We thank F. Chisari for providing Huh-7.5.1 cell line. We would like to thank Justine Ho for editing the manuscript. This work was supported by Cedars-Sinai Medical Center Institutional Programmatic Research Award and National Center for Advancing Translational Sciences, Grant UL1TR000124 to V.A.

프로토콜의 일반적인 개요는도 1에 도시되어있다. 1. 셀 <ol><li> 15 % 소 태아 혈청 (FBS), 10 mM의 비 필수 아미노산, 10mM의 헤 페스, 페니실린 (100 단위 / ml), 스트렙토 마이신 (100 ㎎ / ㎖), 및 2 mM의 L-글루타민을 포함 완전 성장 배지를 준비한다. </li><li> C 형 간염 바이러스의 복제주기의 체외 분석을 위해 위의 보충제를 포함하는 완전한 성장 매체 허-7.5.1 셀 (13)을 유지한다. </li><li> 5 % CO 2와 37 ° C에서 지정한 보충 성장 매체 허-7.5.1 세포 배양 바이러스의 변종. </li></ol> 2. 바이러스와 플라스미드 구문 <ol><li> HCV RNA의 상보 적 DNA (cDNA를) 형태로 생성 및 유전자 조작의 용이성을 위해 플라스미드 벡터로 복제. 참고 : 일본의 전격 성 간염 1의 발견은, JFH-1 (유전자형 2A의 HCV), HCV 연구에 대한 비판적이고있다 격리주로 HCV의 복제 사이클 11-13를 연구하는 데 사용. JFH-1 HCV에 따라 간 및 intragenotypic 키메라 바이러스는 일반적으로 연구 14-18에서 사용된다. 합성 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 monocistronic 키메라 기자 균주의 건설은 이미 19 건설 자세한 내용은이 프로토콜의 범위를 벗어 설명했다. </li><li> 그것은 (뉴클레오티드 1-2878) J6CF 부모의 변형 (NCBI의 기탁 아니오. AF177036)의, 같은 5&#39;NTR, 구조 지역과 P7 및 NS2 비 구조 영역의 일부를 포함로 pFNX-HCV intragenotype의 2A 바이러스를 사용 잘 JFH-1 바이러스 균주 (NCBI의 기탁 없습니다. AB047639)의 비 구조적인 구성 요소로. 참고 : FNX-HCV가 JC1의 intragenotype의 2A 키메라 HCV의 순서에 따라 합성 하였다 이전에 (15) 보도했다. </li><li> R을 삽입하여 (단계 2.2 이상) pFNX-HCV의 변형을 기반으로 monocistronic 키메라 기자 바이러스 구조, pFNX-Rluc를 생성5 &#39;NTR과 (NT 388과 389 사이의) 핵심 유전자 사이 enilla 루시퍼 라제 유전자. 이어서, 절단 신호로서 작동 할 구제역 바이러스 2A (F2A) 펩티드 서열을 사용하여 루시 페라 제 유전자 및이 구조의 핵심 유전자를 연결한다. </li><li> pFNX-HCV 또는 pFNX-Rluc 바이러스 배경을 사용하여 RNA 중합 효소 널 (폴) 바이러스 구조 엔지니어. , AAG의 아미노산 잔기 이러한 바이러스 백본 중 하나의, NS5B 효소 촉매 잔류 물, GDD (8615-8623을 NT AA 2,759에서 2,761 사이)를 교체합니다. </li></ol> 3. 