Biz tartışma için yazılım geliştirme ve Jérémie CAPOULADE özellikle Olivier Blanc, tüm Lenne üyeleri ve Bertrand laboratuarları teşekkür ederim. Biz de teknik destek için PICsL-IBDM görüntüleme tesisi, özellikle Claude Moretti ve Brice Detailleur teşekkür ederim. Bu çalışma (P.-FL ve VB) CNRS dan ATIP hibe tarafından desteklenen, Labex (VB) Sanofi-Aventis gelen ve bir hibe (P.-FL ve VB) hibe INFORM. Biz (ANR-10-InSb-04-01 &quot;INVESTISSEMENTS d&#39;Avenir&quot; diyoruz) Agence Nationale de la Recherche tarafından desteklenen Fransa-Biolmaging altyapısını kabul.

1.. Işık Sheet ve Algılama Yolu ayarlama Şekil 1, bu optik kurulum genel bir şema sağlar. <ol><li> Optik masaya mikroskop ve lazerler yerleştirin ve sabitleyin. </li><li> Lazerler 488 nm, 561 nm ve gelen dikroik aynalar ile 405 nm birleştirin. Dikroik aynalar sonra, lazerler tam işbirliği olmalıyız. Lazer dalga boyu, dikroik aynalar ve optik filtrelerin seçimi deneylerde kullanılan özel flüoresan etiket absorpsiyon spektrumları belirlenir unutmayın. </li><li> Akustik-optik ayarlanabilir filtre (AOTF) yerleştirin. AOTF frekansını ve gücünü ayarlamak için tedarikçi tarafından sağlanan sınama sayfasını kullanın. Iyi hizalandığı zaman bir Güçmetrelerden ile ölçülen, lazer gücünün yaklaşık% 90 bir yüksek ayar iletilir. AOTF gereksiz hale olabilir, bazı lazerler tamamen yazılım tarafından kontrol edilebilir olduğunu unutmayın. </li><li> Yerleştirin ve düzeltmekteleskop. Teleskop eşit veya aydınlatma objektif lens arka açıklığın çapından daha büyük bir genişliğe ışını genişletmek iki lens oluşmaktadır unutmayın. Küçük odak uzaklığına sahip objektifi ilk gelmelidir. </li><li> Yer, uyum ve yakın silindirik lens arka diyafram yukarı optik yolunu getirerek periskop düzeltmek. Periskop iki ayna uzun ekseni tam olarak genişletilmiş ışınını yansıtmak için, aynanın eğimi üzerinde durur bir şekilde monte edilir unutmayın. </li><li> Yanındaki periskop çıkmak için silindirik lens yerleştirin. Silindirik lens bir yöne ışın odaklanır ve böylece hafif bir levha oluşturulması, diğer yönde collimated bırakır unutmayın. </li><li> Aydınlatma objektif lens kullanarak elde edilen ışık tabakası yönlendirmesi. Aydınlatma amacı görüntü odak noktası bulgulama hedefi nesne odak noktası ile aynı olmalıdır unutmayın. DemetiUzun bir mesafe bir ekranda (örneğin bir duvara). Işık tabakanın ekran keskin hatları üzerinde elde etmek için aydınlatma kiriş ekseni boyunca aydınlatma amacı taşıyın. </li><li> Mikroskop (küp) olarak ayrılmış bir yerde dörtlü hattı (405/488/561/638) emisyon filtresi yerleştirin. </li><li> Mikroskop çıkış limanında EMCCD kamerayı yerleştirin. </li><li> Mikroskop aşamasında açılan deliklere vida ile mikroskop sahnede ilk manuel çeviri aşamasında düzeltmek. Çeviri aşamasının kenar küvet algılama objektif lens altında ortalanır ve böylece, uzağa mikroskop kademesinin merkezine yaklaşık 2 cm konumlandırılmasını sahip olduğuna dikkat edin. </li><li> İlk birinde ikinci manuel çeviri aşamasında düzeltmek. Iki aşamadan yönleri (X ve Y çeviri) dik olması gerekir. </li><li> Önceki iki aşamada üstündeki Z piezoelektrik sahne düzeltildi. Motorlu bir aşamada yerine piezoelektrik aşamasının kullanılabilir unutmayın. </li><li> Küveti holde Fixr aşamaları üstündeki (bkz. Şekil 2). Bu şekilde küvet aydınlatma yolu kesiştiği ve birbirine dik olan algılama yol, yerleştirilecektir. </li></ol> 2.. Light Sheet denetleme <ol><li> Floresan çözeltisi olan bir cam küvet doldurun ve iki optik yolları kesiştiği numune tutucuya yerleştirin. Işık levha böylece görünür. Bu yatay olmak zorundadır, ve simetrik / algılama objektif lens göre merkezlenmiştir. </li><li> Silindirik lens çıkarın ve ışık tabakanın kalınlığını