We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

ويتضح A المخطط العام للبروتوكول في الشكل 1. 1. خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على 10-15٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 10 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 10 ملي Hepes، البنسلين (100 وحدة / مل)، الستربتوميسين (100 ملغ / مل)، و 2 مم L-الجلوتامين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على خلايا هوه 7.5.1 13 في وسائط النمو الكامل الذي يحتوي على ملاحق أعلاه في المختبر لتحليل التهاب الكبد C دورة تكاثر الفيروس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة سلالات فيروسية في خلايا هوه 7.5.1 مع وسائل الإعلام تستكمل النمو المحدد عند 37 درجة مئوية مع نسبة 5٪ CO 2. </li></ol> 2. الفيروسات ويبني البلازميد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد شكل التكميلية الحمض النووي ([كدنا]) من HCV RNA واستنساخ قبل أن تتحول إلى ناقل البلازميد لسهولة التلاعب الجيني. ملاحظة: اكتشاف التهاب الكبد مداهم اليابانية 1، JFH-1 (النمط الجيني 2A HCV)، وعزل كانت حرجة للبحوث HCV وتستخدم في المقام الأول لدراسة دورة النسخ المتماثل HCV 11-13. وتستخدم الفيروسات خيالية بين وintragenotypic استنادا JFH HCV-1 عادة في البحوث 14-18. وقد وصفت بناء الاصطناعية intragenotype 2A الفيروس خيالية، FNX-HCV، وmonocistronic سلالة مراسل خيالية سابقا 19 و البناء التفاصيل هي خارج نطاق هذا البروتوكول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام pFNX-HCV فيروس intragenotype 2A كما أنه يحتوي على 5&#39;NTR والمناطق وP7 الهيكلية، وجزء من مناطق غير الهيكلية NS2 (النيوكليوتيدات 1-2878) من سلالة الأبوية J6CF (NCBI الانضمام لا. AF177036)، و كذلك مكونات غير الهيكلية من سلالة فيروسية JFH-1 (NCBI الانضمام لا. AB047639). ملاحظة: تم تصنيعه FNX-HCV على أساس تسلسل قطعة Jc1 intragenotype 2A HCV خيالية ذكرت سابقا 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توليد خيالية مراسل بناء الفيروسية monocistronic، وpFNX-Rluc، استنادا إلى سلالة pFNX-HCV (أعلاه في الخطوة 2.2) عن طريق إدراج Renilla luciferase المراسل الجينات بين &#39;NTR 5 والجينات الأساسية (بين الإقليم الشمالي 388 و 389). بعد ذلك، ربط الجينات و luciferase الجينات الأساسية لهذا البناء باستخدام القدم والفم مرض فيروس 2A (F2A) تسلسل الببتيد، التي من شأنها أن تعمل كإشارة الانقسام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مهندس الحمض النووي الريبي بوليميراز الصفرية (بول) بناء الفيروسية باستخدام إما pFNX-HCV أو الخلفية الفيروسية pFNX-Rluc. استبدال بقايا الحفاز NS5B البلمرة، GDD (أأ 2759-2761؛ الإقليم الشمالي 8615-8623)، من أي من هذه العمود الفقرى الفيروسية مع بقايا حمض أميني الاهلي. </li></ol> 3. HCV RNA في المختبر النسخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام intragenotype 2A خيالية فيروس HCV-FNX وFNX-HCV بول فارغة (بول) HCV لتقييم تكاثر الفيروس (الشكل 2A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خطي البلازميدات الفيروسي مع XbaI انزيم التقييد وثم التعامل مع مونج الفول نوكلياز لتوليد نهايات حادة. تنقية البلازميدات هضمها من قبل أنيون تبادل اللوني. تحقق من تكامل سو على خطي البلازميد بإخضاع الحمض النووي لالاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوين البلازميدات الفيروسي خطي باستخدام البلمرة T7-RNA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية توليفها حديثا RNA المعالجة الدناز باستخدام طقم تنقية الحمض النووي الريبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من إنتاج الحمض النووي الريبي التي كتبها الاغاروز الكهربائي للهلام (الشكل 2C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس الحمض النووي الريبي بواسطة القياس الطيفي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين الحمض النووي الريبي ولدت في -80 درجة مئوية في 10 ميكروغرام مأخوذة العمل. ملاحظة: لتقليل التباين في نوعية الحمض النووي الريبي في كل التصميم التجريبي قبل الكتابة عن الحمض النووي الريبي لكل عينة فيروسية ومراقبة في نفس الوقت. </li></ol> 4. HCV RNA ترنسفكأيشن وجمع العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حصاد الخلايا هوه 7.5.1 باستخدام التربسين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لشطف الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي و resuspend تعليق الباردة مرتين مع وسائل الاعلام المصل منخفضة. resuspend الخلايا في مصل الدم المنخفض وسائل الاعلام في 1 × 10 7 خلية لكل مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج ما مجموعه 10 &amp; #956؛ غرام من الحمض النووي الريبي الفيروسي كتب مع 400 ميكرولتر من الخلايا معلق (4 × 10 6 خلايا) في 0.4 سم كفيت electroporation. بالنقل الخلايا عن طريق التثقيب الكهربائي في 270 V، 100 Ω، و 950 μF. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الخلايا electroporated في 10 مل وسائط النمو الكامل مع FBS 15٪. ملاحظة: يعتبر زيادة البقاء على قيد الحياة من خلايا electroporated عندما كانت خلايا هوه 7.5.1 مثقف في 15٪ مصل بقري جنيني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في كل من T-25 قوارير (~ 1.2 × 10 6 خلايا في قارورة) وألواح جيدا 48 (1 × 10 4 خلايا لكل بئر) لكل نقطة من النقاط الزمنية التالية: 4، 48 و 96 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال وسائل الإعلام في 4-8 ساعة بعد ترنسفكأيشن مع الطازجة وسائط النمو تستكمل مع FBS 10٪ لإزالة الحطام الخلية الميتة من قوارير ومثقف لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatants ثقافة الخلية الحصاد في 48 و 96 نقطة الساعة ساعة وإزالة الحطام الخلوية من العينات التي تم جمعها بواسطة الطرد المركزي الخلايا في 1،500 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقيقة على 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين supernatants خالية من الخلايا في -80 درجة مئوية. ليز الخلايا للبروتين وتحليل الحمض النووي الريبي لطخة الغربية وعكس النسخ PCR الكمي في نقاط زمنية المشار إليه. </li></ol> 5. عكس النسخ كمي PCR (RT-QPCR) لتقييم النسخ HCV الجينوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء من خطوتين RT-QPCR لتحديد HCV RNA الجيني في عدد النسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إكتب العكسي 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع الخلوية باستخدام الناسخ العكسي والتمهيدي محددة لHCV الشعور الذي يربط حبلا ل5&#39;NTR (JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) أو التمهيدي محددة من أجل الوطن الجين peptidylprolyl مصاوغة G (R PPIG : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3). عكس أيضا تدوين FNX-HCV RNA (ولدت في الخطوة 3) نسخ من الجينوم المعروفة (10 يناير - 10 سبتمبر قياسي) استخدام الحس HCV حبلا التمهيدي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنفيذ QPCR باستخدام 50 نانوغرام من [كدنا] كتب الناتجة باستخدام بادئات محددة HCV (JFH RTQF: 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3؛ JFH RTQ R: 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;) والحمض النووي ملزم الصبغة الخضراء التي تحتوي على مزيج QPCR عظمى. أداء QPCR من أجل الوطن PPIG الجينات وكذلك (الاشعال PPIG F: 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;؛ PPIG R: 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) ملاحظة: للحصول على حساب دقيق بين الخلايا HCV RNA المستوى عبر العينات، واستخدام الجينات الخلوية التدبير المنزلي، PPIG ، ومستوى التعبير (دورة ط) للتطبيع. استخدام رقم نسخة من الجينوم FNX-HCV كمعيار لتحديد عدد النسخ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشروط التالية عند تشغيل QPCR لتحديد عدد نسخ الحمض النووي الريبي HCV: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية و 60 &#160; درجة مئوية لمدة 30 ثانية (40 دورات) في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أنظر الشكلين 3A 3B للنتائج وتكرار الجينوم. </li></ol> 6. تحليل الغربية التنشيف للكشف عن HCV التعبير البروتين (الشكل 3C) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخلية لست الابالحمض النووي الريبي الفيروسي ام transfected في 96 ساعة ترنسفكأيشن آخر للبروتين تحليل النشاف الغربية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل المحللة الخلية باستخدام SDS-PAGE ونقل إلى difluoride البولي فينيل (PVDF) الغشاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منع الغشاء باستخدام محلول يحتوي على حجب الحليب الخالي من الدسم 5٪، 0.2٪ توين 20 في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الغشاء مع الابتدائي الماوس ريتوكسيماب NS3 (1 في 1،000 التخفيف) وبيتا الأكتين (1 في 5،000 التخفيف). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماعز مفتش مكافحة الماوس مترافق إلى البيروكسيديز الفجل (1 في 5،000 التخفيف) وكشف من قبل لمعان كيميائي. </li></ol> 7. المناعي الفحص (IFA) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا المصابة وtransfected HCV باستخدام الميثانول لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة -20 درجة مئوية لمدة المناعي الفحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ومنع مع ايفا للعرقلة العازلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الأرنب بولكلونل مكافحة NS5A الأجسام المضادة في المقام الأول (شريطة التفضل الدكتور داسجوبتا، UCLA) أو الماوس وحيدة النسيلة المضادة للDSRNA الأضداد J2 في التخفيف من 1:200 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 5 ساعة بين عشية وضحاها لفي 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات بعد الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الماعز المضادة للأرنب مفتش-488 الضد الثانوية بولكلونل أو الماعز المضادة للماوس مفتش-594 الضد الثانوية بولكلونل في التخفيف 1:1،000 (1 ميكروغرام / مل)، واحتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني ثلاث مرات ونوى وصمة عار باستخدام هويشت الصبغة وطريقة العرض باستخدام المجهر الفلورسنت (الشكل 3D). </li></ol> 8. عيار قياس الفيروسات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة ساذجة هوه 7.5.1 الخلايا في حوالي 3 × 10 3 خلية / جيدا باستخدام لوحة 96 جيدا. في اليوم التالي، نفذ التخفيفات التسلسلي 10 أضعاف للثقافة خالية من الخلايا طاف تحصد من الحمض النووي الريبي transfected خلايا الكبد الوبائي باستخدام وسائل الإعلام النمو وتطعيم في ثلاث نسخ على هوه 7.5.1 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الخلايا في 72 ساعة بعد العدوى باستخدام الميثانول (لمدة 30 دقيقة في -20 </suع&gt; º C) وimmunostain لHCV البروتين NS5A كما جاء في المادة 7. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام أعلى التخفيف من الاعتماد على البؤر الإيجابية NS5A وحساب متوسط ​​عدد التركيز وحدة تشكيل (FFU) في الملليمتر الواحد. انظر الشكل (4) لفيروس (سي) عيار. </li></ol> 9. Renilla luciferase المراسل مراسل الفحص لالفيروسية الجينوم النسخ المتماثل والعدوى <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي، لوحة HCV-RNA electroporated هوه 7.5.1 الخلايا في ثلاث نسخ في لوحات 48 جيدا (1 × 10 4 خلايا / جيد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا مع 75 ميكرولتر من تحلل العازلة السلبي في ساعة 6، 48 ساعة، و 96 ساعة بعد ترنسفكأيشن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موسيقى الروك لوحات بلطف لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وتخزينها في -80 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لقياس Renilla luciferase المراسل النشاط الأنزيمي، ذوبان الجليد في المحللة البروتين وRenilla luciferase المراسل الكواشف مقايسة إلى درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 20 ميكرولتر من البروتين المحللة لكل بئر من على بعد 96 أهلا وسهلا<html> ل لوحة التلألؤ البيضاء ووضع لوحة في luminometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستغناء 100 ميكرولتر من Renilla luciferase الفحص الكاشف (coelenterazine الركيزة عازلة +) لكل بئر، وبعد 2 ثانية قبل قراءة تأخير؛ دمج الضوء المنبعث لمدة 10 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب المتوسط ​​والانحراف المعياري لكل عينة من القيم luciferase المراسل من يثلث البيولوجية وإخضاع البيانات إلى التحليل الإحصائي (الشكل 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم العدوى، تطعيم 500 ميكرولتر من طاف خالية من الخلايا التي تم الحصول عليها من خلايا transfected الحمض النووي الريبي HCV لنقاط الوقت المشار إليه (48 ساعة و 96 ساعة) في ثلاث نسخ على السذاجة هوه 7.5.1 الخلايا في لوحات 48 عاما أيضا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال اللقاح الفيروسي مع 500 ميكرولتر من متوسطة جديدة لكل بئر بعد 6 ساعة بعد العدوى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز الخلايا في 48 ساعة بعد الإصابة، وتخضع لRenilla luciferase الفحص كما هو موضح في الخطوات 8،2-8،7 (الشكل 5). </li></ol>itle &quot;&gt; 10. التحليل الإحصائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أشرطة الخطأ في الرسوم البيانية تشير الانحرافات المعيارية (SD). تم حساب القيم P من ر الاختبار المفردة. </li></ol>