체외 HCV의 RNA의 전사 <ol><li> intragenotype의 2A 키메라 바이러스 FNX-HCV와 FNX-HCV의 유류 널 (null) 바이러스 복제 (그림 2A)의 평가를위한 (폴) HCV를 사용합니다. </li><li> 를 XbaI 제한 효소로 바이러스 플라스미드를 선형화 한 다음 평활 말단을 생성하는 녹두 클레아로 취급한다. 음이온 교환 크로마토 그래피에 의해 소화 플라스미드를 정화. O를 무결성을 확인F 겔 전기 영동 (그림 2B)를 아가 로스의 DNA를 쓰는하여 플라스미드를 선형화. </li><li> -T7 RNA 중합 효소를 이용하여 선형화 된 바이러스 플라스미드를 표기. </li><li> RNA 정제 키트를 사용하여 새로 합성 된 DNA 분해 효소 처리 RNA를 정화. </li><li> 아가로 오스 겔 전기 영동 (그림 2C)에 의해 RNA의 생산을 확인합니다. </li><li> 분광 광도법에 의한 RNA의 양을. </li><li> 10 μg 작업 분량 씩 -80 ° C에서 생성 된 RNA를 저장합니다. 참고 : 같은 시간에 각각의 바이러스 샘플 및 제어를위한 모든 RNA를 해독하여 각 실험 설계 내에서 RNA의 품질의 변화를 최소화하기 위해. </li></ol> 4. HCV RNA 형질 및 시료 채취 <ol><li> 트립신을 사용하는 허-7.5.1 세포를 수확. </li><li> 세포 원심 분리기를 씻어 차가운 낮은 혈청 미디어로 두 번 정학을 재현 탁합니다. ML 당 1 × 10 7 세포에서 낮은 혈청 배지에서 세포를 Resuspend. </li><li> 10 &amp; # 총 혼합956, 0.4-CM의 일렉트로 큐벳에 재현 탁 세포 (4 × 10 6 세포)의 400 μL와 전사 바이러스 성 RNA의 g. 270 V에서 전기 충격을 통해 100 Ω, 950 μF을 세포를 형질. </li><li> 15 % FBS와 10 ㎖ 완전한 성장 미디어 일렉트로 세포를 Resuspend. 참고 : 허-7.5.1 세포는 15 % 소 태아 혈청에서 배양 할 때 일렉트로 세포의 증가 생존을 볼 수 있습니다. </li><li> 4, 48 및 96 시간 : 두 T-25 플라스크 (플라스크 당 ~ 1.2 × 10 6 세포) 및 48 - 웰 플레이트 다음과 같은 시점마다 (물론 당 1 × 10 4 세포)에서 세포를 접시. </li><li> 배양 플라스크와 접시에서 죽은 세포 파편을 제거하기 위해 10 % FBS와 신선한 보충 성장 매체와 4-8 시간 후 - 형질 전환에 용지를 교체하십시오. </li><li> 48, 96 시간의 시점에서, 4에서 10 분 동안 1,500 rpm에서 원심 분리하여 세포를 수집 한 시료에서 세포 파편을 제거 수확 세포 배양 상청액 º C. </li><li> -80 º C에서 세포가없는 상층 액을 저장 를 Lyse 웨스턴 블롯에 의해 단백질과 RNA 분석 및 지정된 시점에서 전사 정량적 PCR 역 세포. </li></ol> 5. HCV 게놈 복사를 평가하기위한 전사 정량 PCR (RT-qPCR에)를 역방향 <ol><li> HCV 게놈 RNA 카피 수를 결정하는 두 단계 RT-qPCR에를 수행합니다. </li><li> 역 쓰다 1 역전사 효소 및 5&#39;NTR (JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;)에 결합 HCV의 가닥 특정 프라이머 사용하여 총 세포 RN​​A ㎍의 또는 하우스 키핑 유전자 peptidylprolyl 이성화 효소 G (삑 R 특정 프라이머를 : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3 &#39;). 