ölçmek için bir görseli kazanır. Işık tabakanın kalınlığı aydınlatma objektif lensi (NA için yaklaşık 3-4 um = 0.3) sayısal açıklık (NA) bağlı olduğunu not edin. Belirli bir lens için unutmayın, ışık-tabakasının kalınlığı bir yarık ile arka deliğe giren kirişin boyutunu azaltarak arttırılabilir. Flüoresan mikro balta ölçmek için kullanılabilir unutmayınmikroskobu ial ve yanal çözünürlük. </li><li> Deneye başlamadan önce silindirik merceği geri koydu. </li></ol> 3.. C. montajı elegans Embriyolar Aşağıdaki adımlar, Şekil 3&#39;te resmedilmiştir. <ol><li> 10 x 20 x 1 mm bir cam slayt bir parça kesmek için bir elmas-işaretleme kalemi kullanın. </li><li> % 5 Bacto-agar hazırlanması 60 ° C de su içinde, kaynatın ve bir ısıtıcı blok korumak </li><li> Slaydın kesme parçasının bir tarafında, poli-L-lisin, 50 ul, bu kurutun. </li><li> Bankta bir mikroskop lamı yerleştirin ve bunu düzeltmek. </li><li> Sabit slayt ile sürgünün kesme parçası yan yana ve üst agar erimiş bir damla ekleyin. Bir ince agar ped almak için başka bir temiz bir mikroskop lamı kullanılarak agar sıkıştırın. </li><li> Agar pad, üst kızağın çıkarmadan önce kurumasını bekleyin. </li><li> , Yaklaşık 3 mm o fazlalığı bırakmak için sabit sürgünün yan tarafında bulunan agar ped Cutf agar ve yavaşça sabit slayt kaldırmak. </li><li> Agarda poli-L-lisin 50 mcL ekleyin ve tamamen kurumasını bekleyin. </li><li> Bir saat cam M9 ortamda gebe solucanlar koyun. </li><li> Embriyoların serbest bırakmak için bir neşter ile vulva seviyesinde solucanlar kesin. </li><li> Bir binoküler altında ilgi aşamada embriyoların belirlemek ve microcapillary pipet kullanarak bunları toplamak. </li><li> Slaydın kesim parçasından çıkıntı yapan ve poli-L-lisin ile kaplanmış olan agar parçası embriyolar yerleştirin. Sadece yanında slayt sınırına embriyolar yerleştirin. Yeterince kararlı olmayacak çünkü ağar sınırında embriyoların pozisyon yok. Embriyolar, poli-L-lisin tabaka üzerinde kalacak şekilde yavaşça sıvıyı çıkarın. </li><li> Çabuk kuruma önlemek için embriyolar hizalayın. </li><li> Bir plastik Petri kabındaki kesim slayt yerleştirin ve yavaşça slayt kapsayacak M9 orta ekleyin. </li><li> Yumurta hala agar üzerinde sıkışmış bir binoküler altında kontrol edin. </li&gt; </ol> C. 4. Kayıt elegans Geliştirme <ol><li> , Numune tutucu içindeki, önceki hazırlama (kesme slayt, agar artı embriyo) saptamak ve bir küvet içine yerleştirin. Şekil 4, ev yapımı tutucusunu tarif etmektedir ve Şekil 5, gözlem bağlamında küvet bir görünüşünü göstermektedir. </li><li> Piezoelektrik sahnede küvet düzeltmek. </li><li> Parlak bir alan aydınlatma ile embriyoların konumunu belirlemek. </li><li> AOTF, kamera ve piezoelektrik sahne kontrol ev yapımı yazılımını başlatın. Böyle micromanager gibi ücretsiz bir yazılım, de kullanılabilir unutmayın. </li><li> Lazer hattı ve güç (AOTF) seçin. </li><li> Silindirik lens ve aydınlatma merceği destekleyen 3 tarifi sahne kullanarak ışık tabakanın konumunu ayarlayın. En parlak sinyali elde etmek için yanal yön (X) boyunca sahne hareket ettirin. Th elde etmek için daha sonra ışık tabakanın Z konumu ve uzunlamasına konum (Y) ayarlayıngürültü oranı e iyi sinyal. Işık tabaka odak pozisyonu hafif yol uzunlukları farklılıkları düzeltmek için bir embriyo diğerine ayarlanması gerekebilir unutmayın. </li><li> Zaman atlamalı görüntüler elde etmek için, iki görüntü, hem de elde edilecek görüntülerin sayısı ve lazer güç arasında zaman kazanmak, pozlama süresini seçin. 2 renk edinimi için, ikinci bir lazer satırı seçin. İki renkli görüntüler art arda elde edilir. </li><li> Az yığınını kazanmak için, aynı zamanda, iki dilim arasındaki mesafeyi ve başlangıç ​​ve piezoelektrik pozisyonları biten seçin. </li></ol>

