المؤلفون ممتنون لجيريمي CM تيو وS. ريان أوليفر لمساهمتهم ويولانتا Kilarska للمساعدة في معالجة الصور. نشكر مرفق الأساسية BIOP في EPFL للدعم مع اثنين من الفوتون المجهري وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من المفوضية الأوروبية للبحوث (DC-الليمفاوية، 206٬653-2)، ومشروع الإطار الأوروبي 7 (AngioScaff)، ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية (31-135756)، والمعاهد الوطنية الأميركية للصحة (NIH) / المعاهد الوطنية للصحة القلب والرئة والدم المعهد (NHLBI) (RO1 HL096539). بالإضافة إلى ذلك، الأموال من جائزة روبرت وينر (سرطان السويسري الممتاز) سمح للشراء على stereomicroscope ايكا المستخدمة في هذه الدراسة. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

وكانت كافة الإجراءات التي أجريت على الحيوانات وفقا صارمة مع قانون حماية الحيوان السويسرية، المرسوم على حماية الحيوانات والمرسوم على التجارب على الحيوانات. نحن نؤكد أن لدينا اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC)، واسمه دي جنة مراقبة DE L&#39;ETAT دي فود (عدد تصريح: 2687)، وافق على وجه التحديد هذه الدراسة. 1. التلقيح ورم من الأذن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثقافة B16-F10-GFP خلايا سرطان الجلد في طبق بتري 10 سم باستخدام DMEM + 10٪ FBS وسائل الاعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الخلايا هي 80-90٪ متموجة، وغسلها مع برنامج تلفزيوني وفصل لهم من قبل trypsinization. تدور باستمرار خلايا في 1،500 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية، resuspend الكرية في 1 مل من محلول رينغر وتحويلها في أنبوب 1.5 مل إيبندورف. تدور مرة أخرى وإزالة كافة طاف باستثناء طبقة رقيقة من المتوسط ​​يبقى فقط فوق بيليه. resuspend الخلايا في نهاية المطاف مع الطين الخلية سميكة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع خليط من كيتأمين / dorbene [medetomidine] (75mg/kg-1mg/kg) وتأكيد أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميه لطيف. زيادة تركيز isoflurane وفي الخطوات من 0.1٪ في حالة الحركات ويلاحظ (على سبيل المثال انسحاب مخلب). الحفاظ على الماوس على الثرمستور تسيطر المستقيم وسادة التدفئة (37 درجة مئوية) خلال الإجراء بأكمله وحماية العينين مع مرهم للعين المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير حقنة هاميلتون (33 G الإبرة، وحجم 10 مل حقنة). إزالة الغطاء طرف مع الإبرة وتحميل 20 ميكرولتر من الطين الخلية على الجزء العلوي من غرفة غيض. سحب المكبس حتى يتم تحميل 5 مل الطين داخل المحقنة. إزالة الطين الزائد من طرف الغرفة وأغلق الغطاء طرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام شريط لاصق، وإصلاح الحافة القريبة من الأذن على غيض من السبابة. في زاوية 45 درجة، تضاف ببطء إبر حقنة هاميلتون بين الأدمة الظهرية والغضروف. مرة واحدة في الداخل، اختراق الداني القاصي الأذن إلى حوالي 2-3 ملم. <bص /&gt; ملاحظة: يجب أن يتم إجراء حقن الخلايا بواسطة فني المدربين ومصدقة. بالإضافة يجب تنفيذ هذه العملية ببطء وبالتسلسل: أولا ينبغي أن توضع الإبرة أفقيا على الجلد والأذن إدراج ببطء في الأدمة الأذن. مرة واحدة فقط ومن ثم نهاية الإبرة في الجلد، وينبغي الضغط على المكبس. سوف الملحة للبدء الغطاس خلايا التلقيح في الجلد. في حال من غير المحتمل الإبرة يمر طبقتين من الأدمة الأذن، وطبقة من الغضروف ويدخل الجلد من شخص يباشر التجربة، ينبغي النظر إلى الآلام التي لحقت الاصبع experimentator باعتبارها علامة مقلقة وتسبب التراجع الفوري من الإبرة من الجلد experimentator. في هذه الحالة الغطاس لا ينبغي الضغط ويجب تعقيم الجلد مع الكحول. بدلا من ذلك، كائن غير متحرك بدلا من إصبع يمكن استخدامها لتحقيق الاستقرار في الأذن. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضخ 3 ميكرولتر الخلية الطين وسحب الإبرة ببطء من الأذن.دعونا الخلايا السرطانية تشكيل الأورام الصلبة خلال 7-9 أيام واتبع نمو الورم باستخدام stereomicroscope مضان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدلا من ذلك، اتبع الخطوات في وقت مبكر من ورم الخلية التفاعل مع مصفوفة الأنسجة، وتطبيق 50 ميكرولتر من 100،000 الخلايا السرطانية معلقة في حل رينغر على الأدمة الأذن المكشوفة والملون (بعد الخطوة 3.3). </li></ol> 2. جراحة الأذن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل ثلاثة أيام من التجربة، ويحلق رأسه الماوس، يزيل الشعر الشعر حول الرأس والأذن (10-15 ثانية) ويشطف بالماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفأر مع خليط من الأكسجين وترطيب isoflurane و(3-4٪ الاستقراء والصيانة 1-2٪) وتأكيد أن هذا الحيوان هو تخدير بما فيه الكفاية عن طريق إجراء قرصة أخمص قدميه لطيف. زيادة تركيز isoflurane وفي الخطوات من 0.1٪ في حالة الحركات ويلاحظ (على سبيل المثال انسحاب مخلب). الحفاظ على الماوس على الثرمستور تسيطر المستقيم وسادة التدفئة (37 درجة مئوية) خلال الإجراء بأكمله وحماية العينين مع ومرهم للعين المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء منصة مصنوعة من 8 صقها الشرائح الزجاجية الأنسجة. بدوره الماوس على ظهرها بلطف ووضع الأذن الورم الحاملة على كومة من الشرائح الزجاجية. استخدام خطوط صغيرة من شريط لاصق ليحملق الأمامي والخلفي حواف الأذن إلى المكدس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الجلد البطني من الأذن على طول الوترة من الصيوان الماوس باستخدام مشرط. مع مساعدة من ملاقط منحنية، تقشر بلطف الأدمة بطني والغضروف من الأدمة الظهرية حيث تم تلقيح الورم. سحب قبالة الجلد البطني والغضاريف مع ملقط المنحني، وفضح الأدمة الظهرية. ملاحظة: إذا كان يتم قطع الأوعية الرئيسية في الأذن أو الدورة الدموية لا يرجع إلى التدفق الطبيعي في غضون 15 دقيقة، والأذن لا يمكن استخدامها للتصوير. دائما الجلد الرطب الأذن فتح باستخدام العازلة رينغر وحماية الرطوبة باستخدام ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة وجود نزيف مستمر الأوعية شكل الورم، ووقف النزيف عن طريق إضافة 100 ميكرولترالثرومبين (5 U / مل) في المخزن رينغر (102 ملي مول كلوريد الصوديوم، 5 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 28 ملي اكتات الصوديوم) على الجزء