또한 HCV의 가닥 프라이머를 사용하여 알려진 게놈 사본 (10 1 9 표준 10)의 (3 단계에서 생성 된) FNX-HCV RNA를 표기 역. </li><li> (JFH RT HCV 특정 프라이머를 이용하여 생성 된 cDNA의 전사 50 NG를 사용하여 qPCR에를 수행QF : 5&#39;CTGGGTCCTTTCTTGGATAA-3; JFH RTQ R : 5&#39;CCTATCAGGCAGTACCACA-3 &#39;)와 DNA는 qPCR에 슈퍼 믹스를 포함하는 녹색 염료를 결합. 또한 하우스 키핑 유전자 삑위한 qPCR에 수행 (프라이머 삑 F : 5&#39;-GAAGAGTGCGATCAAGAACCCATGAC-3 &#39;, 삑 R : 5&#39;-GTCTCTCCTCCTTCTCCTCCTATCTTT-3&#39;) 참고 : 예제를 통해 정확한 세포 내 HCV의 RNA 수준을 계산하는 경우, 휴대 하우스 키핑 유전자 삑를 사용 정규화에 대한 발현 수준 (CT주기). 카피 수 결정을위한 표준으로 FNX-HCV 게놈의 카피 수를 사용합니다. </li><li> 15 초 동안 95 º C ~ 60 : qPCR에를 실행하는 HCV의 RNA 사본의 수를 결정하는 경우 다음과 같은 조건을 사용하여 &#160; 실시간 PCR 시스템을 사용하여 30 초 (40 회)에 대해 C를 º. </li><li> 게놈의 복제 결과를도 3a 및도 3b를 참조하십시오. </li></ol> 6. 웨스턴 블로 팅 분석 HCV 단백질 발현 (그림 3C)를 검출 <ol><li> 세포 용 해물의 FR을 사용하여톰 바이러스 성 RNA는 단백질 웨스턴 블롯 분석을위한 96 시간 포스트 형질에 형질 전환. </li><li> SDS-PAGE 및 폴리 비닐 리덴 디 플루오 라이드 (PVDF) 멤브레인으로 이동을 사용하여 세포 용 해물을 해결. </li><li> 5 % 탈지 분유, 인산염 완충 식염수 (PBS)에서 0.2 % 트윈 20을 함유하는 차단 용액을 사용하여 멤브레인을 차단. </li><li> 기본 마우스 단일 클론 항체 NS3와 막 (1 천에 희석) 및 베타 - 액틴 (1 5,000 희석)을 품어. </li><li> 고추 냉이 퍼 옥시 다제 (1 5,000 희석)에 접합 된 염소 항 - 마우스 IgG의 추가 및 화학 발광에 의해 감지. </li></ol> 7. 면역 형광 분석 (IFA) <ol><li> 면역 형광 분석 -20 º C에서 30 분 동안 메탄올을 사용하여 HCV 감염과 형질 전환 세포를 고정합니다. </li><li> PBS로 3 회 세포를 세척하고 IFA 버퍼를 차단으로 차단합니다. </li><li> 토끼 폴리 클로 날 또는 마우스 단일 클론 항-DSR (친절 박사 다스 굽타, UCLA에서 제공) 항 NS5A 주로 항체를 사용하여NA 항체 1:200 (1 ㎍ / ㎖)의 희석 J2와 5 시간에 4 박에서 알을 품다 º C. </li><li> 세 번 차 항체 후 PBS로 세포를 씻으십시오. </li><li> 염소 항 - 토끼 IgG의-488 클론 차 항체 또는 1:1,000 희석 (1 ㎍ / ㎖)에 염소 항 - 마우스 IgG-594 클론 차 항체를 추가하고 실온에서 1 시간 동안 배양한다. </li><li> PBS 형광 현미경 (그림 3D)를 사용하여 훽스트 염료 및 뷰를 사용하여 3 회 얼룩 핵으로 세포를 씻으십시오. </li></ol> 8. 