<ol>
	<li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Epidemiology+of+hepatitis+C.">J. Epidemiology of hepatitis C.</a> Hepatology.. 26(3 Suppl 1), (1997).</li><li>Alter, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=J.+Epidemiology+of+hepatitis+C+virus+infection.">J. Epidemiology of hepatitis C virus infection.</a> World J Gastroenterol. 13 (17), 2436-2441 (2007).</li><li>Lavanchy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+global+burden+of+hepatitis+C.">The global burden of hepatitis C.</a> Liver Int. 29 (Suppl 1), 74-81 (2009).</li><li>Lindenbach, B. D., Thiel, H. J., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Flaviviridae: viruses and their replication in Fields Virology. , 1101-1152 (2007).</li><li>Ciesek, S., Manns, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+in+2010:+the+dawn+of+a+new+era+in+HCV+therapy.">Hepatitis in 2010: the dawn of a new era in HCV therapy.</a> Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8 (2), 69-71 (2011).</li><li>Ghany, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+update+on+treatment+of+genotype+1+chronic+hepatitis+C+virus+infection:+2011+practice+guideline+by+the+American+Association+for+the+Study+of+Liver+Diseases.">An update on treatment of genotype 1 chronic hepatitis C virus infection: 2011 practice guideline by the American Association for the Study of Liver Diseases.</a> Hepatology. 54 (4), 1433-1444 (2011).</li><li>Choo, Q. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+a+cDNA+clone+derived+from+a+blood-borne+non-A,+non-B+viral+hepatitis+genome.">Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome.</a> Science. 244 (4902), 359-362 (1989).</li><li>Kolykhalov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transmission+of+hepatitis+C+by+intrahepatic+inoculation+with+transcribed+RNA.">Transmission of hepatitis C by intrahepatic inoculation with transcribed RNA.</a> Science. 277 (5325), 570-574 (1997).</li><li>Lohmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+of+subgenomic+hepatitis+C+virus+RNAs+in+a+hepatoma+cell+line.">Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line.</a> Science. 285 (5424), 110-113 (1999).</li><li>Blight, K. J., Kolykhalov, A. A., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+initiation+of+HCV+RNA+replication+in+cell+culture.">Efficient initiation of HCV RNA replication in cell culture.</a> Science. 290 (5498), 1972-1974 (2000).</li><li>Lindenbach, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+replication+of+hepatitis+C+virus+in+cell+culture.">Complete replication of hepatitis C virus in cell culture.</a> Science. 309 (5734), 623-626 (2005).</li><li>Wakita, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+infectious+hepatitis+C+virus+in+tissue+culture+from+a+cloned+viral+genome.">Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome.</a> Nat Med. 11 (7), 791-796 (2005).</li><li>Zhong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robust+hepatitis+C+virus+infection+in+vitro.">Robust hepatitis C virus infection in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (26), 9294-9299 (2005).</li><li>Yi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compensatory+mutations+in+E1,+p7,+NS2,+and+NS3+enhance+yields+of+cell+culture-infectious+intergenotypic+chimeric+hepatitis+C+virus.">Compensatory mutations in E1, p7, NS2, and NS3 enhance yields of cell culture-infectious intergenotypic chimeric hepatitis C virus.</a> J Virol. 81 (2), 629-638 (2007).</li><li>Pietschmann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Construction+and+characterization+of+infectious+intragenotypic+and+intergenotypic+hepatitis+C+virus+chimeras.">Construction and characterization of infectious intragenotypic and intergenotypic hepatitis C virus chimeras.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7408-7413 (2006).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+efficient+full-length+hepatitis+C+virus+genotype+1+(strain+TN)+infectious+culture+system.">Highly efficient full-length hepatitis C virus genotype 1 (strain TN) infectious culture system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (48), 19757-19762 (2012).</li><li>Yi, M., Lemon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genotype+1a+HCV+(H77S)+infection+system.">Genotype 1a HCV (H77S) infection system.</a> Methods Mol Biol. 510, 337-346 (2009).</li><li>Gottwein, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+hepatitis+C+reporter+viruses+with+genotype+1+to+7+core-nonstructural+protein+2+(NS2)+expressing+fluorescent+proteins+or+luciferase+in+modified+JFH1+NS5A.">Development and application of hepatitis C reporter viruses with genotype 1 to 7 core-nonstructural protein 2 (NS2) expressing fluorescent proteins or luciferase in modified JFH1 NS5A.</a> J Virol. 85 (17), 8913-8928 (2011).</li><li>Arumugaswami, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+functional+profiling+of+hepatitis+C+virus+genome.">High-resolution functional profiling of hepatitis C virus genome.</a> PLoS Pathog. 4 (10), (2008).</li><li>Chu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+analysis+of+enhancer+and+critical+cis-acting+RNA+elements+in+the+protein-encoding+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome.">Systematic analysis of enhancer and critical cis-acting RNA elements in the protein-encoding region of the hepatitis C virus genome.</a> J Virol. 87 (10), 5678-5696 (2013).</li><li>Salloum, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rab18+binds+to+hepatitis+C+virus+NS5A+and+promotes+interaction+between+sites+of+viral+replication+and+lipid+droplets.">Rab18 binds to hepatitis C virus NS5A and promotes interaction between sites of viral replication and lipid droplets.</a> PLoS Pathog. 9 (8), (2013).</li><li>Gonzalez, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selection+of+an+optimal+RNA+transfection+reagent+and+comparison+to+electroporation+for+the+delivery+of+viral+RNA.">Selection of an optimal RNA transfection reagent and comparison to electroporation for the delivery of viral RNA.</a> J Virol Methods. 145 (1), 14-21 (2007).</li><li>Phan, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS2+protein+contributes+to+virus+particle+assembly+via+opposing+epistatic+interactions+with+the+E1-E2+glycoprotein+and+NS3-NS4A+enzyme+complexes.">Hepatitis C virus NS2 protein contributes to virus particle assembly via opposing epistatic interactions with the E1-E2 glycoprotein and NS3-NS4A enzyme complexes.</a> J Virol. 83 (17), 8379-8395 (2009).</li><li>Schaller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+hepatitis+C+virus+superinfection+exclusion+by+using+novel+fluorochrome+gene-tagged+viral+genomes.">Analysis of hepatitis C virus superinfection exclusion by using novel fluorochrome gene-tagged viral genomes.</a> J Virol. 81 (9), 4591-4603 (2007).</li><li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+hepatitis+C+virus+lacking+the+envelope-encoding+genes+for+single-cycle+infection+by+providing+homologous+envelope+proteins+or+vesicular+stomatitis+virus+glycoproteins+in+trans.">Production of hepatitis C virus lacking the envelope-encoding genes for single-cycle infection by providing homologous envelope proteins or vesicular stomatitis virus glycoproteins in trans.</a> J Virol. 85 (5), 2138-2147 (2011).</li><li>Jones, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+p7+and+NS2+proteins+are+essential+for+production+of+infectious+virus.">Hepatitis C virus p7 and NS2 proteins are essential for production of infectious virus.</a> J Virol. 81 (16), 8374-8383 (2007).</li><li>Steinmann, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+p7+protein+is+crucial+for+assembly+and+release+of+infectious+virions.">Hepatitis C virus p7 protein is crucial for assembly and release of infectious virions.</a> PLoS Pathog. (7), (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يصف هذا التوضيح طريقة لتحليل دورة النسخ المتماثل فيروس التهاب الكبد الوبائي. HCV هو الممرض الإنسان وسوف بروتوكول السلامة الأحيائية وصفه يجب اتباعها بدقة. وقد وصفت نظم زراعة الخلايا HCV المعدية سابقا 11-13،16،17. هناك عدد قليل من النقاط الحاسمة عندما ننفذ بعد بروتوكول...

