هذا البروتوكول يتيح تتبع كفاءة من أنساب الخلايا والهويات في الأجنة الحية في حين تحليل في وقت واحد مورفولولوجيا الخلية مفصلة مثل محاور عصبية و dendrites في تطوير الخلايا العصبية C.elegans. بالمقارنة مع المجهر confocal، المزدوج عرض مقلوب الطائرة مقلوب المجهر الإضاءة أو دي إس بي إم يقدم إشارة أعلى للضوضاء، وأكثر دقة المكانية متساوي المدى، وأكثر ملاءمة لمدى طويل في التصوير الجسم الحي. تبدأ بإضافة 500 ميكرولترات من 1٪ محلول ميثيلسيللوز في الاكتئاب من شريحة المجهر مقعر.
باستخدام قطف الأسلاك البلاتينية، نقل البالغين من لوحة متوسطة النمو الخيطية في حل M9 ميثيلسيللوز. استخدم النصائح الحادة من 18 إبر تحت الجلد لقياس لشريحة كل عرضية في منتصف الجسم إلى ما لا يقل عن واحد إلى أربعة أجنة الخلية. مع لسان حال الطامح عقد بلطف بين الأسنان، prefill a ماصة ميكروكريلا مع 10 إلى 15 ميكرولترات من M9 العازلة وpirate بلطف عدة أجنة من الشريحة في الشعرية.
الاستغناء عن الأجنة في المستطيل المركزي من غطاء من غرفة التصوير الصلب مليئة M9 العازلة الطازجة. توجيه الأجنة بلطف عموديا بحيث يكون محور طويل من كل جنين عمودي على محور طويل من غطاء. ثم ضع غرفة التصوير الصلب في حامل العينة على خشبة المسرح من diSPIM.
لإعداد الأجنة للتصوير، فتح مدير صغير وتعيين كثافة الليزر إلى 179 microwatts 0.5٪ التكافؤ ل488 نانومتر و 79 ميكروواط 0.25٪ التكافؤ ل561 نانومتر. يجب أن يتم المعايرة بين تعديل البرامج وإخراج الليزر الحقيقي في وقت مسبق من أجل تعيين نطاق لصغرات صغيرة معينة. في القائمة الإضافات، حدد التحكم في الجهاز وتطبيق التصوير العلمي diSPIM لفتح التصوير العلمي التطبيقية المزدوجة مقلوب ضوء الطائرة مقلوب نافذة المجهر الإضاءة.
ضمن علامة تبويب الامتلاك، تأكد من تعيين المعلمات كما هو مبين. ضمن علامة التبويب "ضبط تلقائي للصورة"، قم بتعيين المعلمات كما هو مبين. لاحظ أنه يجب على قناة التركيز البؤري التلقائي تحديد قناة الفلورسنسي النووية لتجارب تعيين الخط المخطط لها.
تحقق من الحزمة ومربعات الورقة للمسار A أو B وانقر مباشرة لبدء الحصول على الصورة. سيتم فتح نافذة عرض حية. ثم رسم مربع حول الجنين من الفائدة لتحديد منطقة تحليل التركيز التلقائي للجنين وانقر فوق بدء اكتساب لبدء التقاط صورة متعددة الأبعاد على المدى الطويل.
لعرض الصور ، ومعالجة وتحليل نسب الخلية ، بعد تحميل واستخراج حزمة البرمجيات ، انقر نقرا مزدوجا فوق ملف CytoSHOW_app jnlp لبدء تشغيل CytoSHOW. ضمن قائمة الملفات، حدد مدير microssPIM وssPIM رصد لتحديد موقع المجلد مجموعة البيانات الجذر حيث تم حفظ الصور مدير الصغرى الخام.
حدد أي مجلد نقطة الوقت وانقر على فتح. سيتم فتح نوافذ التنقل متعددة الأبعاد تلقائيًا لكل من SPIM A و SPIM B.Using أداة التحديد المضلع ، انقر خارج الحواف الأمامية والخلفية والدوزالية والبطني للجنين ذات الاهتمام لإنشاء نمط ربطة عنق على الجنين في كل من طرق العرض SPIM A و SPIM B وانقر على diSPIM. محاذاة القنوات الخضراء والأحمر لكل ذراع SPIM وانقر فوق diSPIM مرة أخرى.
