroobjektkammern, die genauen Änderungen in der Scherbeanspruchung ermöglicht verändert. Wir glauben, dass dies erweitert die Anwendbarkeit des Assays zu anderen Immunzellen und Endothelzellen. Das folgende Verfahren beschreibt die Herstellung und Verfahren zur Durchführung einer flussbasierten Haft Assay mit menschlichen Lebersinus Endothelzellen und Lymphozyten des peripheren Blutes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1037">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:227px;">Name of the reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:168px;">Company</td>
			<td style="width:195px;">Catalog number</td>
			<td style="width:447px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Six channel &#956;-slide VI 0.4 flow chamber&#160;</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80601</td>
			<td>Other channel size and pre-coated slidess are available depending on assay requirements.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow adaptors&#160; &#956;-slide VI 0.4</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>80646</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flow assay chamber</td>
			<td>Solent Scientific</td>
			<td>33-3322</td>
			<td>These chambers are custom made by the company dpending on the model of microscope and accessories.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Inverted Microscope IX2</td>
			<td>Olympus, UK</td>
			<td>Model IX50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Syringe Pump</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>702101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Electronic solenoid valve</td>
			<td>Lee Products Limited,UK</td>
			<td>Part Number LFYA1226032H</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicon Tubing large</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50855</td>
			<td>2mm Inner diameter, 4mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Silicone Tubing-small</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>FB50853</td>
			<td>1mm Inner diameter, 3mm Outer diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Harvard Glass Syringe</td>
			<td>Harvard Apparatus, UK</td>
			<td>55-0962</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cell separation medium/Lympholyte</td>
			<td>VH Bio</td>
			<td>CL-5020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rat Tail Collagen</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C3867-1VL</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a flow adhesion assay to study leucocyte recruitment to human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of shear stress

Leukozyten-Infiltration in menschlichem Lebergewebe ist ein gängiges Verfahren in aller erwachsenen entzündlichen Lebererkrankungen. Chronische Infiltration kann die Entwicklung der Fibrose und die Progression der Zirrhose zu fahren. Das Verständnis der molekularen Mechanismen, die Leukozyten-Rekrutierung in die Leber vermitteln könnten wichtige therapeutische Ziele für Lebererkrankungen zu identifizieren. Der Schlüssel Interaktion während Leukozyten-Rekrutierung ist, dass der Entzündungszellen mit Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung. Recruitment der Leber tritt innerhalb der geringen Scher Kanäle der Lebersinuskurven, die durch Lebersinus Endothelzellen (HSEC) ausgekleidet sind. Die Bedingungen in den Lebersinuskurven können durch Perfusion Leukozyten durch die Kanäle durch menschliche HSEC Monoschichten an bestimmten Flussraten ausgekleidet rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen Leukozyten durchlaufen eine kurze Anbindung Schritt, gefolgt von der Aktivierung und feste Haftung, gefolgt von einem Schritt kriechen und nachfolgende Transmigration durch die endothelialeSchicht. Mit Hilfe der Phasenkontrastmikroskopie, kann jeder Schritt dieser &quot;Adhäsionskaskade &#39;visualisiert und aufgezeichnet, gefolgt von Offline-Analyse werden. Endothelzellen und Leukozyten können mit Inhibitoren vorbehandelt, um die Rolle von spezifischen Molekülen während dieses Prozesses zu bestimmen.