التهاب الكبد الوبائي (HCV) يسبب تليف الكبد وسرطان الكبد. فإنه يؤثر على 170 مليون شخص في جميع أنحاء العالم مع 350،000 شخص يموتون سنويا 1-3. HCV هو حبلا إيجابية فيروس الحمض النووي الريبي مع حجم الجينوم من 9.6 كيلو بايت. تتم ترجمة الجينوم HCV باعتبارها واحدة من polyprotein ~ 3،000 الأمينية بقايا حمض التي المشقوق proteolytically من قبل مختلف البروتياز الخلوية والفيروسية في 10 البروتينية. سي هو فيروس النموذج في جنس Hepacivirus وينتمي إلى عائلة الفيروسات المصفرة 4. عند التعرض، HCV يحدد عدوى مزمنة في 80٪ من الأفراد. العدوى بدون أعراض في الغالب والتشخيص في الوقت المناسب يمكن أن تسمح التدخل العلاجي لمنع تدهور الكبد. العلاج الحالي هو الأمثل وأي لقاح متاح 5،6. وكان أول وصف مسببات التهاب الكبد C في عام 1989 7. دراسة النسخ المتماثل HCV المهم لقاح التهاب الكبد C والبحوث العلاج، ولكن كان عليهأعاق طويلة من عدم وجود نظام الثقافة الفيروسية كفاءة. وقد أظهرت استنساخ الجزيئي للفيروس (سي) لتكون معدية في الشمبانزي على التلقيح داخل الكبد 8. في وقت لاحق، وصفت replicons HCV الفرعية الجيني، مما سمح لتشريح الفيروسية مرحلة تكرار الجينوم في 9،10 نظام خلية ثقافة. اكتشاف HCV الوراثي 2A عزل JFH-1 (اليابانية التهاب الكبد مداهم-1)، القادرة على إصابة خلية ثقافة فتحت آفاقا جديدة للبحث تكرار HCV 11-13. سلالة النمط الجيني 2A JFH-1 استنادا الفيروسات خيالية بين وداخل الوراثي والنمط الجيني 1 HCV هي أنظمة الثقافة المعدية استنادا المتاحة، فضلا 14-18. وقد استخدمنا بنجاح JFH-1 سلالة وHCV intragenotype 2A الفيروس خيالية للحصول على دقة عالية خارطة التنميط وظيفية من المجالات البروتين ورابطة الدول المستقلة المفعول عناصر الحمض النووي الريبي 19،20. وفقا لهذا، ونحن هنا تصف نظام الثقافة فعالة تستخدم بشكل روتيني أن يسمحدراسة مراحل مختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV والتفاعل المضيف الممرض. نقدم فحوصات الفيروسية لتقييم تكرار الجينوم الفيروسي والعدوى نوفو دي من intragenotype 2A سي ومراسل سي Renilla luciferase المراسل القائمة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:267px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:267px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Non essential amino acid</td>
			<td style="width:267px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">HEPES</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Glutamax</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Huh-7.5.1</td>
			<td style="width:267px;">The Scripps Research Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:569px;">Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cedars-Sinai Medical Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">P1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:267px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Nanodrop 2000</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Electroporation Cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:267px;">Bioexpress</td>
			<td>E-5010-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Gene Pulser Xcell Total System</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&#160;</td>
			<td>English &#38; Scientific Consulting Kft.</td>
			<td style="width:119px;">10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td>A11020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVDF membrane package</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">162-0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-6404XTU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Tween-20</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-6531XTU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]</td>
			<td style="width:267px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab65407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]</td>
			<td style="width:267px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab13830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents&#160;</td>
			<td style="width:267px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">RPN2236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SUPERSCRIPT III RT&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ViiA 7 real-time PCR system</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla Luciferase Assay System kit</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">GloMax-Multi Detection System (Luminometer)</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for analyzing hepatitis c virus replication