العلوي من الأذن لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأذن مرتين مع حوالي 5 مل من العازلة رينغر وإزالة السائل اضافية مع مناديل معقمة. الشروع فورا في الخطوة التالية (لا تدع الأذن المفتوحة الجافة في أي لحظة!) </li></ol> 3. المناعي تلطيخ العازلة استخدام رينغر تستكمل مع مصل الإنسان (1:10)، والماوس بولكلونل الأجسام المضادة الثانوية لمفتش الإنسان (1:50)، و 125 وحدة دولية / مل (2.5 ملغ / مل) أبروتينين (عرقلة العازلة) لجميع الخطوات تلطيخ. أبروتينين يمنع بلازمين تعزيز التخثر للحد من النزيف الأولية التي قد تحدث بعد الجراحة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طي جزء من الأذن مع الأدمة مفتوحة في محارة البارزة وتجفيف الأذن الأدمة فتحها الخارجي مع مناديل معقمة. شل الأذن على كومة من شريحة زجاجية عن طريق تطبيق 0.5 ميكرولتر من الغراء الجراحية لالأمامي والخلفي dorsaحواف لتر. ثم، تتسطح بلطف الأدمة الأذن الظهرية على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الأجسام المضادة الأولية استهداف جزيئات المصفوفة خارج الخلية بتركيز 10 ميكروغرام / مل في الحجم الكلي لل100 ميكرولتر عرقلة العازلة إلى الأذن عرضة للخطر. تغطية الأذن مع انزلاق الغطاء لمنع الحل تلطيخ لتجف على حواف الأذن. احتضان لمدة 15 دقيقة. غسل الأذن مرتين مع حوالي 5 مل من العازلة رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق الأجسام المضادة الثانوية المناسبة أو تقارن streptavidin (fluorophores مع طول موجة الإثارة العالية مثل 594 نانومتر أو 647 نانومتر مواتية لintravital التصوير) بتركيز 10 ميكروغرام / مل في الحجم الكلي لل100 ميكرولتر عرقلة العازلة إلى الأذن عرضة للخطر. تغطية الأذن مع انزلاق الغطاء واحتضان لمدة 15 دقيقة. غسل الأذن مرتين مع حوالي 5 مل من العازلة رينغر. </li></ol> 4. تفاعل Splenocytes المنقولة الدم المنشط مع خلايا ورم في الموقع <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام inoculatioن من GFP-B16-F10 سرطان الجلد على الجلد الخلفي من الماوس مسانج، الموت ببطء الحيوان وجمع الطحال. عزل splenocytes مع اضطراب الميكانيكية الطحال من خلال مصفاة الخلية 70 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> splenocytes التسمية لمدة 8 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الأحمر CMTPX السيتوبلازم الخلية وصمة عار (1 ميكرومتر في برنامج تلفزيوني)، وغسل 4 مرات في 15 مل في 4 درجات مئوية وحقن فورا مع 200 ميكرولتر مصل المتوسطة الحرة في الوريد ذيل الفأر الذي كانت آذان تلقيح مع B16-F10-GFP في وقت سابق 7 أيام. </li></ol> 5. intravital التصوير عن طريق استخدام Stereomicroscope <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير على المدى القصير (حتى 2 ساعة)، إضافة الطازجة عقيمة العازلة أسكوربات-رينغر تحتوي على 140 ملي أسكوربات الصوديوم، و 10 ملي HEPES، 4 ملي بوكل و 5 مم CaCl 2، في الرقم الهيدروجيني من 7.5 (النهائية العازلة أسكوربات-رينغر الأسمولية 320 الميلي أسمول) على الجزء العلوي من الأذن يجمد. تغطية الأذن مع ساترة والبدء في التصوير باستخدام stereomicroscope مضان مع عدسة 2X. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتصوير على المدى الطويل(أكثر من 2 ساعة)، ووضع مخرج إبرة (متصلة إلى خزان يحتوي عازلة أسكوربات-رينغر) تحت ساترة، حوالي 0.5 سم بعيدا عن الأذن. استخدام مضخة تحوي بسرعة 1 ميكرولتر / دقيقة لتقديم باستمرار عازلة أسكوربات-رينغر إلى غرفة تحت ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير عدسة 1X (العمل عن بعد 6 سم) لعدسة 2X (العمل عن بعد 2 سم). فتح برنامج اقتناء وتكوين إعدادات stereomicroscope الفلورسنت. في اختيار إعدادات الكاميرا 12 بت عمق اللون والصورة ضبط مجموعة من القيم كاميرا رمادي النطاق من 0٪ (الحد الأدنى) إلى 5.1٪ (كحد أقصى) وتعيين تصحيح غاما إلى 2. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين مكاسب اقتناء إلى 1 (الحد الأدنى)، وكثافة مضان إلى 1،000 (كحد أقصى)، التكبير تعيين إلى 280X-320X وضبط الوقت وتجنب التعرض الزائد أو الناقص للتعرض (يجب أن يكون وقت التعرض أقل من 1 ثانية). اعتمادا على عدد من الحقول التصوير (عادة 10 إلى 20)، الفاصل الزمني للدورة اكتساب يجب تعيين تكونتوين 1-2 دقيقة. قد يسبب تقصير أضعاف تبيض والضيائية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار العديد من الحقول التي تحتوي على الخلايا السرطانية فضلا عن بروتين ECM الملون (كما هو الحال في الشكل 3). باستخدام مرحلة الآلية، الحصول على صور من القنوات الفلورسنت المناسبة (مثل GFP وfluorophore 647 في الشكل 3) على مر الزمن (مثلا كل 2 دقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجربة، الموت ببطء الماوس وفقا لمبادئ توجيهية الحيوان المؤسسية. في هذه الحالة، في نهاية التجربة، الموت ببطء الماوس تخدير قبل خلع عنق الرحم تليها استنزاف (نضح داخل القلب). </li></ol> 6. intravital التصوير عن طريق استخدام مجهر Multiphoton <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الشحوم السيليكون، وبناء جدار دائري من حوالي 2 سم وقطرها 2-3 ملم ارتفاع حول الأذن، بدءا من قاعدة الأذن. تأكد من عدم وجود تسرب نقطة. ملء الدائرة مع العازلة أسكوربات-رينغر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الماوسعلى الساحة وتوصيل سادة التدفئة (37 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البرمجيات مفتوحة الاستحواذ وتكوين إعدادات المجهر multiphoton. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختيار ما يصل إلى أربعة مجالات مختلفة التي تحتوي على الخلايا السرطانية والبروتينات ECM الملون (كما هو الحال في الشكل 3). في هذا المثال، ضبط الليزر تي سافيري إلى 850 نانومتر لGFP إشارة فوتون واحد اللاحقة لfluorophore 647 647 تلطيخ وتصور الكولاجين ييفي مع مجموعات المساعدة الذاتية. الحصول على صور من القنوات الفلورسنت المناسبة (مثل GFP وfluorophore 647 في الشكل 3) والجيل الثاني متناسق مع مرور الوقت، مثل كل 2 دقيقة، مع غمر المياه HCX APO 20X مع 1.00 NA عدسة و 2 ملم بعد العمل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التجربة، الموت ببطء الماوس تخدير مع خلع عنق الرحم تليها استنزاف (نضح داخل القلب). </li></ol>