측정 바이러스 역가 <ol><li> 판 순진 허-7.5.1 세포 약 3 × 10 3 세포 / 잘 96 - 웰 플레이트를 사용하여. 다음 날, 성장 미디어를 사용하여 HCV의 RNA 형질 세포에서 수확 한 무 세포 배양 상층 액의 10 배 시리얼 희석을 수행하고 허-7.5.1 세포에 배수로 접종. </li><li> -20에서 30 분 동안 메탄올 (사용하여 72 시간 게시물 감염에서 세포를 수정 </suC)과 7 장에서 언급 한 바와 같이 HCV의 NS5A 단백질에 대한 immunostain º P&gt;. </li><li> NS5A 긍정적 인 초점을위한 카운트 밀리리터 당 포커스 형성 단위의 평균 수 (FFU)를 계산하는 가장 높은 희석을 사용합니다. HCV 역가 그림 4를 참조하십시오. </li></ol> 바이러스 게놈 복제 및 감염성 9. 닐라 루시퍼 라제 리포터 분석 <ol><li> 바이러스 게놈 복제, 48 - 웰 플레이트에 세중 판 HCV의 RNA-일렉트로 허-7.5.1 세포 (1 × 104 세포 / 웰) 평가하십시오. </li><li> 를 Lyse 6 시간에서 수동 용해 완충액 75 μL, 48 시간, 96 시간 후 - 형질을 가진 세포. </li><li> -80 º C에서 실내 온도와 매장에서 15 분 동안 부드럽게 플레이트 록 </li><li> , 레 닐라 루시퍼 라 아제의 효소 활성을 측정하고, 실온으로 단백질 및 파쇄물 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약을 해동. </li><li> 96 - 아, 잘 당 단백질의 용해 액의 20 μl를 추가합니다<html> L 화이트 발광 판과 루미에 접시를 놓습니다. </li><li> 레 닐라 루시퍼 라제 분석 시약 (엘렌 테라 기판 + 버퍼) 잘 당 2 초 미리 읽기 지연 시간 후 100 μl를 분배; 10 초 동안 방출되는 빛을 통합 할 수 있습니다. </li><li> 생물학적 삼중의 루시퍼 라제 값으로부터 각 샘플에 대한 평균 및 표준 편차를 계산 및 통계 분석 데이터 (도 5) 주체. </li><li> 감염을 평가하기위한 48 - 웰 플레이트에 순진 허-7.5.1 세포에 세중 표시된 시점 (48 시간 및 96 시간)에 대한 HCV의 RNA 형질 세포에서 얻은 세포가없는 상층 액 500 μl를 접종. </li><li> 물론 후 6 시간 게시물 감염 당 신선한 매체의 500 μL와 바이러스 접종을 교체합니다. </li><li> 를 Lyse 8.2-8.7 (그림 5) 단계에 설명 된대로 레 닐라 루시퍼 라제 분석에 48 시간의 후 감염과 피사체에 세포. </li></ol>itle &quot;&gt; 10. 통계 분석 <ol><li> 그래프에 오차 막대는 표준 편차 (SD)를 나타냅니다. P 값은 짝 t 테스트에 의해 산출 하였다. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

이 그림은 C 형 간염 바이러스의 복제 사이클을 분석하는 방법을 설명한다. HCV는 인간의 병원체이며, 소정의 바이오 안전성 의정서는 엄격하게 준수해야하는 것입니다. HCV 감염 세포 배양 시스템은 이전 11-13,16,17 설명되었다. 예시 된 프로토콜을 다음과 같은 때 우리가 구현하는 몇 가지 중요한 포인트가 있습니다. 첫째, 다운 스트림 연구에 그대로 전체 길이 바이러스 게놈 RNA의 좋은 품?...