التهاب الكبد C فيروس (HCV) يؤثر على 3٪ من سكان العالم ويسبب أمراض خطيرة في الكبد بما في ذلك التهاب الكبد المزمن، تليف الكبد، وسرطان الكبد. سي هو فيروس الحمض النووي الريبي يلفها ينتمون إلى عائلة الفيروسات المصفرة. العلاج الحالية ليست فعالة تماما ويسبب آثار جانبية ضارة. لا يوجد لقاح التهاب الكبد الوبائي المتاحة. وبالتالي، مطلوب جهد استمر لتطوير لقاح وعلاج أفضل. خلية نظام الثقافة HCV أمر بالغ الأهمية لدراسة مختلف مراحل النمو بما في ذلك دخول الفيروس HCV، وتكرار الجينوم، والتغليف، والخروج. في الإجراء الحالي قدم، كنا فيروس من النوع البري intragenotype 2A خيالية، FNX-HCV، والمؤتلف فيروس FNX-Rluc يحمل Renilla luciferase المراسل مراسل الجينات لدراسة تكاثر الفيروس. خط الخلية الكبدي الإنسان كان يستخدم لترنسفكأيشن في المختبر (7 هوه القائم) كتب HCV الرنا الجيني. supernatants ثقافة خالية من الخلايا، لست] البروتين ورتم حصادها RNA OTAL في وقت مختلف النقاط بعد ترنسفكأيشن لتقييم النمو HCV. تم تقييم HCV الجينوم حالة النسخ المتماثل التي كتبها الكمي RT-PCR وتصور وجود HCV RNA المزدوج تقطعت بهم السبل. تم التحقق من التعبير البروتين HCV بواسطة وصمة عار والمقايسات المناعي الغربية باستخدام الأجسام المضادة المحددة لHCV NS3 وNS5A البروتينات. وقد تم قياس الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل HCV RNA صدر الجسيمات المعدية في طاف الثقافة وعيار الفيروسية. واستخدمت المقايسات luciferase المراسل لتقييم مستوى التكرار والعدوى مراسل سي. في الختام، فإننا نقدم مختلف المقايسات الفيروسية لوصف المراحل المختلفة من دورة النسخ المتماثل HCV.

فيروس التهاب الكبد C هو فيروس الحمض النووي الريبي. وبالتالي لغرض التلاعب الجيني، وقد تم استنساخ [كدنا] HCV الجيني في البلازميد ناقلات البكتيرية. وقدم تسلسل الحمض النووي الريبي بوليميراز المروج T7 مباشرة قبل 5 &#39;نهاية الجينوم HCV. ويرد المخطط العام للتحليل HCV سير العمل في <...

Watch this Scientific Journal Video about A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication at JoVE.com

A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

بروتوكول لتحليل التهاب الكبد الوبائي فيروس النسخ المتماثل

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

a-protocol-for-analyzing-hepatitis-c-virus-replication

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.9K Views.  Cedars-Sinai Medical Center. Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle. 

