Yazarlar görüntü işleme konusunda yardım için Jeremy CM Teo ve S. Ryan Oliver katkılarından ve Jolanta Kilarska minnettarız. Biz iki-foton mikroskobu ile destek için EPFL&#39;deki BIOP çekirdek tesis teşekkür Bu çalışma, Avrupa Araştırma Komisyonu (DC-Lenf, 206653-2), Avrupa Çerçeve Projesi 7 (AngioScaff), İsviçre Ulusal Bilim Vakfı (31-135756) ve Sağlık US National Institutes hibe tarafından desteklenmiştir (NIH) / NIH Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (NHLBI) (RO1 HL096539). Ayrıca, Robert Wenner Ödülü (İsviçre Kanser Birliği) fonları alım Bu çalışmada kullanılan Leica stereomikroskopta izin verdi. Maliyeciler, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlamak kararı, ya da yazının hazırlanmasında herhangi bir rolü vardı.

Hayvanlar üzerinde gerçekleştirilen tüm işlemler İsviçre Hayvanları Koruma Kanunu, hayvan koruma kararname ve hayvan deneyleri üzerine kararname ile tam uyum içinde idi. , Özellikle bu çalışmayı onayladı: Biz Komisyon de Surveillance de l&#39;Etat de Vaud (2687 İzin Numarası) adlı bizim Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC), onaylayın. Kulak 1.. Tümör Aşılama <ol><li> DMEM +% 10 FBS ortamı kullanılarak 10 cm Petri kabındaki kültür B16-F10-GFP melanoma hücreleri. </li><li> Hücreler% 80-90 konfluent olduğunda, PBS ile yıkayın ve tripsinizasyon onları ayırmak. , 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 1500 x g&#39;de hücreleri aşağı Spin 1 ml Ringer çözeltisi içinde tekrar süspansiyon ve pelet, 1.5 ml&#39;lik Eppendorf tüpü içine aktarın. Tekrar Spin ve sadece pelet yukarıda kalır orta ince bir katman dışında tüm süpernatant kaldırmak. Kalın bir hücre bulamaç ile sonuna kadar hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> Ket karışımı ile fare anestezisiamin / dorbene [medetomidin] (75mg/kg-1mg/kg) ve hayvan yeterince nazik bir ayak tutam yaparak anestezi onaylayın. Durumda hareketlerinde% 0.1 adımlarla izofluran konsantrasyonu artırmak (örneğin pençe çekme) gözlenir. Bütün işlem sırasında bir rektal termistör kontrollü bir ısıtma pedi (37 ° C) üzerinde fare tutmak ve uygun bir oftalmik merhem ile gözlerinizi korumak. </li><li> Hamilton şırınga (33 G iğne, 10 ml şırınga hacmi) hazırlayın. Iğne ile uç kapağını çıkarın ve ucu odasının üstüne hücre bulamaç 20 ul yükleyin. 5 ml bulamaç şırınga içinde yüklenene kadar pistonu geri çekin. Uç odasından fazla bulamacı çıkarın ve uç kapağı kapatın. </li><li> Yapışkan bant kullanılarak, bir parmağı ucunda kulak yakın kenar düzeltmek. 45 ° açı, yavaş yavaş dorsal dermis ve kıkırdak arasındaki Hamilton şırınga iğnesi takın. Bir kez içinde, yaklaşık 2-3 mm distale kulak proksimal nüfuz. <br /&gt; Not: hücre enjeksiyonu prosedürü eğitimli ve sertifikalı teknisyen tarafından yapılmalıdır. Ayrıca bu süreç yavaş ve sırayla gerçekleştirmek gerekir: İlk iğne kulak derisi yatay konulmalıdır ve kulak dermis içine yavaş takılmış. Bir kez ve ancak bundan sonra iğne ucu deride olan, piston basılmalıdır. Pistonun basılması deri hücreleri aşılamadan başlatacaktır. Kulak dermis, kıkırdak tabakası ve deneyi gerçekleştiren kişinin cilt girer iki katmanları geçen iğnenin olası durumunda, experimentator parmak verdirdiler ağrı bir alarm işareti olarak kabul edilir ve hemen geri çekilmesine neden olmalıdır experimentator deriden iğnenin. Bu durumda pistonun içinde preslenecek olmamalı ve deri alkol ile sterilize edilmelidir. Alternatif olarak, bunun yerine bir parmak cansız bir nesne kulak stabilize etmek için kullanılabilir. </li><li> 3 ul hücre bulamacı enjekte edilir ve yavaş yavaş kulaktan iğneyi geri çekin.Tümör hücreleri 7-9 gün boyunca, bir katı tümör formu ve flöresanlı bir stereomikroskop kullanılarak tümör büyümesini takip edelim. </li><li> Alternatif olarak, doku matrisi ile tümör hücresi etkileşim erken adımları (adım 3.3 sonra) maruz kalan ve lekeli kulak dermis Ringer çözeltisi içinde süspansiyon haline 100,000 tümör hücreleri 50 ul uygulanır. </li></ol> 2.. Kulak Cerrahisi <ol><li> Üç gün önce deney, fare kafasını tıraş baş ve kulak (10-15 sn) çevresindeki tüyleri tüylerini ve su ile durulayın. </li><li> Nemlendirilmiş oksijen ve