سيتم تشغيل النوبات في جميع نوافذ الموقف الأخرى. بعد ذلك، انقر فوق diSPIM و fuse لفتح مربع الحوار وحدة الحوار diSPIM deconvolved data volumes raw و قم بتعيين المعلمات كما هو موضح. عند تعيين كافة المعلمات، انقر فوق نعم وحدد دليل الإخراج الذي سيتم حفظ الملفات المعالجة قبل النقر فوق موافق. في نافذة المعاينة، حرك شريط التمرير t إلى النقطة الزمنية الثانية من الإطار، ثم حرك شريط التمرير z حتى يتم عرض العرض مباشرة على طول المحور الطويل للجنين.
نقل شريط t-scroll إلى نقطة الوقت واحد في إطار المعاينة واستخدام أداة تحديد الخط لرسم خط من النواة الأكثر جولة ventral عبر الطائرة من لوحات metaphase خلية AB. انقر فوق الزر معاينة diSPIM لحفظ التعديلات الدقيقة على اتجاه وحدة التخزين المُصوَّرة التي تمت المعاينة. تعيين أشرطة التمرير t من الإطارات مراقبة diSPIM إلى نقطة وقت البدء والانتهاء من كامل نطاق الصور إلى معالجة.
ثم انقر فوق موافق. لتحليل نسب الخلايا بكفاءة ودقة، من المهم تحقيق توجه ADL دقيق لأحجام البيانات قبل معالجة Night المرصع بالنجوم. لفتح سلسلة تتبع نسب ليلة النجوم في AceTree، افتح الملف AceTree المخصصة المتوفرة وحدد فتح ملف تكوين لتحديد موقع دليل الإخراج المشار إليه مسبقاً. افتح المجلد الفرعي للصمامات للجنين الذي يهمك وحدد الملف المحرر.
ثم انقر فوق فتح والمضي قدما في التصور النسب والتحرير كما هو موضح سابقا. البروتوكولات الأمثل لا تحفز أي سمية ضوئية يمكن اكتشافها للأجنة كما تم تقييمها في وقت الفقس والتوقيت المتعلق بالمعالم التنموية. باستخدام هذا البروتوكول كما هو موضح، تم تحديد الخلايا المجهولة في هذا البروتين الفلوري الأخضر المعدلة وراثيا التي تعبر عن سلالة الديدان الخيطية لتتوافق مع الخلايا العصبية الحركية، وخلية القناة مطرح، وخليتين العضلات.
تم تشكيل الخلايا العصبية المحددة بشكل غير مباشر في وقت مبكر من 360 دقيقة بعد الإخصاب مع المحور الخلوي الأطول الذي يمثل المحور اللاحق لخاتم النوري. من 385 إلى 410 دقيقة بعد الإخصاب، وRMDD neurites تمديد ما يقرب من ستة ميكرومترات الأمامي من الأجسام الخلية. من 415 إلى 445 دقيقة بعد الإخصاب، امتدت كلا النيوترتين إلى حلقة العصب المفترض وحولها.
في المتوسط، كل RMDD neurite تمديد ما يقرب من 11 ميكرومتر من جسم الخلية قبل اجتماع متزامن نظيره contralateral في قمة الحلبة. معا، هذه البيانات تثبت أن الميزات التنموية العصبية للخلايا يمكن التعرف عليها واحدة قادرة على أن تدرس، مقارنة وكمية باستخدام هذا البروتوكول المتكامل. من المهم أن نتذكر توجيه الأجنة عموديا بحيث يكون محور طويل من كل جنين عمودي على محور طويل من الغطاء.
باستخدام هذا البروتوكول، بدأنا في استكشاف الجهاز العصبي الجنيني الوليد من جميع الزوايا. على سبيل المثال، أثناء ولادة الخلية، والهجرة والتمايز، وتكوين النوري، والخروج والاعتياد.