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 간경변과 간암의 원인이됩니다. 그것은 350,000의 사람들이 매년 1-3 죽어과 170 만명이 전 세계적으로 영향을 미칩니다. HCV는 9.6 KB의 게놈의 크기와 양의 가닥 RNA 바이러스이다. HCV 게놈은 단백질 가수 분해 10 폴리펩티드에 다양한 세포 및 바이러스 프로테아제에 의해 절단된다 ~ 3000 개의 아미노산의 단일 폴리 단백질로 번역된다. HCV는 속 Hepacivirus에 프로토 타입 바이러스와 가족 플라 비 바이러스과 4에 속한다. 노출되면, HCV는 개인의 80 %에 만성 감염을 설정합니다. 감염이 진단은 간 저하를 방지하기 위해 치료 적 개입을 허용 할 수 있습니다 대부분 증상이 적시에 있습니다. 현재 치료는 차선이고 백신은 5,6 사용할 수 없습니다. C 형 간염의 원인은 1989 7 설명했다. HCV 복제를 공부하는 것은 C 형 간염 백신과 치료 연구를위한 중요하지만이 있었다긴 효율적인 바이러스 배양 시스템의 부족에 의해 방해. HCV의 분자 클론은 간내 접종 8시 침팬지에 감염 될 것으로 나타났다. 이어서, HCV 서브 게놈 플리은 세포 배양 시스템 9,10에서 바이러스 게놈 복제 단계를 절개 할 수있는 기술되었다. 유전자형 2A의 HCV의 발견은 JFH-1 (일본어 전격 성 간염 1) 분리, 세포 배양을 감염시킬 수는 HCV의 복제 연구를 11 ~ 13를위한 새로운 길을 열었습니다. 유전자형 2A 변형 JFH-1 간 및 내 유전자형 키메라 바이러스와 유전자형 1 HCV 기반 기반 감염성 문화 시스템뿐만 아니라 14 ~ 18 사용할 수 있습니다. 우리는 성공적으로 단백질 도메인 및 시스 - 작용하는 RNA 요소 (19, 20)의 고해상도 기능 프로파일의지도를 구하는 것이 JFH-1 균주 및 HCV의 intragenotype의 2A 키메라 바이러스를 사용했습니다. 이 기사에 따르면, 우리가 할 수 일상적으로 사용하는 효과적인 문화 시스템을 설명HCV의 복제주기 및 호스트 병원체 상호 작용의 다양한 단계를 공부. 우리는 바이러스 게놈 복제 및 intragenotype 2a 개의 HCV와 레 닐라 루시퍼 기반 기자 HCV의 새로이 감염을 평가 한 바이러스 분석을 제시한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1121">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:267px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM)</td>
			<td style="width:267px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10-017-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Non essential amino acid</td>
			<td style="width:267px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MT25025CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">HEPES</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">15630080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Glutamax</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">35050061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Opti-MEM Reduced Serum Medium,no Phenol Red</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11058-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Huh-7.5.1</td>
			<td style="width:267px;">The Scripps Research Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The cell line was kindly provided by Dr. Francis Chisari to Dr. Arumugaswami under executed MTA between The Scripps Research Institute and Cedars-Sinai Medical Center</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:569px;">Plasmids (pFNX-HCV, pFNX-HCV Pol null, pFNX-Rluc, and pFNX-Rluc Pol null)&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Cedars-Sinai Medical Center</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>The HCV plasmids were synthesized by Dr. Arumugaswami using overlapping oligo-nucleotides.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">XbaI</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">R0145S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Mung Bean Nuclease</td>
			<td>New England Biolabs Inc.</td>
			<td style="width:119px;">M0250S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">T7 RiboMAX Express Large Scale RNA Production System</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">P1320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Rneasy Mini Kit</td>
			<td style="width:267px;">Qiagen</td>
			<td style="width:119px;">74104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Nanodrop 2000</td>
			<td style="width:267px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">Nanodrop 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Electroporation Cuvette (4 mm)</td>
			<td style="width:267px;">Bioexpress</td>
			<td>E-5010-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Gene Pulser Xcell Total System</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">165-2660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mouse monoclonal anti-dsRNA antibody J2&#160;</td>
			<td>English &#38; Scientific Consulting Kft.</td>