izofluran (% 3-4 indüksiyon,% 1-2 bakım) bir karışımı ile fare anestezisi ve hayvan yeterince nazik bir ayak tutam yaparak anestezi onaylayın. Durumda hareketlerinde% 0.1 adımlarla izofluran konsantrasyonu artırmak (örneğin pençe çekme) gözlenir. Bütün işlem sırasında bir rektal termistör kontrollü bir ısıtma pedi (37 ° C) üzerinde fare tutmak ve bir ile gözlerinizi korumakUygun oftalmik merhem. </li><li> 8 yapıştırılmış cam histoloji slaytlar yapılmış bir platform oluşturmak. Sırtında fare açın ve yavaşça cam slaytların yığını üzerinde tümör taşıyan kulak yerleştirin. Yığına kulağın ön ve arka kenarları yapıştırmak için yapışkan bant küçük çizgili kullanın. </li><li> Bir neşter kullanılarak fare kulak kepçesi antiheliksin boyunca kulak ventral deri kesilir. Kavisli cımbız yardımı ile, yavaşça ventral dermis ve tümör aşılanmıştır dorsal dermis kıkırdak soyulabilir. Dorsal dermis açığa kavisli bir forseps ile ventral deri ve kıkırdak çekin. Not: kulağın büyük damar kesilir ya da kan dolaşımı 15 dakika içinde normal akışa döndürmez takdirde, kulak görüntüleme için kullanılamaz. Hep Ringer tampon kullanarak ıslak açılan kulak cildi korumak ve bir lamel kullanılarak nem korumak. </li><li> Durumda kalıcı kanama formu tümör damarları 100 ul ekleyerek kanamayı durdurmak, vartrombin 5 dakika boyunca kulak üstüne Ringer tampon maddesi (102 mM NaCl, 5 mM KCI, 2 mM CaCl2, 28 mM sodyum laktat) (5 U / ml). </li><li> Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez yıkanır ve kulak steril mendil ile ilave sıvı boşaltılır. Derhal (herhangi bir noktada açık kulak kuru izin vermeyin!) Bir sonraki adıma geçin. </li></ol> 3.. İmmünofloresan Boyama Kullanım Ringer tampon maddesi, insan serumu (01:10), insan IgG fare poliklonal ikincil antikor (1:50) ve 125 IU / ml (2.5 mg / ml), tüm boyama adımları için aprotinin (blokaj tamponu) ile takviye edilmiştir. Aprotinin ameliyat sonrası meydana ilk kanama sınırlamak plasmin teşvik pıhtılaşmayı engeller. <ol><li> Eminentia conchae içine açık dermis ile kulak kısmını katlayın ve steril mendil ile dış açılmamış kulak dermis kurulayın. Anterior ve posterior dorsal cerrahi yapıştırıcı 0.5 ul uygulayarak cam slayt yığını üzerinde kulak hareketsizl kenarlar. Sonra, yavaşça camın üzerine dorsal kulak dermis dümdüz. </li><li> Maruz kulağa bloke edici tampon 100 ul toplam hacim içinde 10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda, hücre dışı matris molekülleri hedef birincil antikor uygulayın. Kulak kenarları üzerinde kurumaya boyama çözeltisi önlemek için bir kayar kapak ile kulak örtün. 15 dakika boyunca inkübe edin. Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez kulak yıkayın. </li><li> Maruz kulağa bloke edici tampon 100 ul toplam hacim içinde 10 ug / ml &#39;lik bir konsantrasyonda uygun bir ikincil antikor ya da streptavidin eşleniklerini (örneğin 594 nm veya 647 nm bir dalga boyuna sahip, yüksek uyarım fluorophores intravital görüntüleme için uygun olan) uygulanır. Bir kapak kayma ile kulak örtün ve 15 dakika boyunca inkübe edin. Ringer tamponu, yaklaşık 5 ml ile iki kez kulak yıkayın. </li></ol> In situ olarak tümör hücreleri ile kan yoluyla bulaşan Aktif splenosit 4. Etkileşim <ol><li> 7 gün sonra, inoculation konjenik fare arka cilt üzerinde GFP-B16-F10 melanom, hayvan euthanize ve dalak toplamak. 70 mikron hücre süzgecinden dalak mekanik aksaklık splenositlerin izole. </li><li> Red CMTPX hücre sitoplazmaları leke (PBS içinde 1 uM) ile 37 ° C&#39;de 8 dakika boyunca Etiket splenositler, 4 ° C&#39;de, 15 ml 4 kez yıkayın ve hemen kulakları olan fare kuyruk venine 200 ul serum içermeyen ortam ile enjekte 7 gün önce, B16-F10-GFP ile aşılandı. </li></ol> Stereomikroskopta 5. Intravital Görüntüleme <ol><li> Kısa süreli görüntüleme (kadar 2 saat) için, 7.5 (askorbat-Ringer tampon final bir pH&#39;ta 140 mM sodyum askorbat, 10 mM HEPES, 4 mM KCI, 5 mM CaCl2 ihtiva eden taze hazırlanmış steril askorbat-Ringer tampon eklemek hareketsizleştirilmiş kulak üstünde ozmolaritesi 320 mOsM&#39;den). Bir lamel ile kulak örtün ve 2X lens ile bir floresan stereomikroskopta kullanarak görüntüleme başlayabilirsiniz. </li><li> Uzun