<ol>
	<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy.">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305, 1007-1009 (2004).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology.">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136, 1963-1975 (2009).</li><li>Reynaud, E. G., Krzic, U., Greger, K., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet-based+fluorescence+microscopy:+more+dimensions,+more+photons,+and+less+photodamage.">Light sheet-based fluorescence microscopy: more dimensions, more photons, and less photodamage.</a> HFSP J. 2, 266-275 (2008).</li><li>Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+embryonic+cell+lineage+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Dev Biol. 100, 64-119 (1983).</li><li>Hardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+embryonic+morphogenesis+in+C.+elegans.">Imaging embryonic morphogenesis in C. elegans.</a> Methods Cell Biol. 106, 377-412 (2011).</li><li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inverted+selective+plane+illumination+microscopy+(iSPIM)+enables+coupled+cell+identity+lineaging+and+neurodevelopmental+imaging+in+Caenorhabditis+elegans.">Inverted selective plane illumination microscopy (iSPIM) enables coupled cell identity lineaging and neurodevelopmental imaging in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 17708-17713 (2011).</li><li>Giurumescu, C. A., Kang, S., Planchon, T. A., Betzig, E., Bloomekatz, J., Yelon, D., Cosman, P., Chisholm, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+semi-automated+analysis+of+morphogenesis+with+single-cell+resolution+in+complex+embryos.">Quantitative semi-automated analysis of morphogenesis with single-cell resolution in complex embryos.</a> Development. 139, 4271-4279 (2012).</li><li>Gao, L., Shao, L., Higgins, C. D., Poulton, J. S., Peifer, M., Davidson, M. W., Wu, X. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive+Imaging+beyond+the+Diffraction+Limit+of+3D+Dynamics+in+Thickly+Fluorescent+Specimens.">Noninvasive Imaging beyond the Diffraction Limit of 3D Dynamics in Thickly Fluorescent Specimens.</a> Cell. 151, 1370-1385 (2012).</li><li>Krzic, U., Gunther, S., Saunders, T. E., Streichan, S. J., Hufnagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiview+light-sheet+microscope+for+rapid+in+toto+imaging.">Multiview light-sheet microscope for rapid in toto imaging.</a> Nat Methods. 9, 730-733 (2012).</li><li>Tomer, R., Khairy, K., Amat, F., Keller, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+high-speed+imaging+of+entire+developing+embryos+with+simultaneous+multiview+light-sheet+microscopy.">Quantitative high-speed imaging of entire developing embryos with simultaneous multiview light-sheet microscopy.</a> Nat Methods. 9, 755-763 (2012).</li><li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Even+fluorescence+excitation+by+multidirectional+selective+plane+illumination+microscopy+(mSPIM).">Even fluorescence excitation by multidirectional selective plane illumination microscopy (mSPIM).</a> Opt Lett. 32, 2608-2610 (2007).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol C. in vivo görüntüleme için ışık sac mikroskobu kolay bir kurulum açıklar elegans embriyolar. Lazerler, ışın genişletici, kolimasyonu ve odaklanma lensler de dahil olmak üzere ışık tabakası oluşturmak ve uyum için gerekli optik elemanlar, kolayca bir optik tezgah üzerine monte edilebilir. Algılama yolu ve kamera için dik bir mikroskop ile birlikte, bu kurulum için basit bir çözüm, bir ışık mikroskobu tabaka sağlar. Bu geometri örnek çevre basit yapar. Canlı numune düzenlenen yerleştirilmiş ve mekanik parçaları küçük bir set ile hareket eden bir cam küvet içinde yerleştirilir. Tabaka aydınlatma mikroskobu yeteneği kesit ile geniş alan teknik olduğu için, yalnızca tek bir eksen motorlu hareket 3D görüntüleme için gereklidir. Bu, tek bir tarama elemanı senkronizasyon ihtiyacı sınırlar ve yazılım geliştirilmesini kolaylaştırır. ISPIM 6 bizim dik geometrik karşılaştırıldığındary tespiti için yüksek NA objektif lens kullanımına izin verir. Yatay düzlemde objektifler ile SPIM kurulumları ile karşılaştırıldığında numune montaj ve embriyonun bir dizi görüntü daha kolaydır. Toplamda, bu tekniğin uygulanması basittir ve optik az uzmanlık ile elde edilebilir. Bu yüksek hız ve düşük fototoksisite ancak daha düşük eksenel kararı dezavantajı avantajları ile konfokal mikroskoplar için ucuz bir alternatif olduğunu. Ayrıca C montaj için kolay ve tekrarlanabilir bir yöntem geliştirdi Bu sistemi kullanarak in vivo görüntüleme için elegans embriyolar. Montaj prosedürü hızlıdır (15 dakika) ve günlük deneyler için de uygundur. C. için elegans görüntüleme, bu basit kurulum avantajları en az iki-kıvrımlar vardır: toto görüntüleme (i) rotasyon olmadan mümkün değildir ve bu nedenle 3 boyutlu rekonstrüksiyon basittir; (Ii) örnek montaj kolay ve birden fazla embriyoların sırayla görüntülenebilirAynı slaytta. Biz hücre bölünmeleri ve hücre şekil değişiklikleri gözlemlemek için yeterli zamansal çözünürlüğe sahip time-lapse film örnekler gösterdi. C çalışma ışık sac mikroskobu gücü elegans gelişme yakın zamanda diğerleri 6, 7, 8 ile izah edilmiştir. Dolayısıyla, bu teknik, C morfojenezini ve model çalışma için çok yararlı olacaktır elegans embriyo. Bu sistem aynı zamanda diğer model organizmaların gelişimini analiz etmek için kullanılabilir? Bu, kabul edilmesi önemlidir ki, C gibi küçük ve şeffaf bir organizma için tabaka aydınlatma mikroskobu uygulanması elegans Drosophila embriyolar gibi daha büyük canlılar için daha az katıdır. Drosophila toto görüntülemede normal rotasyon ve multi-view rekonstrüksiyon 9, 10. kolineer uyarma objektif lens ile iki taraftan Uyarımı&#39;nı da attenuat neden gölge etkileri azaltılmış olabilir gerektirirIşık 11 iyon. Yine, burada sunulan kurulum hala düşük ağartma ve düşük photoxicity ile, Drosophila embriyoların görüntü bir tarafına şekilde uyarlanmıştır. Bu kurulum aynı zamanda ascidians veya zebrabalıkları gibi görüntü küçük ve şeffaf embriyolar için yararlı olabilir.

