نشكر جميع أعضاء Lenne ومختبرات برتراند، ولا سيما اوليفييه بلان لتطوير البرمجيات وجيريمي Capoulade للمناقشة. نشكر أيضا مرفق التصوير PICsL-IBDM، ولا سيما كلود موريتي وبرايس Detailleur للدعم التقني. وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من ATIP CNRS (لP.-FL وVB)، وLabex إنفورم منحة (لP.-FL وVB) ومنحة من شركة سانوفي أفنتيس (لVB). نحن نعترف البنية التحتية فرانس BioImaging بدعم من الوكالة الوطنية دي لا بحوث (ANR-10-INSB-04-01، والدعوة &quot;INVESTISSEMENTS كوت أفينير&quot;).

1. إعداد ورقة الضوء والكشف عن مسار يعطي الشكل 1 مخطط العام من الإعداد البصرية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وإصلاح المجهر وأشعة الليزر على الطاولة البصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الجمع بين الليزر 488 نانومتر، 561 نانومتر و 405 نانومتر مع المرايا مزدوج اللون المطابق. بعد المرايا مزدوج اللون، وأشعة الليزر يجب أن تكون بالضبط شارك الانحياز. لاحظ أن يتم تحديد خيار من موجات الليزر، مرايا مزدوج اللون، والمرشحات الضوئية من أطياف امتصاص التسميات الفلورسنت المحددة المستخدمة في التجارب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع مرشح الانضباطي الصوتية البصرية (AOTF). استخدام ورقة الاختبار المقدمة من الموردين لضبط وتيرة وقوة AOTF. عندما تتماشى جيدا، تبث حوالي 90٪ من طاقة الليزر في أقصى ضبط مقاسا powermeter. لاحظ أن بعض أجهزة الليزر يمكن التحكم بالكامل من قبل البرمجيات، والتي يمكن أن تجعل AOTF لا لزوم لها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع وإصلاحالتلسكوب. نلاحظ أن المنظار يتكون من اثنين من العدسات التي تعمل على توسيع شعاع لعرض يساوي أو أكبر من قطر الفتحة الخلفية للإضاءة عدسة الهدف. العدسة مع أصغر البؤري ينبغي أن يأتي أولا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان، ومحاذاة إصلاح بيريسكوب جلب صعودا مسار بصري أقرب إلى الفتحة الخلفية للعدسة أسطواني. نلاحظ أن اثنين من المرايا من المنظار هي التي شنت بطريقة المحور الطويل هو زرع على الميل للمرآة لكي تعكس شعاع توسعت بشكل كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع عدسة اسطوانية المقبل للخروج المنظار. لاحظ أن عدسة اسطوانية يركز شعاع في اتجاه واحد وتترك موازى في الاتجاه الآخر، وبالتالي تكوين ورقة الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تركيز الورقة الضوء الناتج باستخدام الإضاءة عدسة الهدف. لاحظ أن النقطة المحورية صورة الهدف الإضاءة يجب أن يتزامن مع النقطة المحورية موضوع الكشف عن الهدف. المشروع شعاععلى شاشة (مثل الجدار) على مسافة طويلة. تحرك الهدف الإضاءة على طول محور الإضاءة شعاع للحصول على الشاشة ملامح حادة من ورقة الخفيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع خط رباعية (405/488/561/638) تصفية الانبعاثات في المكان المخصص في المجهر (المكعب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الكاميرا EMCCD في منفذ إخراج المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح أول مرحلة الترجمة دليل على المسرح المجهر بواسطة مسامير في الثقوب المحفورة في المرحلة المجهر. نلاحظ أن حافة مرحلة الترجمة لابد من وضعه في حوالي 2 سم بعيدا عن وسط المسرح المجهر، بحيث يتم توسيط كفيت أدناه كشف عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الثانية مرحلة الترجمة دليل على أول واحد. توجيهات المرحلتين يجب أن تكون متعامدة (X و Y الترجمات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح المرحلة Z كهرضغطية في الجزء العلوي من اثنين من المراحل السابقة. لاحظ أن مرحلة الآلية يمكن أن تستخدم بدلا من مرحلة كهرضغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح holde كفيتص (انظر الشكل 2) في الجزء العلوي من المراحل. سيوضعون كفيت عند تقاطع الطريق