<ol>
	<li>Martinez-Corral, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphatic+vessels+in+development,+wound+healing,+inflammation,+and+tumor+metastasis.">In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci. , (2012).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+neovascularization+assay+for+screening+regulators+of+angiogenesis+and+assessing+their+effects+on+pre-existing+vessels.">An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels.</a> Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Immunofluorescence+for+Visualizing+the+Microcirculatory+and+Immune+Microenvironments+in+the+Mouse+Ear+Dermis.">Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo,+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice.">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+elasticity+of+the+fibronectin+matrix+in+living+cell+culture+visualized+by+fibronectin-green+fluorescent+protein.">Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Tal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+mobilization+from+the+skin+requires+docking+to+immobilized+CCL21+on+lymphatic+endothelium+and+intralymphatic+crawling.">DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling.</a> J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).</li><li>Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , 1-14 (2005).</li><li>Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulation+of+blood+vessel+growth+during+tissue+vascularization.">Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization.</a> Nat Med. 15, 657-664 (2009).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+GFP,+CFP+and+collagen+in+tumors+in+vivo+using+multiphoton+microscopy.">Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy.</a> BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).</li><li>Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+In+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).</li><li>Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amoeboid+cancer+cell+motility+in+vivo.">Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo.</a> J. Microsc. 231, 441-445 (2008).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li><li>Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+high-speed+intravital+multiphoton+laser+scanning+microscopy+of+microvasculature,+lymphatics,+and+leukocyte-endothelial+interactions.">Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions.</a> Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).</li><li>Giampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+dendritic+cell+guidance+by+haptotactic+chemokine+gradients.">Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.</a> Science. 339, 328-332 (2013).</li><li>Midwood, K. S., Orend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tenascin-C+in+tissue+injury+and+tumorigenesis.">The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis.</a> Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 340-341 (2006).</li><li>Sund, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+derived+biomarkers+in+cancer.">Tumor stroma derived biomarkers in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Angiogenesis:+Perspectives+from+Antiangiogenic+Tumor+Therapies.">Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies.</a> Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+in+two-photon+excitation+microscopy.">Photobleaching in two-photon excitation microscopy.</a> Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).</li><li>Jakobsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+trans+potentiates+VEGFR-mediated+angiogenesis.">Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis.</a> Dev Cell. 10, 625-634 (2006).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+regeneration+kinetics+of+lymphatic-specific+photodynamic+therapy+in+the+mouse+dermis.">Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis.</a> Angiogenesis. , (2013).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