Bir organizmanın oluşumu ve şekillendirme hücre hareketleri, hücre şekli değişiklikleri, hücre bölünmesi ve hücre farklılaşması içerir. Bu süreçlerin ilerlemesini ve koordinasyonunu Anlamak üç boyut özelliği ve subsellüler çözünürlüğü ile hızlı görüntüleme araçları gerektirir. Bu in vivo görüntüleme yetenekleri ile teknikler arasında, hafif levha aydınlatma mikroskobu da tek / seçici düzlem aydınlatma mikroskopisi adlandırılan düşük fototoksik etkilerini ve 1,2 düşük ışıkla üreten benzersiz bir avantaja sahiptir. Tabaka aydınlatma mikroskopi, numune optik kesit yerine hafif bir levha ile taraftan aydınlatılır. Aydınlatma yolu ve algılama yol birbirine dik olan ve ışık tabaka algılama objektif lens nesne odak düzlemi denk hizalanır. Numune, iki yol kesiştiği yerleştirilen birnd 3D görüntü sağlamak için algılama ekseni boyunca hareket ettirilebilir. Ilgi sadece düzlemi aydınlatılır ve bu düzlemin tüm noktalar aynı anda tespit edilir. Bu durum elde etme hızını artırır ve konfokal mikroskopi 3 ile karşılaştırıldığında, photobleaching hem de fototoksisite azaltır. Iki boyutlu görüntüleme için, herhangi bir tarama algılama kısmı için, ne de aydınlatma kısmı için ne gereklidir;: Pratik olarak, sac aydınlatma mikroskopisi kurulum ve uyum sağlamaya kolaydır yeteneği kesit ile bir geniş alan teknik olarak, üç boyutlu görüntü örnek tutma aşamasının, bir tek eksenli bir hareket ile elde edilebilir. Burada C toto görüntüleme için basit bir ışık mikroskobu levha ve uygulama kurulmasını sunmak elegans embriyolar. C. elegans embriyolar de in vivo ima yaşamak için uygundurOnların şeffaflığı nedeniyle Ging, değişmeyen soy ve hücre basmakalıp, 4,5 konumlandırır. Geliştirilen ışık tabaka ayar tespit edilmesi için standart bir dik bir mikroskop dayanmaktadır. Aşağıda sunulan protokol oluşturmak ve hizaya uyarma modülü / yolunu, testi ve ışık tabakası karakterize ve 3D görüntüleme için örnek monte etmek nasıl ayrıntıları. Ayrıca floresan belirteçlerin ifade çeşitli cinsler üzerinde kurulum ile edinilen time-lapse film örnekleri sağlar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="812">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td>SPIM</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Detection</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>upright microscope</td>
			<td>ZEISS</td>
			<td>Axiophot 1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>100xW objective (NA 1.1, W.D. 2.5mm)&#160;</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>EMCCD back illuminated</td>
			<td>ANDOR</td>
			<td>DU-885K-CS0-#VP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Illumination</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 488nm / 60mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>LASER 405nm / 120mW</td>
			<td>TOPTICA</td>
			<td>iBeam smart</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="34">
			<td>LASER 561nm / 500mW</td>
			<td>COBOLT</td>
			<td>JIVE 500</td>
			<td>&#160;for time lapse imaging, 50 or 100mW is enough</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>filter Quad line laser rejectionband ZET 405/488/561/638</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F57-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 405</td>
			<td>AHF</td>
			<td>F38-405</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Dichroic 488</td>
			<td>SEMROCK</td>
			<td>Di01-R488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>AOTF</td>
			<td>AA</td>
			<td>AOTFnC-400.650-TN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>mirror</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 50mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>lens 200mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td></td>
			<td>telescope 5X</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>periscope</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>RS99/M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cylindrical lens f=100mm</td>
			<td>THORLABS</td>
			<td>ACY254-100-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>10X NA 0,3</td>
			<td>NIKON</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>xyz stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Sample</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>Bectkton Dickinson</td>
			<td>214010</td>
			<td>5% in water</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Poly-L-Lysine solution&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P8920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Capillaries GC100F-10, 1.0mm oD, 0,58mm ID, 100 mm L</td>
			<td>Havard Appartus</td>
			<td>30-0019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Aspiration tube (mouth pipette)</td>
			<td>Dutsher</td>
			<td>55005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>M9 medium:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>KH2PO4 (3g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Na2HPO4 (6g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>NaCL (5g/L)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>MgSO4 (1mM final)</td>
			<td>Any supplier</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Brice Detailleur&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>sample holder</td>
			<td>HOME MADE</td>
			<td></td>
			<td>made by Claude Moretti&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>x stage</td>
			<td>NEWPORT</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>coverslip 50x20x1mm</td>
			<td>MARIENFELD</td>
			<td></td>
			<td>cut then in 10x20x1mm</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>piezo electric stage with amplifier/controller</td>
			<td>PI</td>
			<td>P-622.ZCD / E-625.CR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>cuvette 40mmx40mmx10mm</td>
			<td>HELLMA</td>
			<td>704.002-OG.40 mm- 10mm high</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td>Diamond Point Glass Marking Pencil</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Software</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td>C++ (Qt) home made software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>developed by Olivier Blanc and Claire Chard&#232;s, available on request. Alternative solutions: micromanager or labview&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