Video: A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of infection with influenza virus alone. Instead, most individuals are thought to have succumbed to a secondary bacterial infection, predominately caused by the bacterium Streptococcus pneumoniae (the pneumococcus). The synergistic relationship between infections caused by influenza virus and the pneumococcus has subsequently been observed during the 1957 Asian influenza virus pandemic, as well as during seasonal outbreaks of the virus (reviewed in 1, 2). Here, we describe a protocol used to investigate the mechanism(s) that may be involved in increased morbidity as a result of concurrent influenza A virus and S. pneumoniae infection. We have developed an infant murine model to reliably and reproducibly demonstrate the effects of influenza virus infection of mice colonised with S. pneumoniae. Using this protocol, we have provided the first insight into the kinetics of pneumococcal transmission between co-housed, neonatal mice using in vivo imaging 3.

Using Bioluminescent Imaging to Investigate Synergism Between Streptococcus pneumoniae and Influenza A Virus in Infant Mice

A concurrent infection with influenza A virus is one of the factors implicated in the induction of invasive pneumococcal disease during asymptomatic Streptococcus pneumoniae carriage. Here we describe a mixed infection method using infant mice to investigate the synergism between these two respiratory pathogens.

باستخدام التصوير Bioluminescent بالتحقيق في التآزر بين العقدية الرئوية والأنفلونزا من الفيروسات في الفئران الرضع

During the 1918 influenza virus pandemic, which killed approximately 50 million people worldwide, the majority of fatalities were not the result of ...

Dissecting Host-virus Interaction in Lytic Replication of a Model Herpesvirus

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral cytokine production1,2. In order to colonize the host, viruses are obligate to evade host antiviral responses and manipulate signaling pathways. Unraveling the host-virus interaction will shed light on the development of novel therapeutic strategies against viral infection.
Murine &gamma;HV68 is closely related to human oncogenic Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus and Epsten-Barr virus3,4. &gamma;HV68 infection in laboratory mice provides a tractable small animal model to examine the entire course of host responses and viral infection in vivo, which are not available for human herpesviruses. In this protocol, we present a panel of methods for phenotypic characterization and molecular dissection of host signaling components in &gamma;HV68 lytic replication both in vivo and ex vivo. The availability of genetically modified mouse strains permits the interrogation of the roles of host signaling pathways during &gamma;HV68 acute infection in vivo. Additionally, mouse embryonic fibroblasts (MEFs) isolated from these deficient mouse strains can be used to further dissect roles of these molecules during &gamma;HV68 lytic replication ex vivo.
Using virological and molecular biology assays, we can pinpoint the molecular mechanism of host-virus interactions and identify host and viral genes essential for viral lytic replication. Finally, a bacterial artificial chromosome (BAC) system facilitates the introduction of mutations into the viral factor(s) that specifically interrupt the host-virus interaction. Recombinant &gamma;HV68 carrying these mutations can be used to recapitulate the phenotypes of &gamma;HV68 lytic replication in MEFs deficient in key host signaling components. This protocol offers an excellent strategy to interrogate host-pathogen interaction at multiple levels of intervention in vivo and ex vivo.
Recently, we have discovered that &gamma;HV68 usurps an innate immune signaling pathway to promote viral lytic replication5. Specifically, &gamma;HV68 de novo infection activates the immune kinase IKK&beta; and activated IKK&beta; phosphorylates the master viral transcription factor, replication and transactivator (RTA), to promote viral transcriptional activation. In doing so, &gamma;HV68 efficiently couples its transcriptional activation to host innate immune activation, thereby facilitating viral transcription and lytic replication. This study provides an excellent example that can be applied to other viruses to interrogate host-virus interaction.

We describe a protocol to identify key roles of host signaling molecules in lytic replication of a model herpesvirus, gamma herpesvirus 68 (&gamma;HV68). Utilizing genetically modified mouse strains and embryonic fibroblasts for &gamma;HV68 lytic replication, the protocol permits both phenotypic characterization and molecular interrogation of virus-host interactions in viral lytic replication.

تشريح المضيف للفيروسات التفاعل في النسخ المتماثل التحللي من الفيروسة الموديل

In response to viral infection, a host develops various defensive responses, such as activating innate immune signaling pathways that lead to antiviral ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying Salmonella-host interactions are&#160;important to elucidate the molecular pathogenesis of Salmonella infection. The Gentamicin protection assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in phagocytic cells was adapted to allow high-throughput screening to define the roles of deletion mutants of Salmonella enterica serotype Typhimurium in host interactions using RAW 264.7 murine macrophages. Under this protocol, the variance in measurements is significantly reduced compared to the standard protocol, because wild-type and multiple mutant strains can be tested in the same culture dish and at the same time. The use of multichannel pipettes increases the throughput and enhances precision. Furthermore, concerns related to using less host cells per well in 96-well culture dish were addressed. Here, the protocol of the modified in vitro Salmonella invasion assay using phagocytic cells was successfully employed to phenotype 38 individual Salmonella deletion mutants for association, invasion and intracellular replication. The in vitro phenotypes are presented, some of which were subsequently confirmed to have in vivo phenotypes in an animal model. Thus, the modified, standardized assay to phenotype Salmonella association, invasion and replication in macrophages with high-throughput capacity could be utilized more broadly to study bacterial-host interactions.

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

A high-throughput assay to in vitro phenotype Salmonella or other bacterial association, invasion, and replication in phagocytic cells with high-throughput capacity was developed. The method was employed to evaluate Salmonella gene knockout mutant strains for their involvements in host-pathogen interactions.