أهمية نحن هنا تقديم نهج intravital المجهري الرواية التي يسمح عالية الدقة والتصور الدينامي للمكونات المختلفة المكروية الأنسجة، بما في ذلك ييفي فضلا عن البروتينات المصفوفة مثل شبكة. هذه الطريقة لها العديد من المزايا تقنيات intravital التصوير الحالية: (ط) وقد استخدم التصوير مضان حيوي داخلي في الدراسات دوران الأوعية الدقيقة، على سبيل المثال، لتعقب تسرب المذاب من الدم أو الأوعية اللمفاوية إلى، ولكن لم يتم جنبا إلى جنب مع المناعية. (ب) استخدام الفئران المعدلة وراثيا مراسل يسمح لأنواع معينة من الخلايا المراد تصويره، ولكن يتطلب توافرها (أو بذل جهد كبير لإنشاء مؤسسات جديدة) ويحد من عدد من أنواع الخلايا المتفاعلة التي يمكن دراستها. (ج) ولا يمكن تصوير المصفوفة خارج الخلية في الجسم الحي باستخدام الجيل الثاني التوافقي، ولكن هذه التقنية يمكن الكشف فقط الكولاجين الليفي، وترك عدد كبير من المكونات الهامة خارج الخليةمثل الأغشية الطابق السفلي، fibronectins، tenascins، عوامل النمو، وكيموكينات الجليكوزامينوجليكان الأنسجة بعيدا عن متناول البحوث الحالية. أسلوبنا يتغلب على هذه القيود، ويسمح تقنيات التصوير القياسية لإدراجها وكذلك جنبا إلى جنب مع أنواع أخرى immunostainings للخلية، وهياكل الأنسجة، والودائع الهيبارين كبريتات ملزمة عوامل النمو (مثل VEGF 26) وكيموكينات (5،18 CCL21 والشكل 2D )، أو البروتينات المصفوفة خارج الخلية في وقت واحد في حين تتبع الدم و / أو التدفقات اللمفاوي. القيود التصوير epifluorescence من حيوي داخلي IF يقتصر على اللوحات الجلد رقيقة، والمحرومين من اللحمة سميكة (الأنسجة الدهنية). في حين وجدنا أن الأدمة الظهرية الأذن هو الأمثل لمعرض الجراحية غير ضارة نسبيا من الجلد الأذن، epifluorescence مع حيوي داخلي IF تقنية لا يقتصر على الأدمة الأذن ويحتمل أن تطبق على سبيل المثالالجلد المكشوفة من أصابع القدم أو الجلد الخلفي من الماوس حديثي الولادة. السريع تلطيخ الضد (15 دقيقة) في المناعي IF لا يعتمد على نشر السلبي ولكن يتطلب التصريف اللمفاوي وظيفية وتدفق السائل الخلالي، وبالتالي لا يمكن ملاحظتها تلطيخ إذا المغطي الأوعية اللمفاوية 27. وتمشيا مع ذلك، الأوعية اللمفاوية وصمة عار أقوى الأوعية الدموية الدم ثم راشح (السفن بجروح، الشرايين) 5. الفصل بين ظهري وبطني اللوحات الجلد الأذن هو إجراء العمليات الجراحية خفيف ولكنه يسبب إصابة بعض الشعيرات الدموية وموت الخلايا إلى خلايا الأنسجة المختلفة. قد تكون هذه مشكلة عندما يحتاج أحد للتحقيق في الأنسجة سليمة تماما، على سبيل المثال النظر في تأثير خفيف من المخدرات على بقاء الخلية. أيضا تطبيق مضادات الأكسدة التي تعمل على حماية البشرة من الضيائية وphotobleaching من يستبعد استخدام تقنية المناعي حيوي داخلي لدراسة مثل الاكسدة الأنسجة أو أكسيد النيتريك بيولوجذ. أخيرا، المسببة للعمى الضامة الأنسجة المقيمين مع المركبات المناعية يمكن تنشيط هذه الخلايا والتأثير على سبيل المثال دراسة الاستجابة المناعية الأنسجة وتنشيط الخلايا الجذعية. التعديلات واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل دراسة الاكسدة الأنسجة أو أكسيد النيتريك البيولوجيا، أسكوربات لابد من استبدالها مع وسائل الإعلام متوافقة الأنسجة الأخرى التي لا تتعارض مع الانتاج التجريبي. وبالمثل، ومنع مستقبلات القطعة Fc على خلايا المناعة عن طريق الجلد ينبغي تجنبها إذا كان الهدف من هذه الدراسة هو وظيفة وتفعيل الاستجابة المناعية الأنسجة وتنشيط الخلايا الجذعية والهجرة. ويمكن أن يتم هذا مع استخدام الأجسام المضادة الثانوية مع نادي جزء المشقوق (F (أ ب) 2 شظايا الأجسام المضادة) أو استخدام الأجسام المضادة والبيروكسيديز streptavidin الفلورسنت كما كشف الكواشف. التطبيقات المستقبلية نقدم داخل الرواية وفريدة من نوعهاIF تقنية الحيوية لمكونات الصورة غير ييفي من المصفوفة خارج الخلية في أورام الجلد زرع بالاشتراك مع مجموعات المساعدة الذاتية ييفي الكشف عن والكولاجين نضجت باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. واحدة من مزايا استخدام متعدد الفوتون (أو متحد البؤر) المجهر على التصوير epifluorescence هو التراص ض إمكانية ونتيجة المكانية شارك في توطين الأحداث التي تحدث داخل المصفوفة خارج الخلية، مثل دخول الوعاء الورم اللمفاوي أو في الأوعية الدموية، والتي في حالة معيار المجهري epifluorescence يمكن الاستدلال على ذلك من تغيرات شكلية فقط من الخلية الغازية. هذه التقنية لديها امكانات أوسع بكثير. على سبيل المثال، استخدمنا حيوي داخلي IF للتحقيق في آلية انسداد اللمفاوية التي كتبها اللمفاوي محددة العلاج الضوئي 27. وتشمل التطبيقات المحتملة إضافية من هذه الطريقة ولكن لا تقتصر على التحقيق في الحصانة الجلد أثناء الالتهاب، آلية الرفض زرع أو أساليب الدم واللمف<html> اتيك نمو الأوعية أثناء تكون الأورام. الخطوات الحاسمة في الإجراء الخطوة الأكثر أهمية التي لها آثار حاسمة في الحفاظ على بيئة الأنسجة الفسيولوجية هو فصل الجراحي للجلد بطني والغضاريف من الأدمة الظهرية. وقطع أو انسدادات الشريان الرئيسي أو الوريد يؤدي إلى النزيف ونقص الأكسجة الأنسجة المحلية، والتي سوف تؤثر على استجابة الخلايا للعلاجات وحركة الخلية 8. شل حركة الأذن مع الغراء الجراحية يجب أن يتم بحذر كما إراقة الغراء على فضح الأنسجة سوف يتسبب في ضرر دائم للأنسجة مع انسداد الأوعية الدموية. يجب التحكم في درجة الحرارة من الفأرة والاحتفاظ بها في 37 درجة مئوية. بالإضافة إلى ذلك، يحتاج الأكسجين مرطب لاستخدامها في التخدير isoflurane و، بحيث العينين والرئتين البقاء مرطب بشكل صحيح أثناء التجربة. أيضا، يجب أن يكون مستعدا أسكوربات الصوديوم طازجة وفحص درجة الحموضة لها قبل الاستخدام. ntent &quot;&gt; وخلاصة القول، وهذا حيوي داخلي المناعي الجسور في الوقت الحقيقي، والقياسات المحلية من وظيفة فسيولوجية مع التصوير الجزيئي من الأحداث الخلوية المعقدة في الجلد الماوس. وعلاوة على ذلك، وهذه الطريقة لديها امكانات كبيرة لأنه يمكن تطبيقها بسهولة على سبيل المثال ما بعد الدراسة التنموية آليات الدموية واللمفاوية-الأوعية الدموية أو لتصور المراحل المبكرة من العدوى الجلدية من قبل مختلف العوامل الممرضة. مع مرونة وإمكاناته الإنتاجية العالية، ويمكن هذا الأسلوب حيوي داخلي تساهم بشكل كبير في حقول متعددة من علم الأحياء.