setting up a simple light sheet microscope for in toto imaging of c. elegans development

Hızlı ve düşük fototoksik görüntüleme teknikleri toto organizmaların gelişimini incelemek için ön koşul vardır. Subsellüler çözünürlükte 3D görüntüler sunarken, hafif levha bazında mikroskopisi, foto-ağartma ve konfokal mikroskopi göre fototoksik etkilerini azaltır. Burada dik bir mikroskop ve ışık tabakanın oluşturulması için opto-mekanik elemanlarının küçük bir set oluşan bir ışık mikroskobu bazlı tabaka, bir kurulum mevcut. Protokol, inşa mikroskop hizalayın ve ışık tabakası karakterize anlatılmaktadır. Buna ek olarak, C toto görüntüleme yöntemini uygulamak için nasıl ayrıntıları elegans basit bir gözlemi odacığı kullanılarak embriyolar. Yöntem geliştirme birkaç saatten fazla 3D iki-renk time-lapse film yakalama sağlar. Bu uzun süre üzerinde hücre şekli, hücre bölünmeleri ve etiketli proteinlerin izleme kolaylığı olmalıdır.

Üç farklı C. Üç 3D time-lapse kayıt deneyleri elegans suşu, yukarıda tarif edilen levha ışık mikroskobu kurulumu kullanılarak elde edilebilir veri tipini göstermektedir. Biz, bu koşullar altında embriyoları SPIM görüntüleme C &#39;de sadece düşük seviyelerde fototoksisite neden olduğunu gösteren daha önceki raporlar ile uyumludur, normal hızda geliştirmek ve görüntüleme hayatta kontrol elegans 6,7 embriyolar. İlk gerginlik GFP (; stIs10024 zuIs178) kaynaşmış bir histon ifade eder. Kayıt her 37 saniye alınan 20 dilim (dilim 1 um arasındaki mesafe) bir yığını ile 2 saat boyunca gerçekleştirildi. 6, farklı zaman noktalarında, yığının bir düzlemi Şekil göstermektedir. Hem interphasic çekirdekleri (ok) ve yoğunlaştırılmış mitotik kromatin (ok başı) açıkça görülebilir. İkinci streyn GFP (ruIs57) kaynaşmış bir tübülin ve bir histon ekspresemCherry (; stIs10226 itIs37) kaynaşmış. Kayıt her 105 sn alınan 20 dilim (dilimler 1 mikron arasındaki mesafe) bir yığın ile 16 dakika boyunca yapıldı. 7. yığını ve farklı zaman noktalarında farklı düzlemleri göstermektedir Şekil. Ilişkili film 1 görüntüler 3 ardışık zaman noktalarında rekonstrüksiyon 3D. Bölünme sırasında, mitotik iğ (yeşil) ve yoğunlaştırıldı kromozomlar (kırmızı) açık bir şekilde gelişimi esnasında hücre bölünmesi yönelimlerin izleme sağlayan görebilir. Üçüncü suşu GFP (pwIs23) kaynaştırılmış apolipoprotein VIT-2 ifade eden ve mCherry (ltIs44) bağlanmış bir zar. Kayıt her 30 sn alınan 10 dilim (dilimler 1 mikron arasındaki mesafe) bir yığın ile 25 dakika boyunca yapıldı. 8. yığını ve farklı zaman noktalarında farklı düzlemleri göstermektedir Şekil. Hücrelerin içinde sarısı lipoprotein partikülleri (yeşil) hızlı hareketleri kolaylıkla olabilirizledi. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1: aydınlatma ve algılama birimleri, ön ve alt görünümleri oluşan SPIM optik kurulum. Aydınlatma ünitesinde, dikroik aynalar ile kombine lazer bağımsız olarak her lazerin gücünü kontrol AOTF girin. Daha sonra, teleskop 4-kat kiriş boyutunu artırır ve periskop mikroskop yüksekliğine getirir. Silindirik lens aydınlatma amacı ile yeniden odaklanır ışık tabakası oluşturur. Deteksiyon ünitesi dik bir mikroskop entegre edilmiştir ve temel olarak algılama lens, filtre, tüp lens ve EMCCD tarafından oluşur. Numune, aydınlatma ve saptama yolları arasındaki kesişme konumlandırılır. Bir piezoelektrik aşama sağlar: numunenin dikey (Z) yer değiştirmeleri3D edinimi için. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2:. Küvet tutucu tutucu 3 alüminyum plakalar oluşur ve piezoelektrik sahnede vidalanır. Cam küvet (kırmızı) bir yay tarafından yapılır. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3: C Montaj protokol SPIM deneyler için elegans embriyolar. Bir cam kesme parçası, poli-L-lisin ile kaplanmıştır. Agar bir ped kaplanmış yüzeyi üzerinde konumlandırılmıştır. Poli-L-lisin sonra agar ped üzerine ilave edilir. Son olarak, C. elegans embriyolar, poli-L-lizin kaplı agar pedi üzerinde hizalanır. Şekil 4: Örnek yeri. Tutucu cam küvetinin iç boyutlarına uyar. (Kırmızı) iki yayları (Şekil 3 &#39;de tarif edilen) cam slayt tutun. Bu tutucu sonra cam küvet içine konur. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5:... Numune tutucu gözlem bağlamında Embriyolar protokol, Şekil 3&#39;te özetlenebilir göre olan cam kesit üzerinde immobilize edilmektedir slayt, Şekil 4 &#39;de tarif edilen numune tutucu tarafından tutulan numune taşıyıcı cam küvet içinde eklenir, Şekil 2&#39;de tarif edilen tutucu tarafından tutulan. ışık tabaka i yatay vetaraftan embriyolar lluminates. Algılama objektif numune üzerinde, dikeydir. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6: Bir C kayıt histon :: GFP füzyon ifade elegans embriyo bir transgenik embriyo Tek düzlem görüntüleri bir histon :: GFP füzyon (zuIs178; stIs10024) ifade farklı zaman noktalarında 3D time-lapse kayıt çıkarılan Görüntüler:.. 20. dilimleri (yapılan yığınları dilimleri 1 mikron arasındaki mesafe); dilim başına maruz kalma süresi: 30 msn; yığınlar arasındaki zaman aralığı: 37 sn; toplam alma süresi: 2 saat. Ok: interphasic çekirdeği, ok başı: yoğunlaştırılmış mitoz kromatin. T = 0 dak embriyo 2 hücreli aşamada ve normal gelişim s altında, beklendiği gibi, t ​​= 120 dakika yaklaşık 70 embriyo hücreleri içeren(tek bir düzlem içinde, sadece hücreler, embriyo tüm hücreleri değil resimlerde görülebilir ve unutmayın) işedi. Aydınlatma gücü (aydınlatma amacı çıkışında ölçülen) 488 nm&#39;de 30 μW oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure6.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig7highres.jpg" width="500" /> Şekil 7: Bir C kayıt elegans bir Tubulin :: GFP füzyon ifade embriyo ve bir Histone :: MCherry füzyon. bir C 3D time-lapse kayıt çıkarılan Görüntüler Bir Tubulin :: GFP füzyon (ruIs57) ve histon :: MCherry füzyon (; stIs10226 itIs37) ifade elegans embriyo. Kayıt koşulları: 1 dilim arasında 20 dilimleri (mesafe bir yığın edinimimikron) her 105 sn; toplam alma süresi: 16 dakika; maruz kalma süresi: Her kanal için 200 msn. Panel aynı yığın 10 dilim gösterir. Panel b aynı dilim her 210 sn gösterir. Aydınlatma gücü (aydınlatma amacı çıkışında ölçülen), sırasıyla 488 ve 561 nm lazerler, 30 μW ve 300 μW oldu. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure7.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51342/51342fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8: bir C kayıt Bir VIT-2 :: GFP füzyon ifade elegans embriyo ve C 3D time-lapse kayıt çıkarılan bir membran hedefli MCherry. Görüntüler elegans embriyo bir VIT-2 :: GFP füzyon ifade (PADS23) ve bir membran-hedefli mCherry (ltIs44). Kayıt koşulları: 10 dilim (dilimler 1 mikron arasındaki mesafe) her 30 saniye bir yığın satın alınması; toplam alma süresi: 25 dakika; Kanal başına maruz kalma süresi: 200 msn. Panel aynı yığının ilk 5 dilim gösterir. Panel b aynı dilim her 30sec gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51342/51342_LenneBertrand_Figure8.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development at JoVE.com

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar.

