HBV الفيروسية في التكاثر خارج الكبد يلعب دورا هاما في التسبب في المتلازمات خارج الكبد. حاليا، نماذج ثقافة الخلية لبدء عدوى HBV خارج الكبد محدودة. نقدم نموذج عدوى غير الكبدية في المختبر للمساعدة في تحديد عوامل المضيف الجديدة التي تؤثر على تكرار HBV والتحقيق في أمراض الكلى المرتبطة HBV.
بالمقارنة مع نماذج العدوى HBV التقليدية، اعتمدنا وهندسنا 293T خط الخلية، 293T-NE-3NR، وشارك في استزراعه مع HepG2.2.15. وينبغي أن يتم تنفيذ العدوى بفيروس التهاب الكبد B في مستوى السلامة الأحيائية الثاني أو في مختبر السلامة الأحيائية الثالث. يجب اتباع ممارسات السلامة المختبرية لضمان سلامة العاملين في المختبرات وينبغي تطعيم جميع الباحثين والكشف عن الأجسام المضادة HBS إيجابية قبل إجراء تجارب HBV.
تبدأ من خلال زراعة خلايا HepG2.2.15 مع الأخذ في الاعتبار أن الخلية supernatant وكذلك جميع النصائح، وقارين، لوحات، والأنابيب التي تأتي في اتصال مع HepG2.2.15 ينبغي أن تكون غارقة في 2٪ virucide بين عشية وضحاها قبل التخلص منها. إزالة القارورة التي تحتوي على خلايا HepG2.2.15 من النيتروجين السائل وذوبان في دوامة لطيف في حمام الماء 37 درجة مئوية. نقل الخلايا إلى قارورة زراعة الأنسجة مربعة 25 سنتيمتراً وإضافة أربعة ملليلترات من متوسط الثقافة الكامل.
ثقافة الخلايا HepG2.2.15 في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة. تغيير الوسط كل ثلاثة أيام. عندما تكون جاهزة، وجمع عظمى الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر.
أغلق الغطاء بحزم ولفه بـ فيلم البارافين. لإزالة شظايا الخلية، قم بتصفية جهاز HepG2.2.15 مع غشاء ميكرومتر 0.45 في أنبوب طرد مركزي جديد سعة 50 ملليلتر. ثم إضافة 14 ملليلتر من عظمى تمت تصفيتها إلى عمود مركز الفيروسات وإغلاق الغطاء.
الطرد المركزي العمود في 3، 200 مرة ز لمدة 35 دقيقة في جهاز طرد مركزي الغزل الأفقي وجمع التركيز 2.2.2.15 فوق في أنبوب 1.5 ملليلتر. تشغيل PCR في الوقت الحقيقي للتأكد من أن التركيز إذا كان الحمض النووي HBV في التركيز فوق 2.2.15 هو في نطاق منحنى القياسية. تخفيف التركيز 20-fold بإضافة 10 ميكرولترات إلى 190 ميكرولترات من DMEM في أنبوب microcentrifuge 1.5 ملليلتر.
جنبا إلى جنب مع التركيز فوق، وإعداد سيطرة سلبية، والسيطرة الإيجابية، وأربعة تخفيف من المرجع الكمي. إضافة 450 ميكرولترات من HBV DNA استخراج العازلة لكل عينة والطرد المركزي لهم في 12،000 مرات ز لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. الجمع بين 27 ميكرولترات من مزيج رئيسي PCR وثلاثة microliters من انزيم طق polymerase لكل عينة في أنابيب PCR وضعت على الجليد.
ثم إضافة 20 ميكرولترات من عينة الطرد المركزي إلى كل أنبوب. تنفيذ PCR في الوقت الحقيقي وفقا لتوجيهات المخطوطات وتصدير قيم CT للحصول على منحنى قياسي. قسم التركيز فوق 2.2.15 اعلي اقسط وتخزينه في ناقص 80 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام.
إعداد عدوى المتوسطة وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم البذور HepG2-NE في اثنين من الآبار، 293T-NE-3NR الخلايا في بئرين، و 293T-NE في بئر واحد. احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة، لاحظ الخلايا والمضي قدما مع العدوى إذا كانت صحية. إضافة 500 ميكرولترات من مجمع العدوى إلى كل بئر واحتضان الخلايا لمدة 24 ساعة أخرى. غسل الخلايا مرتين مع 500 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني.
ثم يضاف ملليلتر واحد من متوسطة لكل بئر. تغيير المتوسطة بلطف كل يومين. في اليوم 11 ، يغسل الخلايا برفق مرتين مع 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وإصلاح الخلايا مع الميثانول البارد المثلج للفلوروس المناعي.
البذور 100، 000 خلية في بئر من HepG-NE في بئرين، 293T-NE-3NRs في بئرين، و 293T-NE في بئر واحد من لوحة. البذور 100، 000 خلية في بئر من HepG2.2.15 في خمسة إدراج الغشاء في لوحة منفصلة ستة-جيدا. احتضان الخلايا لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة، تأكد من أن الخلايا كلها منتَكِدة وفي حالة جيدة. تجاهل المتوسطة في لوحة ستة بئر وإدراج غشاء الخلية. ثم ضع الغشاء مع إدراج HepG2.2.15 في لوحة ستة جيدا بذر مع HEPG-NE، 293T-NE-3NRs، و 293T-NE.
احتضان الخلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون في حاضنة مرطبة، وتغيير المتوسطة كل ثلاثة إلى أربعة أيام. بعد 10 أيام، وإزالة إدراج الغشاء، وغسل بلطف الخلايا مع برنامج تلفزيوني مرتين، وإصلاح الخلايا مع الميثانول الباردة المثلج للflufluorescence. وقد أدى الاحتضان مع الأجسام المضادة الأساسية HBcAg وDAPI إلى تلطيخ متميز عند ملاحظته بهدف 10X على مجهر مقلوب فلوري.
تم تأكيد التوطين النووي من خلال التلطيخ مع DAPI وتم تحديد تعبير NTCP-EGFP مع الفلورس الخضراء. مواقع التعبير من HBcAg كانت موجودة مع الفلورس الأحمر. عندما DAPI و NTCP وHBcAg في نفس الخلية، الخلية قد تم بنجاح مع فيروس التهاب الكبد.
وكانت مجموعة السيكلوسبورين A هي السيطرة السلبية لأنها تمنع HBV من دخول الخلايا عن طريق منع نتروب. تم الكشف عن HBcAg في 293T-NE-3NRs، ولكن ليس في خلايا 293T-NE تشير إلى أن NTCP ليس العامل الوحيد الضروري لعدوى HBV في 293T. حالة الخلية جيدة وكفاءة العملية هي النقاط الرئيسية للحصول على نتائج ناجحة العدوى.
غسل لطيف وتغيير وسائل الإعلام بعد العدوى مهم أيضا. كبديل, التهاب الكبد الوبائي طريقة مع خلايا HepG2-NE القائم على الورم الكبدي لديه أعلى كفاءة العدوى من هذه الطريقة ومناسبة لفحص المخدرات المضادة HBV. النمذجة عدوى HBV في 293T-NE-3NR هو مجاملة مفيدة لنموذج الخلية التقليدية بسبب خلفية غير الكبدي لهذه الخلايا.
هذه الطريقة سوف تسهل دراسة عدوى فيروس التهاب الكبد في الخلايا غير الكبدية، فضلا عن العوامل المضيفة اللازمة للكبد من فيروس التهاب الكبد.