وقد intravital التصوير من عمليات إعادة التهابات، والنقيلي ومصفوفة مجالا هاما للبحث والتي حفزت إنشاء العديد من نماذج الماوس المعدلة وراثيا التي تعبر عن مراسل البروتينات الفلورية 1،2. بسبب إشارات الفلورسنت خارج التركيز، والتي تقلل من جودة الصورة وحدود الضوء من خلال اختراق الأنسجة، والتصوير الأنسجة سميكة هو الوحيد الممكن مع متحد البؤر المسح الضوئي أو متعدد الفوتون المجهري 3. باستخدام أسرع وأقل تكلفة وتعقيدا المجهري epifluorescence هو الوحيد الممكن مع ما يقرب من أنسجة ثنائية الأبعاد مثل الدجاج المشيمية السقاء الغشاء 4 أو الماوس الأدمة الأذن 5. معظم أنظمة التصوير الاستفادة من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن مختلف البروتينات الفلورية في نوع محدد خلية الموضة. على الرغم من هذه البروتينات تقدم الضيائية ضعيفة، فإنها تحفز الاستجابة المناعية 6. وعلاوة على ذلك، فإنه من الصعب للتبديل بين أنواع فرعية معينة من الخلايا أو بمناسبةالقاعدية الأشعة تحت الحمراء أو الدول تفعيلها على هذا النحو التغيير يتطلب إعداد نموذج وراثية جديدة. بالإضافة إلى ذلك، كما الفلورسنت التعبير البروتين يقتصر عموما على حجرة داخل الخلايا، فإنه عادة ما يكون غير ممكن لصورة هياكل خارج الخلية مثل البروتينات الغشاء القاعدي أو الودائع chemokine الأنسجة 7. بدلا من ذلك، وضع العلامات غير المباشرة مع الأجسام المضادة ضد المستضدات خارج الخلية يوفر مرونة لتقريبا أي خلية من نوع مصفوفة أو عنصر محدد 8،9. ومع ذلك، ويرتبط العيب الرئيسي لهذا النهج وضع العلامات مع المناعية بوساطة مستضد الضد المركبات المناعية التي يمكن أن تؤدي تكملة سمية الخلايا التي تعتمد على نظام والبلعمة من الخلايا والهياكل خارج الخلية 10. المصفوفة خارج الخلية من المكروية الورم، ولكن أيضا من الأنسجة الطبيعية أثناء الالتهاب أو التئام الجروح، ويخضع لإعادة عرض كبيرة. اللحمية تشنج المكروية الورم يمكن الترويجيالشركة المصرية للاتصالات نمو الورم والغزو بسبب آليات الإشارات التي يسببها التوتر وإعادة عرض القضية من الدم والأوعية اللمفاوية 11. ومع ذلك، والتصوير الحية من البروتينات المصفوفة يقتصر على الكولاجين لييفي التي يمكن الكشف عنها بواسطة الجيل الثاني التوافقي باستخدام متعدد الفوتون المجهري. مؤخرا قمنا بنشر طريقة intravital التصوير الرواية التي تقلل من خطر الإصابة الصور والمناعة سامة تلف الخلايا والهياكل تصوير الأنسجة 5. بالمقارنة مع تقنيات التصوير أنشئت فيها دورة واحدة من التصور حيوي داخلي المستمر هو في مجموعة من 30 دقيقة إلى 2 ساعة 12-17، لدينا المناعي حيوي داخلي (IF) تقنية سمحت 12 ساعة (على المدى الطويل 8) التصوير. من المهم أن نلاحظ أن وقت التصوير يقتصر على 12 ساعة بسبب القيود المحددة في البروتوكول الحيوانية لدينا ولكن لا توجد مؤشرات-مكافحة التقنية أنه لا يمكن رفعه إذا المعلمات الصحية الحرجة للحيوان، مثل ضغط الدم والقلبيتم التحكم في معدل 8. بالإضافة إلى ذلك، باستخدام stereomicroscope مضان الآلي تمكنا من جمع الصور من حقول متعددة خلال تجربة واحدة، ولاحظ العمليات المناعية وإعادة عرض النادرة التي وقعت في سياق الفسيولوجية للبشرة معتمدة من قبل الدم وظيفية والأوعية اللمفاوية. لأن عدسة stereomicroscopic لديه كبيرة نسبيا، 2 سم، بعد العمل وعلى النقيض من اثنين من الفوتون المجهري البصريات لا يتطلب تبخير الماء الغمر، تم إجراء التصوير على المدى الطويل إلا تحت مضان stereomicroscope. IF حيوي داخلي يسمح بوضع العلامات المناعة، والكشف عن أي عنصر المصفوفة خارج الخلية من الجلد الطبيعي. ويستند تصميم هذه التقنية على مفهوم مبتكر من استخدام المناعية للخلايا الحية وعناصر مصفوفة أنسجة الأدمة على الماوس يتعرض جراحيا دون التسبب في آثار ضارة مناعية 5. العملية الجراحية نفسها آمنة للالأدمة<html> الأوعية الدموية لأنها تعتمد فقط على فصل اثنين من طبقات الجلد في الأذن التي معصب بشكل مستقل، تتغذى ذاتيا عن طريق الدم واستنزفت من قبل التداولات اللمفاوي منفصلة. يسمح لنا الإعداد التجريبية تصوير مجموعة من الأحداث الهامة المرضية الفسيولوجية على مدى 12 ساعة على الأقل، بما في ذلك الاتجار الكريات البيض بين الأوعية الدموية واللمفاوية وعمليات التئام الجروح. في المنشور الأصلي، قارنا تقنية جهدنا لدولة من بين الفن المعايير في مختلف مجالات intravital التصوير. بالتالي، لاحظنا تسرب الدم السفينة والأحداث دخول الوعاء اللمفاوي من خلال أنواع مختلفة من الكريات البيضاء، بما في ذلك التصور فريدة من دخول الخلايا المناعية بدلا من جمع المتوقع الأوعية اللمفاوية الأولية 15. أيضا، واستكمال الملاحظات الذي قامت به مجموعات أخرى 9،18، وجدنا أن في الجسم الحي CCL21 قادر على تشكيل قوي والودائع متقطع على جمع ولكن من النادر فقط على الأوعية اللمفاوية الأولية. معشوقة = &quot;jove_content&quot;&gt; هنا نحن تصف حيوي داخلي تعديل IF التقنية التي يمكن دمجها مع اثنين من الفوتون المجهري للكشف عن شبكة من الكولاجين لييفي باستخدام الجيل الثاني التوافقي (SHG). وتبين لنا أن هذه الطريقة يمكن أن تستخدم أيضا لغزو الخلايا السرطانية التصوير في سياق المكروية الورم الديناميكية، والذي يتضمن جزيئات المصفوفة مثل tenascin C، التي هي غير مستكشفة إلى حد كبير من خلال تقنيات التصوير الحالية 19. وجدنا أن المصفوفة ييفي من الورم، والكشف مع الجيل الثاني التوافقي، وتحتل مواقع مختلفة من المكروية الورم من المصفوفة المودعة حديثا يتألف من tenascin C. علاوة على ذلك، نحن تصف أمثلة على السفينة إعادة الناجمة عن الانكماش مصفوفة المحلية، منذ فترة طويلة المدى (12 ساعة) التصوير من التفاعلات تي خلية مع الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية الهجرة على طول الكولاجين الرابع من الغشاء القاعدي. ولا يمكن تصوير هذه الأحداث في وقت واحد في حين تم تسجيل المعلمات الفسيولوجية المحلية مثل المؤسسة العامة الأوعية الدمويةrmeability والتصريف اللمفاوي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