Için bir Basit Işık Formu Mikroskop Kurma<em&gt; Toto yılında</em&gt; Gürüntülenmesi<em&gt; C. elegans</em&gt; Gelişme

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

setting-up-simple-light-sheet-microscope-for-toto-imaging-c-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

23.1K Görüntüleme.  UMR7288 CNRS, Aix-Marseille Université.  Bu protokol, bir ışık mikroskobu tabaka setup ve C in vivo görüntüleme için uygulanmasını açıklamaktadır elegans embriyolar. 

Video: Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

Mikroenjeksiyon Kararlı Transgenik C. elegans Üretimi

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Biyoloji

Major Components of the Light Microscope

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for different applications, and how it should be maintained as required to obtain maximum image-forming capacity and resolution. The components of the microscope are described in detail here.

Işık Mikroskobu Binbaşı Bileşenleri

The light microscope is a basic tool for the cell biologist, who should have a thorough understanding of how it works, how it should be aligned for ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

Transgenik, Üretimi C. elegans Biyolistik Dönüşüm

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using fluorescent-labeled reporter proteins or differential interference contrast (DIC) microscopy, allows for the examination of the temporal progression of these dynamic events which is otherwise inferred from analysis of fixed samples1,2. Moreover, the study of the developmental regulations of cellular processes necessitates conducting time-lapse experiments on an intact organism during development. The Caenorhabiditis elegans embryo is light-transparent and has a rapid, invariant developmental program with a known cell lineage3, thus providing an ideal experiment model for studying questions in cell biology4,5and development6-9. C. elegans is amendable to genetic manipulation by forward genetics (based on random mutagenesis10,11) and reverse genetics to target specific genes (based on RNAi-mediated interference and targeted mutagenesis12-15). In addition, transgenic animals can be readily created to express fluorescently tagged proteins or reporters16,17. These traits combine to make it easy to identify the genetic pathways regulating fundamental cellular and developmental processes in vivo18-21. In this protocol we present methods for live imaging of C. elegans embryos using DIC optics or GFP fluorescence on a compound epifluorescent microscope. We demonstrate the ease with which readily available microscopes, typically used for fixed sample imaging, can also be applied for time-lapse analysis using open-source software to automate the imaging process.

Imaging C. elegans Embryos using an Epifluorescent Microscope and Open Source Software

The C. elegans embryo is a powerful system for studying cell biology and development. We present a protocol for live imaging of C. elegans embryos utilizing DIC optics or fluorescence using readily available epifluorescent microscopes and open-source software.

Görüntüleme C. elegans Embriyolar Epifluorescent Mikroskop ve Açık Kaynak Yazılım

Cellular processes, such as chromosome assembly, segregation and cytokinesis,are inherently dynamic. Time-lapse imaging of living cells, using ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

Içinde Postembryonic Fenotiplerin Belirleme RNAi Tarama C. elegans</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and physiology. Thus, organisms have evolved targeted and specific stress responses dedicated to repair damage and maintain homeostasis. These mechanisms include the unfolded protein response of the endoplasmic reticulum (UPRER), the unfolded protein response of the mitochondria (UPRMT), the heat shock response (HSR), and the oxidative stress response (OxSR). The protocols presented here describe methods to detect and characterize the activation of these pathways and their physiological consequences in the nematode, C. elegans. First, the use of pathway-specific fluorescent transcriptional reporters is described for rapid cellular characterization, drug screening, or large-scale genetic screening (e.g., RNAi or mutant libraries). In addition, complementary, robust physiological assays are described, which can be used to directly assess sensitivity of animals to specific stressors, serving as functional validation of the transcriptional reporters. Together, these methods allow for rapid characterization of the cellular and physiological effects of internal and external proteotoxic perturbations.

Measurements of Physiological Stress Responses in C. Elegans

Here, we characterize cellular proteotoxic stress responses in the nematode C. elegans by measuring the activation of fluorescent transcriptional reporters and assaying sensitivity to physiological stress.

C. Eleganlarda Fizyolojik Stres Tepkilerinin Ölçüleri

Organisms are often exposed to fluctuating environments and changes in intracellular homeostasis, which can have detrimental effects on their proteome and ...