الإضاءة ومسار الكشف، والتي هي متعامدة مع بعضها البعض. </li></ol> 2. التحقق من ورقة الخفيفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء كفيت الزجاج بمحلول فلوري، ووضعه على صاحب العينة عند تقاطع اثنين من المسارات البصرية. ورقة الضوء وبالتالي مرئية. فإنه يجب أن يكون أفقيا، ومتماثل / تركزت فيما يتعلق كشف عدسة الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة عدسة اسطوانية والحصول على صورة لقياس سمك الورقة الضوء. لاحظ أن سمك الورقة الضوء يعتمد على الفتحة العددية (NA) من إضاءة عدسة الهدف (حوالي 3-4 ميكرون لNA = 0.3). لاحظ أن عدسة معينة، ويمكن زيادة سمك الورقة للضوء عن طريق الحد من حجم شعاع دخول الفتحة مرة أخرى مع فتحة. نلاحظ أن المجهرية الفلورسنت يمكن استخدامها لقياس الفأسقرار الاتحاد العالمي للتعليم والوحشي المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اعادة وضع عدسة اسطوانية قبل بدء التجربة. </li></ol> 3. وتصاعد من C. ايليجانس الأجنة والصورة الخطوات التالية في الشكل 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قلم علامات الماس لقطع قطعة من شريحة زجاجية من 10 × 20 × 1 مم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 5٪ bacto أجار في الماء، وأنها تغلي والحفاظ عليه في كتلة سخان في 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على جانب واحد من قطعة من قطع الشريحة، اتركه حتى يجف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة المجهر على مقاعد البدلاء وإصلاحه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سيجمع قطعة من قطع الشريحة مع الشريحة الثابتة وإضافة قطرة من آغار ذاب على القمة. ضغط على أجار باستخدام شريحة المجهر نظيفة أخرى للحصول على لوحة آغار رقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح لوحة أجار لتجف قبل إزالة الشريحة العليا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع لوحة أجار على جانب من الشريحة ثابتة من أجل ترك وجود فائض من حوالي 3 ملم سو أجار وإزالة بلطف الشريحة الثابتة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من بولي-L-يسين على أجار واتركها تجف تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الديدان حامل في M9 المتوسطة في كوب ووتش. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الديدان على مستوى الفرج مع مشرط للافراج عن الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحت مجهر التعرف على الأجنة في مرحلة الفائدة وجمعها باستخدام ماصة microcapillary. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الأجنة من جانب آغار المغلفة مع بولي-L-يسين أن يبرز من قطعة من قطع الشريحة. وضع الأجنة فقط بجانب الحدود من الشريحة. لا وضع الأجنة في حدود أجار لأنها لن تكون مستقرة بما فيه الكفاية. إزالة بلطف السائل بحيث الأجنة ستلتزم على طبقة بولي-L-يسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محاذاة بسرعة الأجنة لتجنب الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريحة قطع في طبق بتري البلاستيكية وإضافة بلطف M9 المتوسطة لتغطية الشريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاختيار تحت مجهر أن البيض لا تزال عالقة على أجار. </لى&gt; </ol> 4. تسجيل من C. التنمية ايليجانس <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح إعداد السابقة (قطع الشريحة، بالإضافة إلى أجار الأجنة) في صاحب العينة ووضعها في كوفيت. يصف الشكل 4 حامل محلية الصنع ويبين الشكل 5 إطلالة على كفيت في سياق المراقبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح كفيت على المسرح كهرضغطية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف الأجنة مع إضاءة حقل مشرق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء البرنامج الصنع السيطرة على AOTF، والكاميرا والمرحلة كهرضغطية. نلاحظ أن البرمجيات الحرة، مثل micromanager، يمكن أن تستخدم أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد خط ليزر والطاقة (AOTF). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الموقف من الورقة الضوء باستخدام المرحلة 3 اتجاهات دعم عدسة اسطوانية وعدسة الإضاءة. نقل المرحلة على طول اتجاه الجانبي (X) للحصول على إشارة ألمع. ضبط ثم موقف Z الورقة الضوء، والموقف الطولي (Y) للحصول على اله أفضل إشارة إلى نسبة الضوضاء. لاحظ أن موقف التركيز رقة ضوء قد تحتاج إلى تعديل من جنين واحد إلى آخر لتصحيح الاختلافات في أطوال مسار الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على صور عالية الفاصل الزمني، حدد وقت التعرض، واكتساب، والوقت بين صورتين، فضلا عن عدد من الصور التي سيتم شراؤها، وقوة الليزر. لاكتساب اللون 2، حدد خط ليزر ثاني. يتم الحصول على اثنين من الصور الملونة على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للحصول على كومة من الألف إلى الياء، أيضا تحديد المسافة بين شرائح اثنين، والبداية والنهاية مواقف كهرضغطية. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول وسهلة الإعداد المجهر ضوء ورقة لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة. العناصر البصرية الضرورية لإنشاء ومحاذاة الورقة الضوء، بما في ذلك أشعة الليزر، وشعاع المتوسع، إيزاء وعدسات التركيز، ويمكن تركيبه بسهولة على مقاعد البدلاء البصرية. في تركيبة مع المجهر تستقيم لمسار كشف والكاميرا، وهذا يوفر حلا بسيطا لإعداد ورقة المجهر الخفيفة. هذه الهندسة يجعل البيئة عينة بسيطة. يتم وضع العينة يعيشون في كوفيت الزجاج، والذي يقام المتمركزة وانتقلت من مجموعة صغيرة من القطع الميكانيكية. كما الإضاءة رقة المجهري هو أسلوب حقل واسع مع باجتزاء القدرة، مطلوب فقط محور واحد آلية الحركة للتصوير 3D. وهذا يحد من شرط التزامن إلى عنصر واحد المسح الضوئي ويسهل تطوير البرمجيات. مقارنة iSPIM 6 دينا geomet تستقيمراي يسمح باستخدام عدسة الهدف NA عالية للكشف. مقارنة مع الاجهزة SPIM مع العدسات الهدف في المستوى الأفقي وتركيب العينة والتصوير من سلسلة من الأجنة هي أسهل. تماما، وتنفيذ هذه التقنية واضحة ومباشرة، ويمكن أن يتحقق مع القليل الخبرة في مجال البصريات. هذا هو بديل أرخص لالمجاهر مبائر مع مزايا أعلى سرعة وانخفاض الضيائية ولكن العيب قرار المحوري أقل. نحن أيضا تطوير وسيلة سهلة وقابلة للتكرار لجبل C. الأجنة ايليجانس لفي الجسم الحي التصوير باستخدام هذا النظام. الإجراء تصاعد سريع (15 دقيقة) وغير مناسبة لإجراء التجارب اليومية. لC. ايليجانس التصوير، ومزايا هذا الإعداد بسيطة ما لا يقل عن اثنين من طيات: (ط) في التصوير توتو هو ممكن من دون دوران، وبالتالي إعادة الإعمار 3D واضح وصريح؛ (ب) عينة من السهل تركيب والأجنة متعددة ولا يمكن تصوير بالتسلسلعلى نفس الشريحة. أظهرنا أمثلة من الأفلام الوقت الفاصل بين لقرار الزمنية كافية لمراقبة انقسامات الخلية ويتغير شكل الخلية. قوة المجهر ضوء ورقة لدراسة C. التنمية ايليجانس كما تم توضيح مؤخرا من قبل الآخرين 6، 7، 8، ولذلك فإن هذا الأسلوب أن تكون مفيدة جدا لدراسة التشكل والزخرفة من C. ايليجانس الجنين. يمكن لهذا النظام أيضا أن تستخدم لتحليل تطور الكائنات نموذج آخر؟ من المهم أن ندرك أن تنفيذ ورقة إضاءة المجهر لكائن صغير وشفافة مثل C. ايليجانس أقل صرامة من لكائنات أكبر مثل أجنة ذبابة الفاكهة. في التصوير جملة وتفصيلا من ذبابة الفاكهة يتطلب عادة التناوب ومتعددة بغية إعادة بناء 9، 10. الإثارة من الجانبين مع خط واحد العدسات الهدف الإثارة يمكن أيضا تقليل تأثيرات الظل الناجمة عن attenuatايون الضوء 11. حتى الآن، والإعداد المقدمة هنا لا تزال تتكيف مع الجانب صورة واحدة من أجنة ذبابة الفاكهة، مع انخفاض تبيض وانخفاض photoxicity. هذا الإعداد يمكن أن تكون مفيدة لصورة أجنة صغيرة وشفافة مثل المزقييات أو الزرد أيضا.

