يستغرق تكوين الجنين C.elegans حوالي 13 ساعة ، وعادة ما يتم رصده عن طريق تصوير جنين واحد في كل مرة. ومع ذلك، يسمح بروتوكولنا بتصوير الفاصل الزمني ثلاثي الأبعاد المتزامن بين 80 و100 جنين. القدرة على جمع البيانات لأعداد كبيرة من الأجنة C.elegans النامية يفتح مجموعة جديدة من التجارب، بما في ذلك التحليل الكمي للأحداث التنموية والشاشات على نطاق واسع.
ويمكن تكييف هذا البروتوكول بسهولة لالتقاط عمليات النمو المختلفة أو لتصوير الأجنة التي تعبر عن أي مزيج من العلامات في الأنسجة ذات الاهتمام. من الصعب تفريق الأجنة بشكل صحيح داخل الآبار. وينبغي أن تكون قريبة من بعضها البعض لتمكين التقاط أجنة متعددة في كل حقل دون تكتل في طائرات Z مختلفة.
نوصي باستخدام اثنين من الباحثين لتشريح جنبا إلى جنب، على الجليد، وحجب الآبار غير المستخدمة. وسوف نظهر أيضا بعض الحيل المفيدة لسرعة إعداد لوحة 384-جيدا على مراحل. تبدأ عن طريق ختم لوحة 384-جيدا ذات القاع الزجاجي مع رقائق لاصقة PCR لإخفاء الآبار غير المستخدمة.
استخدام شفرة الحلاقة أو مشرط لقطع بعيدا احباط لفضح مجموعة فرعية من الآبار للاستخدام. إضافة 70 ميكرولترات من TMHC أعدت حديثا في كل بئر والحفاظ على لوحة على الجليد. استبعاد الصفين الخارجيين من اللوحة لمنع تأثيرات الحافة.
لإعداد العينة السريعة، ينصح بتشريح جنباً إلى جنب من قبل باحثين اثنين. عندما تم مطلي كل من الحل، واستخدام ملاقط غرامة ومجهر تشريح لنقل حوالي 10 البالغين الجرافيد إلى 150 ميكرولترات من الجليد الباردة TMHC الحل داخل شريحة الاكتئاب واحد لكل حالة. باستخدام الملاقط والمشرط، تشريح الديدان لإطلاق الأجنة وتحميل ماصة شعرية سحبت في طامح الفم.
استخدمي ماصة الفم لنقل كل أجنة المرحلة من اثنين إلى ثماني خلايا إلى آبار فردية من الصفيحة المعدة وفحص اللوحة للتأكد من عدم وجود مجاميع داخل أي آبار. عندما يتم جمع جميع الأجنة، قم بتسوية العينات عن طريق الطرد المركزي واستخدم مسح الإيثانول المنقوع لإزالة أي بقايا من قاع اللوحة. ضع اللوحة في حامل لوحة المجهر confocal مجهزة بيئه تحكمها في درجة الحرارة واستخدم الهدف 10X لإجراء مسح مسبق لكل بئر لتحديد الحقول مع أجنة مناسبة.
في نهاية الفحص، قم بالتبديل إلى الهدف 60X، وضبط المستوى البؤري عند كل نقطة إلى صورة حقل إلى أربعة حقول في البئر والحصول على 18 Z-الأقسام على فترات ميكرومترية كل 20 دقيقة لمدة 10 ساعات. عندما تم الحصول على جميع الصور ، وإجراء مسح منخفض ، كامل brightfield ، ما يقرب من 20 إلى 24 ساعة بعد بدء التصوير بين عشية وضحاها لتقييم الفتك الجنيني. لاقتصاص الآلي باستخدام جنينCropUI التنفيذي، أولا تحميل البرنامج من Zenodo و testfiles.
الرمز البريدي لتحديد ما إذا كان البرنامج يعمل بشكل صحيح على النظام الأساسي. مرة واحدة تحميل، بفك وانتقل إلى العثور على ملف قابل للتنفيذ embryoCropUI وانقر نقرا مزدوجا لإطلاق البرنامج. حدد فتح لتحميل حقل عرض 4D المحدد الأول للحصد.
عند اقتصاص سلسلة TIFF مع أبعاد متعددة تحميل الصورة الأولى فقط في السلسلة داخل المجلد. عند تحميل كافة الصور تحديد معلمات التصوير، حدد الطرح الخلفية وتصحيح التوهين، وتعيين ترتيب مجموعة الصور والميكرنات لكل بكسل. ثم حدد تشغيل، سيتم إنشاء قص مجلد فرعي جديد يسمى في نفس المسار مثل المجلد غير المُنقط وسيتم حفظ الإصدارات المقتصة في هذا الموقع.
للتصور، تحميل البرنامج المساعد MSV2 ImageJ مفتوحة ومدمجة وتعليمات واجهة المستخدم الرسومية Zenodorepov2. docx من زنودو وفتح البرنامج المساعد في IMageJ. حدد موقع الأسطر ثلاثة وأربعة وإدخال الموقع الذي سيتم تخزين مجلدات الصور فيه بعد الاقتصاص.
أسماء مجلد الصور للشروط التي سيتم معالجتها، ومعرف أبجدي رقمي فريد لكل تجربة ليلية. عند إدخال كافة المعلومات، انقر فوق تشغيل. ستظهر نافذة ستقوم بتشغيل مطالبة بالانتقال إلى المجلد الخارجي الذي يحتوي على مجلدات الصور التي تم اقتصاصها.
بمجرد تحديد نافذة أخرى سوف تظهر والتي سوف تسمح مواصفات المعلمات التصوير. انقر فوق "حسناً". سيبدأ الملف المركب في التجميع.
عند إنشاء المركب، راجع الملفات التي يتم تركها مفتوحة. عندما صورت في سلالات مراسل مخصص جنبا إلى جنب توفير قراءات مفيدة لمعظم الأحداث التنموية الكبرى. بما في ذلك مواصفات كبريتات، التشابك الظهرية، الضميمة البشرة، الممدة، والنشوء العصبي.
بعد 24 ساعة من الحقن هو الوقت الأمثل للتصوير. اعتبارا من هذا الوقت استنفاد البروتين الأمومي وتثبيط التعبير الجيني الزيجوتيك كلاهما فعالة تسفر عن متميزة، والأنماط الظاهرية التوقيع استنساخها للغاية عبر مجموعة واسعة من الجينات المشاركة في مواصفات كبريتات وmorphogenesis. من المهم أن يكون المريض أثناء تشريح والخطوات اختيار الجنين.
والتقليل من التكتل واختيار المعطيات البؤرية المناسبة أمران أساسيان أيضاً لضمان جودة البيانات. يمكن تنفيذ بروتوكول لدينا مع مجموعة متنوعة من سلالات علامة الفلورسنت و بالاشتراك مع RNAi أو المسوخ. تسمح أدوات المعالجة لدينا بتحليل البيانات المبسط أو الآلي أو اليدوي.
باستخدام السلالات، والأساليب، والأدوات الموصوفة هنا، قامت مجموعتنا بإجراء شاشة محتوى عالي قائم على RNAi تستهدف ما يقرب من 2000 جينات مطلوبة للتنمية الجنينية. كانت طرق الإنتاجية شبه عالية ضرورية لهذا المشروع.