Dieser Assay bietet die Möglichkeit, den mehrstufigen Strömungs Adhäsionskaskade visualisieren und Aufklärung der molekularen Mechanismen, durch den Vergleich der Ergebnisse der Kontrollexperimente, um solche mit Molekularinhibitoren. Verschiedene Gefäßbetten kann, indem spezifische Endothelzellen und die Änderung Scherstressbedingungen rekapituliert werden. Jeder Schritt des Adhäsionskaskade können offline durch folgenden Aufzeichnungsverfahrens in dem Protokoll beschrieben analysiert werden. Der erste Schritt des Adhäsionskaskade ist das Rollen der Leukozyten, die als Prozentsatz der gesamten haftenden Zellen exprimiert werden können. Offline-Analyse kann die Anzahl der adhärenten Zellen, die in jedem Bereich aufgezeichnet während der Leukozyten-Bolus aufgezählt werden. Die Wiedergabe des Bildes ermöglicht den Vergleich von Zellen, die fest haftenden und diejenigen, die unterzogen werden eine Rollbewegung durch das Endothel sind. Rollbewegung kann mit dieser Technik dargestellt werden, wird jeder Bereich für mindestens 10 Sekunden aufgezeichnet. Rollende Zellen werden durch ihre reduzierte Geschwindigkeit über die endothelialen Oberfläche im Vergleich zu fließenden Zellen identifiziert. Dieses Verhalten ist für mindestens 5 sec ohne Ablösung nachgewiesen werden. Die Haftung Kaskade innerhalb der Lebersinuskurven erfolgt in einer geringen Scher Umwelt-und in-vivo-Studien haben nur geringen Roll mit einer kurzen Tethering Schritt bestätigt. Wir haben bestätigt, dass die Strömungs Assay spiegelt die Umgebung der hepatischen Sinusoiden durch den Nachweis, dass weniger als 10% der adhärenten Leukozyten anhaltend rollen stimulierte HSEC in diesen Assays. Der nächste Schritt des Adhäsionskaskade ist eine feste Haftung. Insgesamt kann die Einhaltung der zweiten Stufe der Aufzeichnung während des Waschpuffers Bolus (Schritt 7.3) ermittelt werden. Offline-Analyse ermöglicht die Gesamtzahl der fest adhärenten Zellen, die in jedem Bereich (Abbildung 5) gezählt werden. Fest haftenden Zellen werden als Zellen, die stationär oder mit langsamen Kriechen Verhalten shapechanged sind definiert.Die durchschnittliche Anzahl von Zellen pro Feld kann dann berechnet werden. Diese Zahl kann dann verwendet werden, in Verbindung mit der Gesamtoberfläche des Sichtfelds (bestimmt unter Verwendung eines Rasters oder Äquivalent), die Konzentration von Lymphozyten (typischerweise 1 x 10 6 Zellen / ml) und die Durchflussrate, um das Ausmaß auszudrücken Lymphozytenanhaftung als adhärente Zellen / mm 2/10 6 Zellen perfundiert. Studieren Sie das Muster der Haftung umfasst die Analyse der letzten beiden Schritte die Haftung Kaskade einschließlich Formänderungen, Krabbeln und transendotheliale Migration. Leukozyten Anhänger der oberen Fläche der HSEC Monophasen hell erscheinen, während diejenigen, die durch die Monoschicht migriert haben, erscheinen dunkle Phase (Abbildung 6). Die Zellen können dann als &quot;statische&quot; Haftung (nonmigrated / Runde) zeigen &quot;-Form-verändert&quot; Morphologie klassifiziert werden, oder als &quot;migriert&quot; und einzelnen Kategorien werden dann als Prozentsatz der AusdruckGesamthaft Bevölkerung. <img alt="Figur 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig1.jpg" /> Fig. 1 ist. Monolayer von primären humanen Lebersinus Endothelzellen in Flusskammer. A) Mikroobjekttragerglaschen mit Medien, die Monoschicht von Endothelzellen vor Beginn der Strömung Adhäsionstest. B) Phasenkontrastbild konfluenten endothelialen Monoschicht gefüllt ist, sollte Endothelzellen in die Mikroobjekt vorbeschichtet wurden ausgesät werden (für den menschlichen Leberendothelzellen sollte dies sein mit Rattenschwanz-Kollagen Typ 1) und es ist wichtig, dass die Endothelzellen sind gesund in Kultur und konfluent. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Figur 2" fo:content-width="5in" fo:src= &quot;/ Files/ftp_upload/51330/51330fig2highres.jpg&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51330/51330fig2.jpg&quot; /&gt; 2. Durchflusskammer-Assay. A-Flow-Assay Kammer Set-up ist hier zu sehen, es besteht aus einer transparenten Kammer, die auf einem inversen Mikroskop montiert ist. Eine Heizung in der Kammer platziert und sollte thermostatisch gesteuert werden, um eine Temperatur von 37 ° C zu halten Es sollte Ports zur Verfügung Silikonschlauch von einem Mikroobjektträger innerhalb der Kammer, um eine Spritzenpumpe, die außerhalb angeordnet ist, zu verbinden. Die Mikroobjekt wird direkt auf den Mikroskoptisch gelegt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig3.jpg" /> 3. Spritzenpumpe. Eine Spritzenpumpe ist zu verbindenüber Silikonschlauch auf die Strömungskammer ed. Die Pumpe auf eine spezifische Entzugsrate in Abhängigkeit von der für den Test erforderlich gewünschte Schubspannung eingestellt ist. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig4.jpg" /> 4. Anschlussventil zur Flusskammer. A) Ein elektronisches Magnetventil ermöglicht das Umschalten zwischen zwei Spritzenzylinder, die entweder Zellen oder Medien praktisch ohne Totvolumen. B) Sobald das Ventil gespült wird und die beiden Fässer sind eingerichtet, die Silikonschlauch vom Ventil an die Strömungskammer angeschlossen. Entscheidend ist, dass beim Anschluss des Adapters an der Siliconschlauchleitung mit dem Anschluss an der Strömungskammer befindet sich eine Flüssigkeit / Flüssigkeit-Grenzfläche. &lt;a href = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. <img alt="Figur 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig5.jpg" /> 5. Messung des Gesamt-Leukozyten-Anhaftung. Während der letzten zwei Minuten des Waschpuffers Bolus Schritt (wie in dem Protokoll beschrieben), sollte ein Minimum von zehn zufälligen Feldern aufgezeichnet. Diese können off-line analysiert werden, und die Gesamtzahl der fest haftenden Zellen können in jedem Bereich gezählt werden. Gesamthaftung von Leukozyten zwischen Steuerkammern und solche mit blockierenden Antikörpern vorbehandelt verglichen werden, hier zeigen wir einen repräsentativen Bereich von einem Steuerschieber und eine Rutsche mit intrazellulären Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1)-blockierenden Antikörper vorbehandelt. Arrows wurden hinzugefügt, um die anhaftenden Leukozyten zu markieren, in der Vertretertive Feld von der Steuerschieber gibt es insgesamt 25 Leukozyten identifiziert und in der ICAM-1-Block Schlitten gibt es insgesamt 13 Leukozyten identifiziert. Maßstabsbalken = 100 um. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> . <img alt="Fig. 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51330/51330fig6.jpg" /> 6. Analyse des Musters der Leukozytenadhäsion an Endothelzellen-Monoschichten durch Phasenkontrastmikroskopie. Offline-Analyse der aufgezeichneten Felder können auch verwendet werden, um die Richtung und die Geschwindigkeit der Leukozyten-Adhäsion zu untersuchen. Konkrete Schritte des Adhäsionskaskade visualisiert und quantifiziert mittels Phasenkontrastbildgebung werden. Phase hellen Zellen, die fest haftenden, aber nicht aktiviert sind, können &quot;runde&quot; Haftung, die Zellen, die activate sind bezeichnet werdend und Phasen hell kann &#39;Form verändert &quot;bezeichnet werden und die Zellen, die dunkle Phase sind die Zellen, die transendotheliale Migration unterzogen haben und kann bezeichnet werden&quot; migriert &quot;. Das Bild zeigt Beispiele der einzelnen Muster der Haftung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51330/51330fig1highres.jpg" target="_blank">Klicken Sie hier für eine größere Ansicht</a> .