إضافة إلى كونه سقالة البدنية للحفاظ على مورفولوجيا الأنسجة، المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتشارك بنشاط في تنظيم الخلايا والأنسجة وظيفة خلال التنمية والتوازن الجهاز. وهو يفعل ذلك من خلال العمل عن طريق الكيمياء الحيوية، والنشاط الحيوي، ومسارات الإشارات الفيزيائية الحيوية، وذلك من خلال الإفراج عن شظايا النشطة بيولوجيا البروتين ECM، وتنظيم التوتر الأنسجة، وتوفير مسارات للهجرة الخلية. المصفوفة خارج الخلية من المكروية الورم يخضع لإعادة عرض كبيرة، والتي تتميز تدهور وترسب وتنظيم ييفي وغير ييفي البروتينات المصفوفة. اللحمية تشنج المكروية الورم يمكن أن تعزز نمو الورم والغزو، وتسبب إعادة تشكيل الأوعية الدموية واللمفاوية. تصوير حي من البروتينات المصفوفة، ولكن، لهذه النقطة يقتصر على الكولاجين لييفي التي يمكن الكشف عنها بواسطة الجيل الثاني التوافقي باستخدام متعدد الفوتون المجهري، وترك الغالبية العظمى من مكونات المصفوفة لغير مرئية argely. نحن هنا تصف إجراءات الورم التلقيح في الظهرية رقيقة الجلد الأذن، immunolabeling من البروتينات المصفوفة خارج الخلية وintravital التصوير من الأنسجة التي تتعرض لها من الفئران الحية باستخدام epifluorescence واثنين من الفوتون المجهري. يسمح لنا طريقة intravital التصوير للكشف المباشر على حد سواء ييفي وغير ييفي البروتينات المصفوفة في سياق الورم الجلدي المتنامية. وتبين لنا أمثلة على السفينة إعادة الناجمة عن الانكماش مصفوفة المحلية. وجدنا أيضا أن مصفوفة ييفي من الكشف عن الورم مع الجيل الثاني التوافقي يختلف مكانيا من مكونات المصفوفة المودعة حديثا مثل tenascin C. نحن أيضا أظهرت طويلة الأجل (12 ساعة) التصوير التفاعل مع الخلايا T-الخلايا السرطانية والخلايا السرطانية الهجرة على طول الكولاجين الرابع من الغشاء القاعدي. أخذت معا، وهذه الطريقة تسمح فريد للكشف في وقت واحد من الخلايا السرطانية، المكروية البدنية والأنسجة الاستجابة المناعية الذاتية مع مرور الوقت، والتي قد الأقليمIDE معلومات هامة عن الآليات الكامنة وراء تطور الورم والنجاح في نهاية المطاف أو مقاومة للعلاج.