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in mice. Recently, myeloid differentiation factor 88 (MyD88) signaling was shown to be important for initial T cell priming and memory T cell development during WNV NS4B-P38G mutant infection. In this study, two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and an intracellular cytokine staining (ICS) &#8211; were utilized to assess dendritic cells (DCs) and T cell functions. In the T cell priming assay, cell proliferation was analyzed by flow cytometry following co-culture of DCs from both groups of mice with carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) - labeled CD4+ T cells of OTII transgenic mice. This approach provided an accurate determination of the percentage of proliferating CD4+ T cells with significantly improved overall sensitivity than the traditional assays with radioactive reagents. A microcentrifuge tube system was used in both cell culture and cytokine staining procedures of the ICS protocol. Compared to the traditional tissue culture plate-based system, this modified procedure was easier to perform at biosafety level (BL) 3 facilities. Moreover, WNV- infected cells were treated with paraformaldehyde in both assays, which enabled further analysis outside BL3 facilities. Overall, these in vitro immunological assays can be used to efficiently assess cell-mediated immune responses during WNV infection.

In Vitro Analysis of Myd88-mediated Cellular Immune Response to West Nile Virus Mutant Strain Infection

Two flow cytometry-based methods &#8211; an in vitro T cell priming assay and intracellular cytokine staining were utilized to measure antigen presenting capacity of dendritic cells and antigen-specific T cell responses to a West Nile virus mutant infection in mice.

في تحليل المختبر من الاستجابة المناعية الخلوية بوساطة Myd88 لفيروس غرب النيل المسخ سلالة العدوى

An attenuated West Nile virus (WNV), a nonstructural (NS) 4B-P38G mutant, induced higher innate cytokine and T cell responses than the wild-type WNV in ...

Immunofluorescence to Monitor the Cellular Uptake of Human Lactoferrin and its Associated Antiviral Activity Against the Hepatitis C Virus

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or localization of a target molecule in cells and tissues. Immunofluorescence relies on the specificity of fluorescent-labelled antibodies against their corresponding antigens within a cell. Both direct and indirect immunofluorescence approaches can be used which rely on the use of antibodies linked with a fluorochrome. Direct immunofluorescence is less frequently used because it provides lower signal, involves higher cost and less flexibility. In contrast, indirect immunofluorescence is more commonly used because of its high sensitivity and provides an amplified signal since more than one secondary antibody can attach to each primary antibody. In this manuscript, both epifluorescence microscopy and confocal microscopy were used to monitor the internalization of human lactoferrin, an important component of the immune system, into hepatic cells. Moreover, we monitored the inhibitory potential of hLF on the intracellular replication of the Hepatitis C virus using immunofluorescence. Both the advantages and disadvantages associated with these approaches are discussed.

The human lactoferrin (hLF) is a component of the immune system. In this study, immunofluorescence assays are used to demonstrate both the hepatocellular uptake of hLF and a qualitative reduction in the hepatitis C virus replication upon treatment with hLF.

المناعي لمراقبة الخلوية امتصاص اللاكتوفيرين الإنسان ولها نشاط مضاد للفيروسات أسوشيتد ضد فيروس التهاب الكبد الوبائي C

Immunofluorescence is a laboratory technique commonly used to study many aspects of biology. It is typically used to visualize the distribution and/or ...

A Miniaturized Glycan Microarray Assay for Assessing Avidity and Specificity of Influenza A Virus Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the natural reservoir for IAV, but IAV can cross the species barrier to poultry, swine, horses and humans. Avian viruses recognize sialic acid attached to a penultimate galactose by a &#945;2-3 linkage (avian-type receptors) whereas human viruses preferentially recognize sialic acid with a &#945;2-6 linkage (human-type receptors). To monitor if avian viruses are adapting to human type receptors, several methods can be used. Glycan microarrays with diverse libraries of synthetic sialosides are increasingly used to evaluate receptor specificity. However, this technique is not used for measuring avidities. Measurement of avidity is typically achieved by evaluating the binding of serially diluted hemagglutinin or virus to glycans adsorbed to conventional polypropylene 96-well plates. In this assay, glycans with &#945;2-3 or &#945;2-6 sialic acids are coupled to biotin and adsorbed to streptavidin plates, or are coupled to polyacrylamide (PAA) which directly adsorb to the plastic. We have significantly miniaturized this assay by directly printing PAA-linked sialosides and their non PAA-linked counterparts on micro-well glass slides. This set-up, with 48 arrays on a single slide, enables simultaneous assays of 6 glycan binding proteins at 8 dilutions, interrogating 6 different glycans, including two non-sialylated controls. This is equivalent to 18x 96-well plates in the traditional plate assay. The glycan array format decreases consumption of compounds and biologicals and thus greatly enhances efficiency.

Using a printed glycan microarray strategy, a conventional 96-well plate assay was miniaturized for analysis of influenza A virus hemagglutinin avidity and specificity for sialic acid containing receptors.

والمنمنمة غليكان ميكروأري الفحص لتقييم الطمع وخصوصية الأنفلونزا من الفيروسات Hemagglutinins

Influenza A virus (IAV) hemagglutinins recognize sialic acids on the cell surface as functional receptors to gain entry into cells. Wild waterfowl are the ...