تشكيل وصياغة كائن حي ينطوي على تحركات الخلية، ويتغير شكل الخلية، وانقسام الخلايا وتمايز الخلايا. فهم تطور وتنسيق هذه العمليات تتطلب أدوات التصوير السريع مع القدرة على ثلاثة أبعاد وقرار التحت خلوية. من بين التقنيات مع هذه في الجسم الحي قدرات التصوير، ودعا ضوء ورقة واحدة أيضا إضاءة المجهر / انتقائية الإضاءة الطائرة المجهر لديه ميزة فريدة من نوعها لإنتاج تأثيرات المنخفض الضوئية وانخفاض photobleaching من 1،2. في ورقة إضاءة المجهر، مضاءة العينة من الجانب بواسطة ورقة الضوء، الذي يؤدي وباجتزاء البصرية. المسار الإضاءة ومسار الكشف هي متعامدة مع بعضها البعض، ويتم محاذاة الورقة الضوء ليتزامن مع المستوى البؤري كائن الكشف عدسة الهدف. يتم وضع العينة عند تقاطع المسارين، والثانية يمكن نقلها على طول محور الكشف للسماح 3D التصوير. يضيء فقط الطائرة من الاهتمام ويتم الكشف عن جميع النقاط من هذه الطائرة في نفس الوقت. هذا يزيد بشكل كبير من سرعة اكتساب ويقلل photobleaching من الضيائية وكذلك بالمقارنة مع المجهري متحد البؤر 3. عمليا، والإضاءة ورقة المجهر هو سهل الإعداد ومحاذاة: للتصوير ثنائي الأبعاد، لا المسح ضروري لا بالنسبة للجزء الكشف، ولا بالنسبة للجزء الإضاءة؛ كأسلوب واسعة المجال مع باجتزاء القدرة، ويمكن الحصول على تصوير ثلاثي الأبعاد من قبل حركة محور واحد من مرحلة عقد العينة. نحن هنا تقديم إقامة المجهر ضوء ورقة بسيطة وتنفيذها لفي التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس الأجنة. C. هي مناسبة بشكل جيد ايليجانس الأجنة في العيش في فيفو معهد العالم العربيجينج بسبب شفافيتها، النسب ثابتة ونمطية خلية مواقف 4،5. ويستند إعداد ورقة وضعت على ضوء المجهر تستقيم القياسية للكشف. بروتوكول المعروضة أدناه تفاصيل كيفية بناء ومحاذاة الإثارة وحدة / المسار واختبار وتميز ورقة الضوء وجبل العينة للتصوير 3D. كما يوفر أمثلة من الأفلام مرور الزمن اكتسب مع الإعداد على سلالات مختلفة معربا عن علامات الفلورسنت.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