حتى الآن، لم يتم استخدام المناعية في الأنسجة الحية عادة بسبب تشكيل المعقدات المناعية التي تؤدي إلى تلطيخ خلفية عالية والمناعية 20. وقد تم التغلب على ذلك عن طريق ما قبل حجب مستقبلات Fcγ على الأنسجة الضامة، وبالتالي &quot;المسببة للعمى&quot; هذه الخلايا المناعية لاحقة قوية غير مباشرة. كما كان وضع العلامات خارج الخلية، يمكن السيطرة الضيائية وfluorophore التبييض عن طريق الغمر من الأنسجة الطبيعية المضادة للأكسدة في مخزنة، متسق الضغط التناضحي حمض الاسكوربيك (الشكل 1A). منذ لدينا وصف الأولية من هذا الأسلوب 5، ونحن لدينا تحسين مكافحة التبييض ومكافحة الضوئية التقنية بحيث يمكن photobleaching من الآن ليس فقط أن تحول دون ولكن منعت تماما (الشكل 1B). يتم ذلك عن طريق دمج الأذن في كمية كبيرة من مضادات الأكسدة (100 ميكرولتر) داخل غرفة حيث يجمد الأذن. نلاحظ ذلك الوقت 300 ثانية التصوير المستمر يتوافق مع 10 ساعة من التصوير عندما الصور هيجمعت ل500 ميللي ثانية في كل دقيقة واحدة (إعدادات التصوير المتوسط). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" /> تم إيقاف الرقم 1. photobleaching من والضيائية عن طريق استبدال كلوريد مع أسكوربات في المخزن رينغر وتضمينها الأذن التي تتعرض لها من حجم 100 ميكرولتر من هذا الحل. (أ) كانت ملطخة الأنسجة الأولى مع الأضداد البيروكسيديز ضد الكولاجين الرابع، المكون من الغشاء القاعدي. تم الكشف عن تلطيخ وقت لاحق مع streptavidin-647 (الحمراء)، ومن ثم تصويرها باستمرار لمدة 300 ثانية في أي عازلة طبيعية رينغر (اللوحة العليا) أو أسكوربات-قارع الأجراس (اللوحة السفلى) ل. لاحظ أن 300 ثانية ثابت وقت التصوير يتوافق مع 10 ساعة من التصوير عندما يتم جمع الصور ل500 ميللي ثانية في كل دقيقة واحدة (إعدادات التصوير المعتاد). ألمع 25٪ من بيقيم الكثافة XEL خضراء اللون. (ب) الكمي لتسوس المناعي (50٪ في مقابل رينغر 0٪ في أسكوربات-رينغر). تم تطبيع القيم إلى مضان الأولي. الصور التي تم جمعها مع stereomicroscope المناعي. شريط النطاق في A، 100 ميكرون. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> التحقيق في التفاعل بين الخلايا السرطانية والأورام النقيلي سدى أمر حاسم لفهم عملية الهجرة الخلية السرطانية والحصانة الورم. وذلك لأن سدى المرتبطة الورم يؤلف ما يصل إلى 90٪ من كتلة الورم وينظم بنشاط نمو الورم وانتشار النقيلي 21. ومع ذلك، والبصيرة الآلي في كيفية هجرة محركات مصفوفة الخلايا السرطانية اللمفاوية إما نحو أو الأوعية الدموية يفتقر 22. هذا يرجع جزئيا إلى حقيقة أن حيوي داخلي ايمالشيخوخة من البروتينات المصفوفة يقتصر على التصور من ألياف الكولاجين نضجت من ييفي باستخدام الجيل الثاني التوافقي في اثنين من الفوتون المجهري 23. لذلك، نحن لدينا طريقة تكييفها لتصور المكروية الأنسجة بما في ذلك الدم والجهاز الليمفاوي السفن، pericytes والأعصاب والعضلات والخلايا الشحمية ليشمل التصور المباشر من مكونات المصفوفة خارج الخلية. ويمكن التمييز بين العديد من الهياكل القائمة على التشكل بعد المناعية لمكونات الغشاء القاعدي مثل الكولاجين الرابع أو perlecan (الشكل 2A)، ومع ذلك، وتلطيخ المباشر للعلامات محددة سطح الخلية، مثل Lyve1 (الشكل 2B وجيم) وpodoplanin (الشكل . 2C)، ويسمح مزيد من التمييز، مفاوية الشعرية الأولي (Lyve1 +) من جامعي اللمفاوي (Lyve1 -). تلطيخ لربط مصفوفة CCL21 في الجلد كشفت الودائع من هذا chemokine على الغشاء القاعدي من جامعي اللمفاوي بيئة تطوير متكاملةntified مع تلطيخ لperlecan، وكبريتات بروتيوغليكان heparan (الشكل 2D). <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" /> الرقم 2. أمثلة من تلطيخ يعيش في آذان الفأر العادي. (A) لتلطيخ perlecan، وهو مكون الغشاء القاعدي، يصور جميع الأوعية الدموية والجهاز الليمفاوي والأعصاب والألياف العضلية والخلايا الشحمية. (B) يمثل Lyve1 تلطيخ شبكة الشعيرات الدموية اللمفاوية الأولية. (C) المشارك تلطيخ لLyve1 وpodoplanin، علامة عموم اللمفاوي، يصور شبكات الأوعية اللمفاوية الأولية وجمع. الأدمة الظهرية الأذن يمكن تصويرها باستخدام المجهر epifluorescence الكلاسيكية (بدون باجتزاء البصرية) كما الأدمة الأذن لديه انخفاض عدد الخلايا الشحمية التي من شأنها أن تغطي على خلاف ذلك مجال التصوير. (D) CCL21 الفول<html> نينغ (الأخضر) على اللمفاوي الغشاء القاعدي الملون لperlecan (الحمراء). الصور التي تم جمعها مع stereomicroscope المناعي. أشرطة النطاق في A و B، 1 مم؛ في C، و 100 ميكرومتر و 50 ميكرومتر في D. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> الأهم من ذلك، البروتينات الهيكلية التي عادة لا يمكن الكشف عنها بواسطة مجموعات المساعدة الذاتية، والكلاسيكية وطريقة الكشف مصفوفة 23، يمكن تصور. على سبيل المثال، وجدنا أن tenascin C (الشكل 3A)، وهو بروتين المصفوفة التي أعرب عنها أثناء تكون الأورام، وتودع التئام الجروح والتهاب 19 في مواقع مختلفة من الورم سدى من الكولاجين لييفي (الشكل 3B). هذا التجانس قد تؤثر على مصفوفة توزيع الخلايا السرطانية والانبثاث (الشكل 3C). <html> ر &quot;FO: المحافظة على together.within صفحة =&quot; دائما &quot;&gt; <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" /> الرقم 3. الأدمة الظهرية الأذن يمكن تصوير الحية باستخدام متعدد الفوتون المجهري. حقل واحد من الورم B16-F10. وصفت الورم سدى مع tenascin C الأجسام المضادة وتم الكشف عن تلطيخ مع مكافحة الماعز 594 حمار الأجسام المضادة. المناعي من tenascin C (الأحمر) هو مبين في الشبكة ألف والكولاجين لييفي الكشف مع الجيل الثاني التوافقي (SGH) في (ب). يتم فرضه هاتين الشبكتين مع الخلايا السرطانية (السماوي) في C (المدمجة). مصفوفة الورم جديدة تميزت tenascin C لا تداخل مع الكولاجين ييفي الكشف مع مجموعات المساعدة الذاتية (الخضراء). تم الحصول على صورة مع 44، وبلغ متوسط ​​أربع مرات أقسام ض باستخدام z-1.0 ميكرون خطوة في وضع عمق ألوان 16 بت. الصور التي تم جمعها مع مجهر ثنائي الفوتون. شريط الحجم، 100 ميكرون.المرجع = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg&quot; الهدف = &quot;_blank&quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. بعد immunolabeling من مختلف مكونات المصفوفة الورم (على سبيل المثال tenascin C والكولاجين الرابع) من مصفوفة الورم نستطيع التعرف المقيدة وأحداث مفاجئة من الورم مصفوفة اتجاهي إعادة عرض (فيديو 1). القوى التي تتطور داخل الورم المكروية قد تؤدي إلى توسع أو تقلص الورم ومصفوفة في إعادة عرض نتيجة واستطالة من الأوعية الدموية السرطانية إلى حد مماثلة كما فعلنا سابقا في حالة شفاء الجروح 11،24. الفيديو 1. توسيع مصفوفة الورم المسمى مع الكولاجين الرابع (الحمراء) وtenascin C (السماوي) استطال الأوعية الدموية (السهم) وبشكل سلبي نقل من ثلاث خلايا الورم (الخضراء). انكماش المترجمة من teascin-C غنية الورم مصفوفة نقل من الأوعية الدموية (الحمراء الموجهة أفقيا متطورهه) بحوالي 100 ميكرومتر خلال 12 ساعة من التصوير. الصور التي تم جمعها مع stereomicroscope المناعي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> استخدام متعدد الفوتون المجهري مع وضع العلامات fluorophore إشكالية كما تدفق الفوتون المستخدمة في هذه التجارب سوف تبييض بسرعة الأصباغ الفلورية التي لم يتم حمايتها من الأكسدة 25. نحن هنا نظهر أننا يمكن أن تؤدي اثنين من الفوتون المجهري الوقت الفاصل بين التصوير في وقت واحد في حين immunolabeled tenascin C مصفوفة مع الحد الأدنى من photobleaching من fluorophores حتى في عالية الكثافة الفوتون اثنين من الفوتون المجهري (فيديو 2). تم تصوير الفيديو 2. photobleaching من انخفاض مستوى tenascin C المناعي (الحمراء) خلال اثنين من الفوتون المجهري. الخلايا السرطانية B16-F10-GFP (السماوي) في الأذن الظهرية مفتوحة بعد 9 أيام التلقيح. كانت محمية إشارة الفلورسنت من خلال تطبيق أسكوربات-العازلة رينغر على الأنسجة المصورة. الجيل الثاني التوافقي (الأخضر) ليست متداخلة مع المصفوفة الجديدة التي يمثلها tenascin C. 16 بت عمق اللون مع الصورة 11، وبلغ متوسط ​​أربع مرات أقسام ض باستخدام z-1.9 ميكرون خطوة تم الحصول عليها لمدة 15 دقيقة. وقد تم جمع الصور كل 1 دقيقة 5 ثوان في 6 ض الطائرات التي تم جمعها. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> نحن أيضا تصوير التفاعلات الخلايا المناعية مع خلايا الورم النقيلي. splenocytes CMTPX المسمى من الماوس الورم الحاملة extravasated من الأوعية الدموية المرتبطة الورم بعد 8 ساعات نقل الرابع، غزت مصفوفة الورم وتفاعلت بنشاط مع الخلايا السرطانية من خلال تشكيل طويلة الأمد الاتصالات الخلوية (فيديو 2). كانت Fluorophore-647 المسمى هياكل الكولاجين الرابع مقاومة للphotobleaching من خلال 12 ساعة من التصوير. الفيديو 3. تفاعل splenocytes CMTPX المسمى من الورم (B16-F10) بالقرط الفأر مع الخلايا السرطانية الفردية (GFP-B16-F10). كانت Splenocytes الرابع المنقول بعد تلطيخ الأنسجة لالكولاجين الرابع. الكولاجين IV-الخضراء (647)، splenocytes الحمراء (CMTPX)، سماوي B16-F10 (GFP). الصور التي تم جمعها مع stereomicroscope المناعي. مدة الفيديو 12 ساعة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> تم مضافين الخلايا السرطانية المعزولة حديثا على الأدمة الأذن تتعرض ملطخة مسبقا عن الكولاجين الرابع. يمكننا أن وحظ أنه بعد الانضمام إلى الأنسجة بعض مجموعات من الخلايا التي الهجرة الجماعية على طول الغشاء القاعدي من الأوعية الدموية والخلايا الشحمية. الفيديو 4. الخلايا السرطانية تهاجر على طول الأغشية الطابق السفلي. الجلد الأذن عادي الملون لالكولاجين الرابع (647، الحمراء) تم مضافين مع passaged طازجة الخلايا B16-F10-GFP وتصوير لمدة 5 ساعات. بدأت بعض الخلايا السرطانية التي انضمت إلى الأنسجة الهجرة الجماعية على طولالغشاء القاعدي من الأوعية الدموية والخلايا الشحمية. الصور التي تم جمعها مع stereomicroscope المناعي. مدة الفيديو: 5 ساعات <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة الفيديو.</a> أيضا، لأن الأدمة الأذن هي تقريبا ثنائي الأبعاد، فإننا لا يمكن جمع بسهولة كميات كبيرة من البيانات باستخدام مضان سريع stereomicroscopy، بدلا من أبطأ وأكثر تكلفة متحد البؤر المجهري أو multiphoton. ومع ذلك، فمن الممكن أيضا استخدام أي من الطرق المذكورة المجهر مع حيوي داخلي لدينا IF الاستعدادات (الشكل 3، فيديو 1).