vadeli görüntüleme için(En fazla 2 saat), yaklaşık 0.5 cm uzaklıkta kulaktan, lamel altında (askorbat-Ringer tampon ihtiva eden bir rezervuara birleştirilmiş) bir iğnenin çıkış yerleştirin. Sürekli lamel altında odacığına askorbat-Ringer tampon sunmak için 1 ul / dk &#39;lık bir hızda bir peristaltik pompa kullanın. </li><li> 1X lens 2X lens (çalışma mesafe 6 cm) (çalışma mesafesi 2 cm) değiştirin. Toplama yazılımı açın ve floresan stereomikroskopta ayarlarını yapılandırın. Kamera ayarları, görüntü renk derinliği olarak 12 bit seçin ve% 5.1 (maksimum)% 0 (minimum) gri-skala değerleri kamera aralığını ayarlamak ve gama düzeltmesi 2&#39;ye ayarlanır. <ol><li> Set edinimi 1 (asgari), 1.000 floresan yoğunluğu (maksimum), büyütme 280X-320X ayarlanır ve (pozlama süresi az 1 saniye olmalıdır) üzerinde veya altında kalmaktan kaçınarak pozlama süresini ayarlamak için kazanç. Görüntüleme alanlarına (20 genellikle 10), alıcı çevrimi için zaman aralığının sayısına bağlı olarak ayarlanmalıdır2 dakika için 1 arasını. Kısaltmak katı ağartma ve fototoksisite neden olabilir. </li></ol></li><li> Tümör hücrelerinin yanı sıra, (örneğin, Şekil 3 &#39;de olduğu gibi) lekeli ECM proteinlerini içeren çeşitli alanları seçin. Motorlu sahne kullanılarak, bir süre (örneğin, her 2 dakika) ile (örneğin, GFP ve Şekil 3&#39;te florofor 647 gibi), uygun flüoresan kanalları görüntü kazanır. </li><li> Deneyden sonra, kurumsal hayvan kurallarına göre fare euthanize. Bu durumda, deney sonunda, bunlar, kanları tümüyle (intrakardiyak perfüzyon) takip servikal dislokasyon ile anestezi uygulanmış fare euthanize. </li></ol> Bir multiphoton Mikroskop kullanarak 6. Intravital Görüntüleme <ol><li> Silikon yağı kullanarak, kulak tabanında başlayan, yaklaşık 2 cm çapında ve kulak yaklaşık 2-3 mm yüksekliğinde bir dairesel duvar inşa. Emin hiçbir sızıntı noktaları vardır olun. Askorbat-Ringer tamponu ile daire doldurun. </li><li> Yeri faresahnede ve ısıtma yastık bağlayın (37 ° C). </li><li> Açık toplama yazılım ve multiphoton mikroskop ayarlarını yapılandırın. </li><li> Tümör hücreleri ve (örneğin Şekil 3 gibi) lekeli ECM proteinleri içeren dört farklı alanlara kadar seçin. Bu örnekte, uyum içinde GFP için 850 nm Ti-Safir lazer flüorofor 647 boyama için bir sonraki tek bir foton 647 sinyal ve SHG ile fibriler kollagenleri görselleştirmek. 1.00 NA lens ve 2 mm çalışma mesafesi suya daldırma HCX APO 20X ile (örneğin, GFP ve Şekil 3&#39;te florofor 647 gibi), uygun flüoresan kanalları görüntü ve zaman içinde, ikinci harmonik üretiminin, örneğin her 2 dakikada, elde edin. </li><li> Deneyden sonra, kansızlaştırma (intrakardiyak perfüzyon) izledi servikal dislokasyon ile anestezi fare euthanize. </li></ol>

<ol>
	<li>Martinez-Corral, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphatic+vessels+in+development,+wound+healing,+inflammation,+and+tumor+metastasis.">In vivo imaging of lymphatic vessels in development, wound healing, inflammation, and tumor metastasis.</a> Proc Natl Acad Sci. , (2012).</li><li>Snippert, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+crypt+homeostasis+results+from+neutral+competition+between+symmetrically+dividing+Lgr5+stem+cells.">Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells.</a> Cell. 143, 134-144 (2010).</li><li>Halin, C., Mora, J. R., Sumen, C., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+lymphocyte+trafficking.">In vivo imaging of lymphocyte trafficking.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 21, 581-603 (2005).</li><li>Kilarski, W., Petersson, L., Fuchs, P., Zielinski, M., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vivo+neovascularization+assay+for+screening+regulators+of+angiogenesis+and+assessing+their+effects+on+pre-existing+vessels.">An in vivo neovascularization assay for screening regulators of angiogenesis and assessing their effects on pre-existing vessels.</a> Angiogenesis. 15, 643-655 (2012).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravital+Immunofluorescence+for+Visualizing+the+Microcirculatory+and+Immune+Microenvironments+in+the+Mouse+Ear+Dermis.">Intravital Immunofluorescence for Visualizing the Microcirculatory and Immune Microenvironments in the Mouse Ear Dermis.