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS) and Huntington&#8217;s disease. Recently, repeat expansion-containing RNA was shown to be the substrate for a novel type of protein translation called repeat-associated non-AUG-dependent (RAN) translation. Unlike canonical translation, RAN translation does not require a start codon and only occurs when repeats exceed a threshold length. Because there is no start codon to determine the reading frame, RAN translation occurs in all reading frames from both sense and antisense RNA templates that contain a repeat expansion sequence. Therefore, RAN translation expands the number of possible disease-associated toxic peptides from one to six. Thus far, RAN translation has been documented in eight different repeat expansion-based neurodegenerative and neuromuscular diseases. In each case, deciphering which RAN products are toxic, as well as their mechanisms of toxicity, is a critical step towards understanding how these peptides contribute to disease pathophysiology. In this paper, we present strategies to measure the toxicity of RAN peptides in the model system C. elegans. First, we describe procedures for measuring RAN peptide toxicity on the growth and motility of developing C. elegans. Second, we detail an assay for measuring postdevelopmental, age-dependent effects of RAN peptides on motility. Finally, we describe a neurotoxicity assay for evaluating the effects of RAN peptides on neuron morphology. These assays provide a broad assessment of RAN peptide toxicity and may be useful for performing large-scale genetic or small molecule screens to identify disease mechanisms or therapies.

Measuring RAN Peptide Toxicity in C. elegans

Repeat-associated non-ATG-dependent translational products are emerging pathogenic features of several repeat expansion-based diseases. The goal of the protocol described is to evaluate toxicity caused by these peptides using behavioral and cellular assays in the model system C. elegans.

C. elegans RAN Peptid Toksisitesi Ölçme

C. elegans is commonly used to model age-related neurodegenerative diseases caused by repeat expansion mutations, such as Amyotrophic Lateral Sclerosis ...

Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample chamber-based setups, which are specifically designed to preserve the three-dimensional integrity of the specimen and usually feature sample rotation, are the best choice in developmental biology. For instance, they have been used to document the entire embryonic morphogenesis of the fruit fly Drosophila melanogaster and the red flour beetle Tribolium castaneum. However, many available live imaging protocols provide only experimental frameworks for single embryos. Especially for comparative studies, such approaches are inconvenient, since sequentially imaged specimens are affected by ambient variance. Further, this limits the number of specimens that can be assayed within a given time. We provide an experimental framework for simultaneous live imaging that increases the throughput in sample chamber-based setups and thus ensures&#160;similar ambient conditions for all specimens. Firstly, we provide a calibration guideline for light sheet fluorescence microscopes. Secondly, we propose a mounting method for multiple embryos that is compatible with sample rotation. Thirdly, we provide exemplary three-dimensional live imaging datasets of Drosophila, for which we juxtapose three transgenic lines with fluorescently labeled nuclei, as well as of Tribolium, for which we compare the performance of three transgenic sublines that carry the same transgene, but at different genomic locations. Our protocol is specifically designed for comparative studies as it pro-actively addresses ambient variance, which is always present in sequential live imaging. This is especially important for quantitative analyses and characterization of aberrational phenotypes, which result e.g., from knockout experiments. Further, it increases the overall throughput, which is highly convenient when access to light sheet&#160;fluorescence microscopes is limited. Finally, the proposed mounting method can be adapted for other insect species and further model organisms, e.g., zebrafish, with basically no optimization effort.

Light sheet-based fluorescence microscopy is the most valuable tool in developmental biology. A major issue in comparative studies is ambient variance. Our protocol describes an experimental framework for simultaneous live imaging of multiple specimens and, therefore, addresses this issue pro-actively.

Örnek Oda Bazlı Işık Tabakası Floresan Mikroskoplarında Birden Fazla Böcek Embriyosunun EşZamanlı Canlı Görüntülenmesi

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

Light Sheet Microscopy of Fast Cardiac Dynamics in Zebrafish Embryos

Embryonic cardiac research has greatly benefited from advances in fast in vivo light sheet fluorescence microscopy (LSFM). Combined with the rapid external development, tractable genetics, and translucency of the zebrafish, Danio rerio, LSFM has delivered insights into cardiac form and function at high spatial and temporal resolution without significant phototoxicity or photobleaching. Imaging of beating hearts challenges existing sample preparation and microscopy techniques. One needs to maintain a healthy sample in a constricted field of view and acquire ultrafast images to resolve the heartbeat. Here we describe optimized tools and solutions to study the zebrafish heart in vivo. We demonstrate the applications of bright transgenic lines for labeling the cardiac constituents and present novel gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental defects and changes in heart rate. We also propose a data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging. The entire workflow presented here focuses on zebrafish embryonic heart imaging but can also be applied to various other samples and experiments.

We describe optimized tools to study the zebrafish heart in vivo with light sheet fluorescence microscopy. Specifically, we suggest bright cardiac transgenic lines and present new gentle embedding and immobilization techniques that avoid developmental and heart defects. A possible data acquisition and analysis pipeline adapted to cardiac imaging is also provided.