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy at JoVE.com

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

المصفوفة خارج الخلية يخضع لإعادة عرض كبيرة أثناء التئام الجروح، والتهاب وتكون الأورام. نقدم نهجا المناعي intravital المجهري الرواية لتصور ديناميات ييفي وكذلك مكونات المصفوفة مثل شبكة مع القرار المكانية والزمانية عالية باستخدام epifluorescence أو اثنين من الفوتون المجهري.

طويلة الأجل حيوي داخلي المناعي التصوير من الأنسجة مكونات مصفوفة مع Epifluorescence والميكروسكوب ثنائي الفوتون

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

18.9K Views.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne.  المصفوفة خارج الخلية يخضع لإعادة عرض كبيرة أثناء التئام الجروح، والتهاب وتكون الأورام. نقدم نهجا المناعي intravital المجهري الرواية لتصور ديناميات ييفي وكذلك مكونات المصفوفة مثل شبكة مع القرار المكانية والزمانية عالية باستخدام epifluorescence أو اث...

Video: Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

عدم الاتصال، تسمية خالية من رصد خلايا المصفوفة خارج الخلية، وباستخدام التحليل الطيفي رامان

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

إنشاء تدرجات لاصق وقابل للذوبان للهجرة الخليوي مع التصوير مضان المجهري

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

رقاقة متعدد الجهاز - A منصة ميكروفلويديك لفترة طويلة Coculture متعدد الأنسجة

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

جهاز التقاط الصور الحية طويلة الأجل لتحسين التلاعب التجريبية من اليرقات الزرد

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

تقنية خياطة تينورهافي جديدة مع الأنسجة المهندسة الكولاجين الكسب غير المشروع لإصلاح عيوب وتر كبير

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

تصور تشكيل الالتصاق في الخلايا من خلال متقدم الغزل مجهرية Fluorescence انعكاس الداخلية القرص--المجموع

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

البنكرياس المشتقة الانسجه المستمدة مصفوفة بيونك للطباعة 3D خلايا البنكرياس لادن الانسجه يبني

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

شريحة موائع دقيقة بسيطة للنمو على المدى الطويل وتصوير Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

في الجسم الحي تصوير الأنسجة البيولوجية مع التألق المشترك ثنائي الفوتون والمجهر المجهري المبعثر رامان المحفز

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

تصوير الأنسجة متعددة الإرسال للغاية باستخدام أصباغ رامان

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...