</a> PLoS ONE. 8, (2013).</li><li>Steinbauer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-transfected+tumor+cells+are+useful+in+examining+early+metastasis+in+vivo,+but+immune+reaction+precludes+long-term+tumor+development+studies+in+immunocompetent+mice.">GFP-transfected tumor cells are useful in examining early metastasis in vivo, but immune reaction precludes long-term tumor development studies in immunocompetent mice.</a> Clin. Exp. Metastasis. 20, 135-141 (2003).</li><li>Ohashi, T., Kiehart, D. P., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+and+elasticity+of+the+fibronectin+matrix+in+living+cell+culture+visualized+by+fibronectin-green+fluorescent+protein.">Dynamics and elasticity of the fibronectin matrix in living cell culture visualized by fibronectin-green fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96, 2153-2158 (1999).</li><li>Egeblad, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+stromal+cell+dynamics+in+different+tumor+microenvironments+by+spinning+disk+confocal+microscopy.">Visualizing stromal cell dynamics in different tumor microenvironments by spinning disk confocal microscopy.</a> Dis. Models Mech. 1, 155-167 (2008).</li><li>Tal, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DC+mobilization+from+the+skin+requires+docking+to+immobilized+CCL21+on+lymphatic+endothelium+and+intralymphatic+crawling.">DC mobilization from the skin requires docking to immobilized CCL21 on lymphatic endothelium and intralymphatic crawling.</a> J. Exp. Med. 208, 2141-2153 (2011).</li><li>Roos, A., Trouw, L. A., Ioan-Facsinay, A., Daha, M. R., Verbeek, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , 1-14 (2005).</li><li>Kilarski, W. W., Samolov, B., Petersson, L., Kvanta, A., Gerwins, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biomechanical+regulation+of+blood+vessel+growth+during+tissue+vascularization.">Biomechanical regulation of blood vessel growth during tissue vascularization.</a> Nat Med. 15, 657-664 (2009).</li><li>Sahai, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+imaging+of+GFP,+CFP+and+collagen+in+tumors+in+vivo+using+multiphoton+microscopy.">Simultaneous imaging of GFP, CFP and collagen in tumors in vivo using multiphoton microscopy.</a> BMC Biotechnol. 5 (1), 14 (2005).</li><li>Wyckoff, J. B., Jones, J. G., Condeelis, J. S., Segall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+critical+step+in+metastasis:+In+vivo+analysis+of+intravasation+at+the+primary+tumor.">A critical step in metastasis: In vivo analysis of intravasation at the primary tumor.</a> Cancer Res. 60, 2504-2511 (2000).</li><li>Pinner, S., Sahai, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+amoeboid+cancer+cell+motility+in+vivo.">Imaging amoeboid cancer cell motility in vivo.</a> J. Microsc. 231, 441-445 (2008).</li><li>L&#228;mmermann, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+leukocyte+migration+by+integrin-independent+flowing+and+squeezing.">Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing.</a> Nature. 453, 51-55 (2008).</li><li>Padera, T. P., Stoll, B. R., So, P. T., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conventional+and+high-speed+intravital+multiphoton+laser+scanning+microscopy+of+microvasculature,+lymphatics,+and+leukocyte-endothelial+interactions.">Conventional and high-speed intravital multiphoton laser scanning microscopy of microvasculature, lymphatics, and leukocyte-endothelial interactions.</a> Mol. Imaging. 1, 9-15 (2002).</li><li>Giampieri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localized+and+reversible+TGFbeta+signalling+switches+breast+cancer+cells+from+cohesive+to+single+cell+motility.">Localized and reversible TGFbeta signalling switches breast cancer cells from cohesive to single cell motility.</a> Nat. Cell Biol. 11, 1287-1296 (2009).</li><li>Weber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interstitial+dendritic+cell+guidance+by+haptotactic+chemokine+gradients.">Interstitial dendritic cell guidance by haptotactic chemokine gradients.</a> Science. 