تقنيات التصوير الضوئية سريعة ومنخفضة هي شرط مسبق لدراسة تطوير الكائنات جملة وتفصيلا. المجهر ضوء ورقة تستند يقلل الصورة تبيض والتأثيرات الضوئية مقارنة المجهري متحد البؤر، مع توفير صور 3D مع قرار التحت خلوية. هنا نقدم الإعداد من ورقة القائمة على ضوء المجهر، التي تتألف من المجهر تستقيم ومجموعة صغيرة من عناصر البصريات الميكانيكية لتوليد ضوء ورقة. يصف البروتوكول كيفية بناء ومحاذاة المجهر وتميز ورقة الخفيفة. بالإضافة إلى ذلك، أنها تبين بالتفصيل كيفية تنفيذ أسلوب في التصوير جملة وتفصيلا من C. ايليجانس أجنة باستخدام غرفة الملاحظة البسيطة. الأسلوب يسمح للأسر 3D-ونين الأفلام الوقت الفاصل بين أكثر من ساعات قليلة من التنمية. وهذا ينبغي أن تخفف من تتبع شكل الخلية، انقسامات الخلية والبروتينات الموسومة على مدى فترات طويلة من الزمن.

ثلاث تجارب تسجيل الوقت الفاصل 3D من ثلاث C. مختلفة ايليجانس توضيح سلالات نوع البيانات التي يمكن الحصول عليها باستخدام ضوء الإعداد المجهر رقة المذكورة أعلاه. بحثنا أنه في ظل هذه الظروف الأجنة في تطوير السرعة العادية والبقاء على قيد الحياة في التصوير، بما يتفق مع تقارير سابقة تشير إلى أن التصوير SPIM يسبب مستويات منخفضة الضيائية فقط في C. ايليجانس الأجنة 6،7. سلالة الأولى يعبر عن هيستون تنصهر إلى GFP (zuIs178؛ stIs10024). تم إجراء التسجيل خلال 2 ساعة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 37 ثانية. الشكل 6 يوضح طائرة واحدة من المكدس في نقاط زمنية مختلفة. كل من نوى interphasic (السهم) ومكثف لونين الإنقسامية (رأس السهم) واضحة للعيان. سلالة الثاني يعبر عن تويولين تنصهر إلى GFP (ruIs57) وهيستونتنصهر mCherry (itIs37؛ stIs10226). تم إجراء تسجيل خلال 16 دقيقة مع كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 105 ثانية. الشكل 7 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. الفيلم يعرض 3D المرتبطة 1 اعادة البناء في الوقت 3 نقاط على التوالي. خلال الانقسام، المغزل الإنقسامية (الأخضر) والكروموسومات مكثف (الحمراء) مرئية مما يتيح تتبع توجهات انقسام الخلايا أثناء التطور بشكل واضح. سلالة الثالث يعبر عن ئي VIT-2 تنصهر إلى GFP (pwIs23) وغشاء ملزمة mCherry (ltIs44). تم إجراء تسجيل خلال 25 دقيقة مع كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) اتخاذ كل 30 ثانية. الشكل 8 يوضح طائرات مختلفة من المكدس ونقاط زمنية مختلفة. تحركات سريعة من جزيئات البروتين الدهني صفار (الخضراء) داخل الخلايا يمكن بسهولةيليه. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1: الإعداد البصرية SPIM تتألف من الإضاءة والكشف وحدات، الأمامي وجهات النظر أسفل. في وحدة الإضاءة والليزر جنبا إلى جنب بواسطة المرايا مزدوج اللون دخول AOTF، التي تسيطر على السلطة من كل الليزر بشكل مستقل. ثم، التلسكوب يزيد حجم شعاع بنسبة 4 أضعاف وبيريسكوب يجلب إلى ارتفاع المجهر. عدسة اسطوانية تشكل ورقة الضوء، الذي هو تركيز من قبل الهدف الإضاءة. تم دمج وحدة الكشف في المجهر تستقيم ويتكون أساسا من عدسة الكشف والتصفية، أنبوب العدسة وEMCCD. يتم وضع العينة في التقاطع بين الإضاءة والكشف عن المسارات. يسمح مرحلة كهرضغطية العمودي (Z) النزوح من العينة<html> لاقتناء 3D. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2: حامل كوفيت يتكون حامل من 3 صفائح الألمنيوم ومشدود على المسرح كهرضغطية. يقام كفيت الزجاج قبل الربيع (باللون الأحمر). <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> الرقم 3: تركيب بروتوكول C. الأجنة ايليجانس للتجارب SPIM. وهي مغلفة قطعة قطع من الزجاج مع بولي-L-يسين. يتم وضع وسادة من أجار على السطح المطلي. ثم يضاف بولي-L-يسين على لوحة أجار. أخيرا، C. يتم محاذاة ايليجانس الأجنة على بولي-L-يسين المغلفة لوحة أجار. ther.within صفحة = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4: حامل العينة. حامل يناسب للأبعاد الداخلية للكفيت الزجاج. اثنين من الينابيع (باللون الأحمر) عقد شريحة زجاجية (موضح في الشكل 3). ثم يتم وضع هذا حامل داخل كفيت الزجاج. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5:. حامل عينة في سياق المراقبة ويجمد الأجنة على شريحة زجاجية وفقا لخصت البروتوكول حتى في الشكل 3 يقام الشريحة من قبل صاحب العينة هو موضح في الشكل (4) يتم إدراج صاحب العينة في كوفيت الزجاج، عقدت من قبل صاحب موضح في الشكل 2. ورقة الضوء الأفقي وطlluminates الأجنة من الجانب. عدسة الهدف هو الكشف العمودي، فوق العينة. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6: تسجيل من C. ايليجانس الجنين إبداء الانصهار هيستون :: GFP الصور طائرة واحدة من الجنين وراثيا إبداء هيستون :: الانصهار GFP (zuIs178؛ stIs10024) في نقاط زمنية مختلفة الصور المستخرجة من تسجيل الوقت الفاصل 3D:. مداخن مصنوعة من شرائح 20 ( المسافة بين شرائح 1 ميكرون)؛ زمن التعرض لكل شريحة: 30 ميللي ثانية؛ الفاصل الزمني بين أكوام: 37 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 2 ساعة. السهم: نواة interphasic، رأس السهم: مكثف لونين الإنقسامية. في ر = 0 دقيقة الجنين في مرحلة 2 خلية وعلى ر = 120 دقيقة الجنين يحتوي على حوالي 70 الخلايا كما هو متوقع في ظل ق التنموية العاديةتبول (لاحظ أن فقط الخلايا الواردة في طائرة واحدة واضحة في الصور وليس كل خلايا الجنين). كانت قوة الإضاءة 30 μW في 488 نانومتر (تقاس في الخروج من الهدف إضاءة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a> <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7: تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP وهيستون :: mCherry الانصهار. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن تويولين :: الانصهار GFP (ruIs57) وهيستون :: mCherry الانصهار (itIs37؛ stIs10226). ظروف التسجيل: الاستحواذ على كومة من 20 شرائح (المسافة بين شرائح 1ميكرون) كل 105 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 16 دقيقة؛ وقت التعرض: 200 ميللي ثانية لكل قناة. لوحة ويظهر 10 شرائح من نفس كومة. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 210 ثانية. كانت قوة الإضاءة 30 μW و 300 μW، ل488 و 561 نانومتر ليزر، على التوالي (قياس في الخروج من الهدف إضاءة). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a> <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> الرقم 8: تسجيل من C. ايليجانس الجنين تعبر عن VIT-2 :: GFP الانصهار والتي تستهدف غشاء mCherry. الصور المستخرجة من 3D الوقت الفاصل بين تسجيل لC. ايليجانس الجنين تعبر عن الانصهار VIT-2 :: GFP (PWIS23) وmCherry التي تستهدف الغشاء (ltIs44). شروط تسجيل: الاستحواذ على كومة من 10 شرائح (المسافة بين شرائح 1 ميكرون) كل 30 ثانية؛ مجموع اكتساب الوقت: 25 دقيقة؛ زمن التعرض لكل قناة: 200 ميللي ثانية. لوحة ويظهر شرائح الأولى من نفس كومة 5. يظهر لوحة ب نفس شريحة كل 30sec. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض هذا الفيديو.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة.

إعداد بسيط ضوء مجهر ورقة ل<em&gt; في توتو</em&gt; التصوير من<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; التنمية

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Views.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  يصف هذا البروتوكول الإعداد المجهر رقة الضوء وتنفيذها لفي الجسم الحي التصوير من C. ايليجانس الأجنة. 

Video: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

مكونات رئيسية مجهر الضوء

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

التصوير C. ايليجانس الأجنة باستخدام مجهر Epifluorescent وبرمجيات المصدر المفتوح

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

قياسات استجابات الإجهاد الفسيولوجي في C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

قياس سمية الببتيد RAN في C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

التصوير الحي المتزامن للأجنة الحشرية المتعددة في مجاهر فلورسينس ورقة الضوء المستندة إلى غرفة العينة

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.