			<td style="width:119px;">10010200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 594</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td>A11020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PVDF membrane package</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">162-0263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Blotting Grade Blocker Non Fat Dry Milk</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-6404XTU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">Tween-20</td>
			<td style="width:267px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:119px;">170-6531XTU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [8 G-2]</td>
			<td style="width:267px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab65407</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-Hepatitis C Virus NS3 antibody [H23]</td>
			<td style="width:267px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab13830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Goat anti-mouse IgG conjugated with horseradish peroxidase (HRP)&#160;</td>
			<td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td>
			<td style="width:119px;">115-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Amersham ECL Prime Western Blotting Detection Reagents&#160;</td>
			<td style="width:267px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">RPN2236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SUPERSCRIPT III RT&#160;</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">18080085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">SYBR QPCR SUPERMIX W/ROX</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11744500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ViiA 7 real-time PCR system</td>
			<td style="width:267px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">NA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Renilla Luciferase Assay System kit</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E2810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">RNase-Free DNase</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">M6101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:569px;">GloMax-Multi Detection System (Luminometer)</td>
			<td style="width:267px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a protocol for analyzing hepatitis c virus replication

C 형 간염 바이러스 (HCV)는 세계 인구의 3 %에 영향을 미치는 만성 간염, 간경변 및 간암 등의 심각한 간 질환의 원인이됩니다. HCV는 가족 플라 비 바이러스과에 속하는 포락선 RNA 바이러스이다. 현재의 치료는 완전히 효과가없고, 부작용이 발생합니다. 가능한 HCV 백신이 없습니다. 따라서, 지속적인 노력은 백신과 더 나은 치료를 개발하기 위해 필요합니다. HCV 세포 배양 시스템은 바이러스 진입, 게놈 복제, 포장, 및 송신을 포함하여 HCV 성장의 각종 단계 연구에 중요하다. 제시된 현재 프로 시저에서, 우리는 야생형 intragenotype의 2A 키메라 바이러스, FNX-HCV, 그리고 바이러스 복제를 연구하는 레 닐라 루시퍼 라제 리포터 유전자를 운반하는 재조합 FNX-Rluc 바이러스를 사용했습니다. 인간 간암 세포주 (허-7을 기준으로)의 시험 관내 형질 도입에 사용 된은 HCV 게놈 RNA를 전사를. 무 세포 배양 상층 액, 단백질 해물과 t전 체 RNA는 HCV의 성장을 평가하는 사후 형질 포인트는 다양한 시간에 수확. HCV 게놈의 복제 상태 정량적 RT-PCR 및 HCV의 존재를 시각화하는 이중 가닥 RNA에 의해 평가 하였다. HCV 단백질 발현은 HCV NS3 및 NS5A 단백질에 대한 특이 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 및 면역 형광 분석에 의해 확인되었다. 배양 상청 및 바이러스 역가에 감염성 입자를 방출 HCV의 RNA 형질 감염 세포를 측정 하였다. 루시페라아제 리포터 분석법은 HCV의 복제 수준 및 감염성을 평가하기 위해 사용되었다. 결론적으로, 우리는 HCV의 복제주기의 다른 단계를 특성화하기위한 다양한 바이러스 적 분석을 제시한다.

C 형 간염 바이러스는 RNA 바이러스이다. 따라서, 유전자 조작 목적, HCV 게놈 cDNA를 박테리아 플라스미드 벡터에 클로닝되었다. T7 RNA 폴리머 라제 프로모터 서열은 HCV 게놈의 5 &#39;말단 바로 전에 도입되었다. HCV 분석 워크 플로우에 대한 일반적인 개요를 그림 1에 제시되어있다. 정확한 3 &#39;끝 HCV 게놈 RNA를 생성하려면, 플라스미드를 포함하는 HCV 게놈은 XBA I 제한 효소 생성 된 ...

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A Protocol for Analyzing Hepatitis C Virus Replication

Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle.

C 형 간염 바이러스의 복제를 분석하기위한 프로토콜

Hepatitis C Virus (HCV) affects 3% of the world&#8217;s population and causes serious liver ailments including&#160;chronic hepatitis, cirrhosis, and ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

23.9K 조회수.  Cedars-Sinai Medical Center. Hepatitis C Virus (HCV) is a major human pathogen that causes liver disorders, including cirrhosis and cancer. An HCV infectious cell culture system is essential for understanding the molecular mechanism of HCV replication and developing new therapeutic approaches. Here we describe a protocol to investigate various stages of the HCV replication cycle. 