339, 328-332 (2013).</li><li>Midwood, K. S., Orend, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+tenascin-C+in+tissue+injury+and+tumorigenesis.">The role of tenascin-C in tissue injury and tumorigenesis.</a> Journal of cell communication and signaling. 3, 287-310 (2009).</li><li>Pawley, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Biological Confocal Microscopy. , 340-341 (2006).</li><li>Sund, M., Kalluri, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+stroma+derived+biomarkers+in+cancer.">Tumor stroma derived biomarkers in cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, 177-183 (2009).</li><li>Mueller, M. M., Fusenig, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Friends+or+foes+-+bipolar+effects+of+the+tumour+stroma+in+cancer.">Friends or foes - bipolar effects of the tumour stroma in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 4, 839-849 (2004).</li><li>Brown, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+imaging+of+collagen+and+its+modulation+in+tumors+in+vivo+using+second-harmonic+generation.">Dynamic imaging of collagen and its modulation in tumors in vivo using second-harmonic generation.</a> Nat. Med. 9, 796-800 (2003).</li><li>Rice, J. J., Gerwins, P., Kilarski, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Angiogenesis:+Perspectives+from+Antiangiogenic+Tumor+Therapies.">Mechanisms of Angiogenesis: Perspectives from Antiangiogenic Tumor Therapies.</a> Current Angiogenesis. 1, 139-147 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Piston, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photobleaching+in+two-photon+excitation+microscopy.">Photobleaching in two-photon excitation microscopy.</a> Biophysical journal. 78, 2159-2162 (2000).</li><li>Jakobsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparan+sulfate+in+trans+potentiates+VEGFR-mediated+angiogenesis.">Heparan sulfate in trans potentiates VEGFR-mediated angiogenesis.</a> Dev Cell. 10, 625-634 (2006).</li><li>Kilarski, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+and+regeneration+kinetics+of+lymphatic-specific+photodynamic+therapy+in+the+mouse+dermis.">Optimization and regeneration kinetics of lymphatic-specific photodynamic therapy in the mouse dermis.</a> Angiogenesis. , (2013).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Önem Burada yüksek çözünürlük ve lifimsi yanı sıra örgü benzeri matriks proteinleri dahil olmak üzere farklı doku mikroçevresinin bileşenleri, dinamik görselleştirme sağlayan bir roman intravital mikroskopi yaklaşım sunmak. (I) intravital flüoresan görüntüleme kan veya lenf eriyik sızıntı izlemek için, örneğin, mikrodolaşım çalışmalarda kullanılmıştır, ancak imüno kombine değil: Bu yöntem, mevcut intravital görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığı zaman pek çok avantajı vardır. (Ii) genetiği değiştirilmiş muhabiri farelerin kullanılması yansıması için özel hücre türleri için izin verir, ama onların durumunu (veya yenilerini oluşturmak için büyük çaba) gerektirir ve okudu olabilir hücre tiplerini etkileşim sayısını sınırlar. (Iii) Hücre dışı matriks ikinci harmonik kuşak kullanılarak in vivo görüntülü olabilir, ancak bu teknik sadece önemli hücre bileşenleri, çok sayıda bırakarak elyaflı kolajenleri algılayabilirbazal membranların, fibronektinler, tenascins, büyüme faktörleri, kemokin ve güncel araştırma için ulaşamayacağı doku glikozaminoglikanların gibi. Bizim yöntem bu kısıtlamaların üstesinden, ve standart görüntüleme teknikleri büyüme faktörleri (örn. VEGF 26) ve kemokinleri (CCL21 5,18 ve Şek. 2B bağlayıcı diğer hücre tipleri, doku yapıları, heparin sülfat mevduat için immunostainings ile birleşmiş ve daha fazla kombine edilmesini sağlar ), ya da hücre dışı matris proteinleri, aynı zamanda kan ve / veya lenf akışı izleme sırasında. Sınırlamalar Intravital IF epifluorışıma görüntüleme kalın hipodermiste (adipoz dokusu) yoksun ince cilt kapakları, sınırlıdır. Biz dorsal kulak dermis teknik kulak dermiş ile sınırlı değildir IF intravital ile kulak deri epifluoresan nispeten zararsız cerrahi maruz için en uygun olan ve potansiyel olarak örneğin uygulanabilir