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A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern.

Ein Flow-Assay zur Haftung Leukozyten-Rekrutierung Human Lebersinus Endothel unter den Bedingungen der Schubspannung Studieren

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

15.3K Aufrufe.  University of Birmingham.  Leukozyten-Rekrutierung in die Leber tritt innerhalb der spezialisierten Kanäle der Lebersinuskurven, die durch einzigartige hepatischen sinusoidalen Endothelzellen ausgekleidet sind. Phasenkontrast-Mikroskopie von Leukozyten-Rekrutierung über menschliche Lebersinus Endothel unter physiologischen Bedingungen der Schubspannung kann die Aufklärung der molekularen Mechanismen, die diesen Prozess zugrunde liegen, zu erleichtern. 

Serie: A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

Imaging Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel bei hohen intraluminalen Druck

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the initial and determining step of the pathogenesis. Although experimentally adhesion is mostly studied in static conditions adhesion actually takes place in the presence of flowing liquid. First encounters between bacteria and their host often occur at the mucosal level, mouth, lung, gut, eye, etc. where mucus flows along the surface of epithelial cells. Later in infection, pathogens occasionally access the blood circulation causing life-threatening illnesses such as septicemia, sepsis and meningitis. A defining feature of these infections is the ability of these pathogens to interact with endothelial cells in presence of circulating blood. The presence of flowing liquid, mucus or blood for instance, determines adhesion because it generates a mechanical force on the pathogen. To characterize the effect of flowing liquid one usually refers to the notion of shear stress, which is the tangential force exerted per unit area by a fluid moving near a stationary wall, expressed in dynes/cm2. Intensities of shear stress vary widely according to the different vessels type, size, organ, location etc. (0-100 dynes/cm2). Circulation in capillaries can reach very low shear stress values and even temporarily stop during periods ranging between a few seconds to several minutes 1. On the other end of the spectrum shear stress in arterioles can reach 100 dynes/cm2 2. The impact of shear stress on different biological processes has been clearly demonstrated as for instance during the interaction of leukocytes with the endothelium 3. To take into account this mechanical parameter in the process of bacterial adhesion we took advantage of an experimental procedure based on the use of a disposable flow chamber 4. Host cells are grown in the flow chamber and fluorescent bacteria are introduced in the flow controlled by a syringe pump. We initially focused our investigations on the bacterial pathogen Neisseria meningitidis, a Gram-negative bacterium responsible for septicemia and meningitis. The procedure described here allowed us to study the impact of shear stress on the ability of the bacteria to: adhere to cells 1, to proliferate on the cell surface 5and to detach to colonize new sites 6 (Figure 1). Complementary technical information can be found in reference 7. Shear stress values presented here were chosen based on our previous experience1 and to represent values found in the literature. The protocol should be applicable to a wide range of pathogens with specific adjustments depending on the objectives of the study.

During the infection process, a key step is the adhesion of pathogens with host cells. In most instances this adhesion step occurs in the presence of mechanical stress generated by flowing liquid. We describe a technique that introduces shear stress as an important parameter in the study of bacterial adhesion.

Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolierung von humanen Nabelschnur-Endothelzellen und ihre Verwendung in der Studie von neutrophilen Transmigration unter Strömungsbedingungen

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the phenotypic and functional differences between murine and human monocyte-derived macrophages. Therefore, we here describe an in vitro model to generate and study primary human macrophages. Briefly, after density gradient centrifugation of peripheral blood drawn from a forearm vein, monocytes are isolated from peripheral blood mononuclear cells using negative magnetic bead isolation. These monocytes are then cultured for six days under specific conditions to induce different types of macrophage differentiation or polarization. The model is easy to use and circumvents the problems caused by species-specific differences between mouse and man. Furthermore, it is closer to the in vivo conditions than the use of immortalized cell lines. In conclusion, the model described here is suitable to study macrophage biology, identify disease mechanisms and novel therapeutic targets. Even though not fully replacing experiments with animals or human tissues obtained post mortem, the model described here allows identification and validation of disease mechanisms and therapeutic targets that may be highly relevant to various human diseases.

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

Monocyte-derived macrophages are important cells of the innate immune system. Here, we describe an easy to use in vitro model to generate these cells. Using gradient centrifugation, negative bead isolation and specific cell culture conditions, monocyte-derived macrophages can be generated for phenotypic and functional studies.

Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell zur Heterogenität des menschlichen Makrophagen Differenzierung und Polarisierung Studieren

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitative<em&gt; In-vitro-</em&gt; Assay auf Neutrophile Haftung auf Aktiviert primären humanen mikrovaskulären Endothelzellen unter statischen Bedingungen messen

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Humanen neutrophilen Flusskammer Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Static Adhesion Assay for the Study of Integrin Activation in T Lymphocytes

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with antigen presenting cells. T cells accomplish regulated adhesion by controlling the adhesive properties of integrins, a class of cell adhesion molecules consisting of heterodimeric pairs of transmembrane proteins that interact with target molecules on partner cells or extracellular matrix. The most prominent T cell integrin is lymphocyte function associated antigen (LFA)-1, composed of subunits &#945;L and &#946;2, whose target is the intracellular adhesion molecule (ICAM)-1. The ability of a T cell to control adhesion derives from the ability to regulate the affinity states of individual integrins. Inside-out signaling describes the process whereby signals inside a cell cause the external domains of integrins to assume an activated state. Much of our knowledge of these complex phenomena is based on mechanistic studies performed in simplified in&#160;vitro model systems. The T lymphocyte adhesion assay described here is an excellent tool that allows T cells to adhere to target molecules, under static conditions, and then utilizes a fluorescent plate reader to quantify adhesiveness. This assay has been useful in defining adhesion-stimulatory or inhibitory substances that act on lymphocytes, as well as characterizing the signaling events involved. Although described here for LFA-1 - ICAM-1 mediated adhesion; this assay can be readily adapted to allow for the study of other adhesive interactions (e.g.&#160;VLA-4 - fibronectin).

Static adhesion assay is a powerful tool that can be used to model the interactions between T lymphocytes and other cell types. Interactions are generated by injecting labeled T cells into wells coated with adhesion molecules, while a plate reader is used to quantify the number of adherent cells following serial washes.

Statische Haftung Assay für das Studium der Integrin-Aktivierung in T-Lymphozyten

T lymphocyte adhesion is required for multiple T cell functions, including migration to sites of inflammation and formation of immunological synapses with ...

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In-vitro- und In-vivo-Modell, um die bakterielle Adhäsion an der Gefäßwand unter Strömungsbedingungen Studieren

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and interaction with antigen presenting cells (APC) in the formation of immunological synapses. These two contexts of T cell adhesion differ in that T cell-APC interactions can be considered static, while T cell-blood vessel interactions are challenged by the shear stress generated by circulation itself. T cell-APC interactions are classified as static in that the two cellular partners are static relative to each other. Usually, this interaction occurs within the lymph nodes. As a T cell interacts with the blood vessel wall, the cells arrest and must resist the generated shear stress.1,2 These differences highlight the need to better understand static adhesion and adhesion under flow conditions as two distinct regulatory processes. The regulation of T cell adhesion can be most succinctly described as controlling the affinity state of integrin molecules expressed on the cell surface, and thereby regulating the interaction of integrins with the adhesion molecule ligands expressed on the surface of the interacting cell. Our current understanding of the regulation of integrin affinity states comes from often simplistic in vitro model systems. The assay of adhesion using flow conditions described here allows for the visualization and accurate quantification of T cell-epithelial cell interactions in real time following a stimulus. An adhesion under flow assay can be applied to studies of adhesion signaling within T cells following treatment with inhibitory or stimulatory substances. Additionally, this assay can be expanded beyond T cell signaling to any adhesive leukocyte population and any integrin-adhesion molecule pair.

This flow adhesion assay provides a simple, high impact model of T cell-epithelial cell interactions. A syringe pump is used to generate shear stress, and confocal microscopy captures images for quantification. The goal of these studies is to effectively quantify T cell adhesion using flow conditions.

Test der Haftung unter Scherspannung für das Studium der T-Lymphozyten-Adhäsions-Molekül-Wechselwirkungen

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...