Development of a Hepatitis B Virus Reporter System to Monitor the Early Stages of the Replication Cycle

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), that carry foreign genes such as a reporter or marker protein in their genomes. These recombinant viruses usually faithfully mimic the life cycle of the original virus in infected cells and exhibit the same host range dependence. The development of a recombinant virus enables the efficient screening of inhibitors and the identification of specific host factors. However, to date the construction of recombinant hepatitis B virus (HBV) has been difficult because of various experimental limitations. The main limitation is the compact genome size of HBV, and a fairly strict genome size that does not exceed 1.3 genome sizes, that must be packaged into virions. Thus, the size of a foreign gene to be inserted should be smaller than 0.4 kb if no deletion of the genome DNA is to be performed. Therefore, to overcome this size limitation, the deletion of some HBV DNA is required. Here, we report the construction of recombinant HBV encoding a reporter gene to monitor the early stage of the HBV replication cycle by replacing part of the HBV core-coding region with the reporter gene by deleting part of the HBV pol coding region. Detection of recombinant HBV infection, monitored by the reporter activity, was highly sensitive and less expensive than detection using the currently available conventional methods to evaluate HBV infection. This system will be useful for a number of applications including high-throughput screening for the identification of anti-HBV inhibitors, host factors and virus-susceptible cells.

Here we describe a newly developed hepatitis B virus (HBV) reporter system to monitor the early stages of the HBV life cycle. This simplified in vitro system will aid in the screening of anti-HBV agents using a high-throughput strategy.

تطوير نظام الفيروسات مراسل التهاب الكبد B لرصد المراحل المبكرة من دورة النسخ المتماثل

Currently, it is possible to construct recombinant forms of various viruses, such as human immunodeficiency virus 1 (HIV-1) and hepatitis C virus (HCV), ...

Rescue and Characterization of Recombinant Virus from a New World Zika Virus Infectious Clone

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral evolution. Here we describe the construction of an infectious clone for Zika virus (ZIKV), which is currently causing an explosive outbreak in the Americas. To prevent toxicity to bacteria that is commonly observed with flavivirus-derived plasmids, we generated a two-plasmid system which separates the genome at the NS1 gene and is more stable than full-length constructs that could not be successfully recovered without mutations. After digestion and ligation to join the two fragments, full-length viral RNA can be generated by in vitro transcription with T7 RNA polymerase. Following electroporation of transcribed RNA into cells, virus was recovered that exhibited similar in vitro growth kinetics and in vivo virulence and infection phenotypes in mice and mosquitoes, respectively.

This protocol describes the recovery of infectious Zika virus from a two-plasmid infectious cDNA clone.

إنقاذ وتوصيف الفيروسات المؤتلف من عالم جديد زيكا الفيروسات استنساخ العدوى

Infectious cDNA clones allow for genetic manipulation of a virus, thus facilitating work on vaccines, pathogenesis, replication, transmission and viral ...

"Liver-on-a-Chip" Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally infected chimpanzees, most in vitro models require several hundreds to thousands of viral genomes per cell in order to initiate a transient infection. Additionally, static 2D cultures of primary human hepatocytes (PHH) allow only short-term studies due to their rapid dedifferentiation. Here, we describe 3D liver-on-a-chip cultures of PHH, either in monocultures or in cocultures with other nonparenchymal liver-resident cells. These offer a significant improvement to studying long-term HBV infections with physiological host cell responses. In addition to facilitating drug efficacy studies, toxicological analysis, and investigations into pathogenesis, these microfluidic culture systems enable the evaluation of curative therapies for HBV infection aimed at eliminating covalently closed, circular (ccc)DNA. This presented method describes the set-up of PHH monocultures and PHH/Kupffer cell co-cultures, their infection with purified HBV, and the analysis of host responses. This method is particularly applicable to the evaluation of long-term effects of HBV infection, treatment combinations, and pathogenesis.

&quot;Liver-on-a-Chip&quot; Cultures of Primary Hepatocytes and Kupffer Cells for Hepatitis B Virus Infection

The goal of this protocol is to provide a step-by-step guide to perform 3-D &#34;liver-on-a-chip&#34; infection experiments with the hepatitis B virus.

الثقافات "الكبد على رقاقة" خلايا الكبد الأولية وخلايا كوبفر للعدوى بفيروس التهاب الكبد B

Despite the exceptional infectivity of the hepatitis B virus (HBV) in vivo, where only three viral genomes can result in a chronicity of experimentally ...

Identification of Coding and Non-coding RNA Classes Expressed in Swine Whole Blood

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying gene expression related to biological processes of interest. These innovations not only allow researchers to observe expression from the mRNA sequences that code for genes that effect cellular function, but also the non-coding RNA (ncRNA) molecules that remain untranslated, but still have regulatory functions. Although researchers have the ability to observe both mRNA and ncRNA expression, it has been customary for a study to focus on one or the other. However, when studies are interested in both mRNA and ncRNA expression, many times they use separate samples to examine either coding or non-coding RNAs due to the difference in library preparations. This can lead to the need for more samples which can increase time, consumables, and animal stress. Additionally, it may cause researchers to decide to prepare samples for only one analysis, usually the mRNA, limiting the number of biological questions that can be investigated. However, ncRNAs span multiple classes with regulatory roles that effect mRNA expression. Because ncRNA are important to fundamental biologic processes and disorder of these processes in during infection, they may, therefore, make attractive targets for therapeutics. This manuscript demonstrates a modified protocol for the generation mRNA and non-coding RNA expression libraries, including viral RNA, from a single sample of whole blood. Optimization of this protocol, improved RNA purity, increased ligation for recovery of methylated RNAs, and omitted&#160;size selection, to allow capture of more RNA species.

Here, we present a protocol optimized for the processing of coding (mRNA) and non-coding&#160;(ncRNA) globin reduced RNA-seq libraries from a single whole blood sample.

وأعرب عن تحديد الترميز وفئات الحمض النووي الريبي غير الترميز في الخنازير الدم كله

The advent of innovative and increasingly powerful next generation sequencing techniques has opened new avenues into the ability to examine the underlying ...