ki bulurkenayak parmakları veya yeni doğmuş fare arka derinin açıkta kalan cilt. Imünofloresansta hızlı antikor boyama (15 dakika) IF pasif difüzyon bağımlı değil ama fonksiyonel lenfatik drenajı ve interstisyel sıvı akışı gerektirir, lenf damarları 27 tıkalı ise dolayısıyla hiçbir lekelenme görülebilir. Bu doğrultuda, lenf damarları güçlü sonra sızan kan damarsal (yaralı gemiler, arteriol) 5. leke. Dorsal ve ventral kulak deri kanatların ayrılması hafif bir cerrahi prosedürdür ancak çeşitli doku hücrelerine bir kılcal ve hücre ölümüne yaralanmasına neden olmaktadır. Örneğin bir hücre sağkalım üzerine ilaçların hafif etkisi bakarak, tamamen sağlam dokuyu araştırmak gerektiğinde bu bir sorun olabilir. Ayrıca fototoksisite ve ağartmanın gelen cildi korumak için hizmet veren antioksidan uygulama doku oksidatif stres veya nitrik oksit biolog örneğin çalışma Intravital immünfloresans tekniğinin kullanılmasını hariçy. Son olarak, bağışıklık kompleksleriyle doku yerleşik makrofaj kör, bu hücreler ve doku bağışıklık tepkisi ve dendritik hücre aktivasyonunun etkisi, örneğin çalışma aktive edebilir. Değişiklikler ve sorun giderme Doku oksidatif stres veya nitrik oksit biyoloji incelemek için, askorbat deneysel çıkışı ile karışmaz diğer doku uyumlu bir ortam ile değiştirilmesi gerekir. Çalışmanın amacı, işlevi ve bağışıklık yanıtı, doku ve dendritik hücre aktivasyonu ve göç aktivasyonu ise ilgili dermal bağışıklık hücreleri üzerinde bloke Fc reseptörleri kaçınılmalıdır. Bu, (F (ab &#39;) 2 antikor fragmanları) veya algılama reaktifleri olarak biyotinile antikor ve fluoresan streptavidin kullanımı yarılır Fc fragmanı ile ikincil antikorun kullanılması ile yapılabilir. Gelecek uygulamalar Ayrıca yeni ve benzersiz bir intra mevcutönemli bir IF iki foton mikroskopi kullanılarak tespit SHG-fibriler ve olgunlaşmış kolajenlerin ile kombinasyon halinde transplante deri tümörlerde hücre dışı matrisin görüntü fibriler olmayan bileşenlere tekniği. Epifloresans görüntüleme fazla çoklu foton (veya konfokal) mikroskopi kullanılarak avantajlarından biri, z-istifleme olasılıktır ve sonuç olarak hücre-dışı matris içinde meydana gelen olaylar eş-lokalizasyonu uzamsal, lenf ya da kan damar içine, örneğin, tümör intravazasyon ki durumunda standart epifluorışıma mikroskopi sadece işgalci hücrenin morfolojik değişimler anlaşılabilir. Bu teknik, çok daha geniş bir potansiyele sahiptir. Lenfatik özgü fotodinamik terapi 27 lenfatik tıkanma mekanizmasını araştırmak için IF Örneğin, intravital kullandık. Bu yöntemin ilave potansiyel uygulamalar arasında, ancak nakli reddi veya kan ve lenf yöntemleri iltihabı, bağışıklık mekanizması sırasında cilt incelenmesi ile sınırlı değildir<html> tümörigenez sırasında problemlerle damarı büyümesi. Prosedür kritik adım Fizyolojik doku ortamda sürdürülmesi için kritik etkileri vardır en önemli adım dorsal dermis ventral deri ve kıkırdak bir cerrahi ayrılmasıdır. Kesme ya da majör arter veya ven kapatılmasıy tedavileri ve hücre hareketi 8 hücresel yanıtı etkileyecek olan, aşırı kanama ve lokal doku hipoksi yol açacaktır. Cerrahi yapıştırıcı ile kulağını hareketsizleştirir doku ortaya üzerine tutkal dökülüp olarak dikkatle yapılmalıdır kan damarlarının tıkanması ile dokuya kalıcı bir yaralanmaya neden olacaktır. Fare sıcaklığı 37 ° C &#39;de kontrol ve tutulmalıdır Gözler ve akciğerler düzgün deney sırasında nemlendirilmiş kalmak, böylece Ayrıca, nemlendirilmiş oksijen, izofluran anestezi için kullanılması gerekmektedir. Aynı zamanda, sodyum askorbat, taze hazırlanmalıdır ve pH kullanılmadan önce kontrol edilir. Özet olarak ntent &quot;&gt;, bu intravital imüno-fare deri kompleks hücresel olayların moleküler görüntüleme ile fizyolojik fonksiyonun gerçek zamanlı, yerel ölçümler köprü oluşturur. kolayca sonrası gelişim, örneğin çalışma uygulanabilir Dahası, bu yöntem, büyük bir potansiyele sahip Kan ve lenf-anjiyogenez veya esneklik ve yüksek verim potansiyeline sahip. çeşitli patojenik ajanlarla cilt enfeksiyonu erken evrelerini görselleştirmek için mekanizmalar, bu intravital tekniği önemli ölçüde biyoloji birden alanlarına katkıda bulunabilir.

Inflamatuar, metastatik ve matriks yeniden süreçlerin Intravital görüntüleme araştırma önemli bir alan olmuştur ve floresan proteinleri 1,2 ifade sayıda transgenik muhabiri fare modellerinin oluşturulması motive etti. Nedeniyle görüntü kalitesini düşürür ve sınırları doku yoluyla nüfuz ışık out-of-focus floresan sinyallerine, görüntüleme kalın doku sadece konfokal veya çoklu foton tarama mikroskobu 3 ile mümkündür. Daha hızlı kullanarak, daha az pahalı ve karmaşık bir epifluorışıma mikroskopi sadece bu tavuk Chorio-allantoik zar 4 ya da 5 fare kulak dermiş olarak yaklaşık iki boyutlu bir doku ile mümkündür. Çoğu görüntüleme sistemleri, hücre tipine özgü bir şekilde çeşitli floresan proteinleri ifade eden transjenik farelerin yararlanmak. Bu proteinler zayıf fototoksisite sunmak olsa da, onlar immün yanıtı 6 neden. Ayrıca, belirli bir hücre alt tipleri arasında geçiş ya da işaretlemek için zordurBöyle bir değişiklik gibi ir bazal veya aktif devletlerin yeni bir genetik modelin hazırlık gerektirir. Floresan protein ifadesi genel olarak hücre içi bölüm ile sınırlandırılmıştır Buna ek olarak, genellikle bazal membran proteinleri ya da doku kemokin mevduat 7 gibi görüntü dışı yapılara mümkün değildir. Bunun yerine, hücre dışı antijenlere karşı antikor ile dolaylı etiketleme hemen hemen herhangi bir hücre tipi ya da belirli matris bileşeninin 8,9 için esneklik sağlar. Bununla birlikte, bu etiketleme yaklaşımın en önemli dezavantajı, kompleman sistemi bağımlı hücre toksisitesi ve hücreler ve hücre dışı yapıların 10 fagositozunun tetikleyebilir antijen-antikor bağışıklık kompleksleri tarafından bağdaştırılan İmmünotoksisite ile ilişkilidir. Inflamasyon ya da yara iyileşmesi sırasında, hücre dışı, tümör mikro matris, aynı zamanda, normal doku, önemli yeniden şekil alır. Tümör mikro-Stromal sertleştirici promo olabilirnedeniyle stres kaynaklı sinyal mekanizmaları ve kan ve lenf damarlarının 11 nedeni biçimlenme te tümör büyümesi ve işgali. Bununla birlikte, matris proteinlerinin canlı görüntüleme çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdır. Son zamanlarda biz görüntülenmiş hücre ve doku yapılarına 5 fotoğraf ve immün-toksik hasar riskini en aza indiren yeni bir Intravital görüntüleme yöntemi yayınladı. Sürekli intravital görselleştirme bir yuvarlak, 2 saat 30 dakika 12-17 aralığı içinde kurulmuş görüntüleme teknikleri ile karşılaştırıldığında, bizim intravital immünofloresan (IF) tekniği 12 saat (uzun süreli 8) görüntüleme izin verdi. Bu görüntüleme zamanı bizim hayvan protokolde belirlenen limitler nedeniyle 12 saat ile sınırlı ancak bu uzun süreli olamaz hiçbir teknik karşı göstergeler var olduğunu not etmek önemlidir eğer tansiyon ve kalp gibi hayvanın kritik sağlık parametreleri,hızı 8 kontrol edilir. Buna ek olarak, otomatik bir floresan stereomikroskop kullanılarak bir tek bir deney sırasında birden fazla alanlardan görüntü toplamak mümkün ve fonksiyonel kan ve lenf damarları tarafından desteklenen cildin fizyolojik bağlamında meydana gelen nadir immünolojik ve re görülmektedir. Stereomicroscopic lens bir göreceli olarak büyük, 2 cm, çalışma mesafesi vardır ve iki foton mikroskobik optik aksine, su altında buharlaşabilen gerektirmez, çünkü uzun süreli sadece görüntüleme flöresanlı bir stereomikroskop altında gerçekleştirildi. Intravital IF, normal derinin herhangi bir hücre dışı matris bileşeninin bağışıklık etiketleme ve tespit izin verdi. Bu tekniğin tasarımı zararlı etkilere immunotoksik 5 neden olmadan, canlı hücreleri ve cerrahi maruz kalan fare dermis doku matris elemanları için immun boyama kullanarak yenilikçi kavramına dayanmaktadır. Cerrahi prosedür kendisi dermis güvenlisadece bağımsız özerk kan ile beslenen ve ayrı lenfatik dolaşım tarafından drene, innerve kulakta iki cilt katmanlarının ayrılması dayanır gibi damarsal. Bizim deneysel kurulum sağlar, kan ve lenf damarları ve yara iyileşme süreçlerinin arasında lökosit kaçakçılığı olmak üzere en az 12 saat, aşırı önemli pato-fizyolojik olayların bir dizi görüntüleme. Orijinal yayında, biz intravital görüntüleme çeşitli alanlarında state-of-the-art standartlarına bizim teknik karşılaştırdık. Sonuç olarak, ilk lenf damarları 15 toplama yerine beklenen girerek bağışıklık hücrelerinin eşsiz görselleştirilmesi de dahil olmak üzere çeşitli lökositlerin, kan ve lenf damarı ekstravazasyonu intravazasyon etkinlik gözlenmiştir. Ayrıca, diğer gruplar 9,18 tarafından yapılan gözlemler tamamlayan, biz vivo CCL21 toplayarak değil, sadece seyrek ilk lenfatiklerde güçlü, süreksiz mevduat oluşturmak mümkün olduğunu bulundu. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Burada bir modifiye Intravital tanımlamak IF ikinci harmonik üretimi (SHG) kullanarak fibrillar kolajenlerin ağını tespit etmek için iki-foton mikroskopi ile kombine edilebilir tekniktir. Bu yöntem aynı zamanda mevcut görüntüleme teknikleri 19 ile büyük ölçüde keşfedilmemiş olan bu tür tenaskin C matris moleküllerini içeren dinamik tümör mikro-, bağlamında görüntüleme, kanser hücresi yayılımını için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu tümör fibriler matris, ikinci harmonik oluşumu ile tespit Ayrıca, yerel matris kasılması neden damar yeniden örneklerini tarif uzun tenaskin C. oluşan yeni biriken matris göre tümör mikro farklı yerleri işgal bulundu tümör hücreleri ve bazal membran kolajen IV boyunca tümör hücre göçü ile T-hücre etkileşimleri dönem (12 saat) görüntüleme. Aynı anda kan damarı pe gibi yerel fizyolojik parametreleri kayıt sırasında bu tür olaylar görüntülenebilirrmeability ve lenfatik drenaj.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="966">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mice Strain</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:173px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">BALB/C mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Charles River&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Orleans,France</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">C57/Bl6 Mice (8-12 weeks )</td>
			<td style="width:159px;">Harlan&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Carshalton UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Line&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">B16 F10 Melanoma expressing OVA-GFP&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Anesthesia Maintenance&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Isofluorane&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Minrad Inc.&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">2222</td>
			<td>Minrad Inc., Buffalo, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Humidified delivery system&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Rothhacher GmBH&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Berne, Switzerland&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">DC Temperature Control System&#160;</td>
			<td style="width:159px;">FHC Inc&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Bowdoin, MA</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Stereomicroscope&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;">Fluorescence stereomicroscope with a motorized stage .</td>
			<td style="width:159px;">M250 FA, Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">&#160;1&#215; lens (linear system magnification from 7.5&#215; to 160&#215;)&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">2&#215; lens (linear system magnification from 15.6&#215; to 320&#215;)</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">DFC 350 FX camera controlled by LAS AF software&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Multiphoton Microscopy&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">LEICA SP5, two-photon multiplier, motorized stage&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Leica Microsystems CMS GmbH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Wetzlar, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HCX APO 20x/1.2 oil immersion&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chameleon Ultra Laser&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:515px;">Ringer&#39;s buffer (102 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 28 mM sodium lactate)</td>
			<td>B. Braun Medical AG</td>
			<td align="right">445968</td>
			<td>Sempach, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Aprotinin&#160;</td>
			<td>Elastin</td>
			<td>AP92</td>
			<td>Owensville, MO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Thrombin&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T7326-1KU&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium ascorbate</td>
			<td style="width:159px;">Sigma-Aldrich&#160;&#160;</td>
			<td>11140-50G&#160;</td>
			<td>Taufkirchen, Germany&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Mouse Serum raised against human IgG&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Abcam&#160;</td>
			<td>ab34834&#160;</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Collagen IV&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>AB6581</td>
			<td>Cambridge, UK</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Perlacan&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>ab79465&#160;</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Tenascin C&#160;</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td>AF3358</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Podoplanin</td>
			<td style="width:159px;">RnD&#160;</td>
			<td style="width:119px;">AF3244</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">LYVE-1&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Reliatech&#160;</td>
			<td>103-PA50&#160;</td>
			<td>Wolfenb&#252;ttel, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CCL21</td>
			<td style="width:159px;">RnD</td>
			<td style="width:119px;">AF457</td>
			<td>Minneapolis, MN</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Pacific Blue&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S11222</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 647&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>S21374</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Streptavidin Alexa 488&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td style="width:119px;">S11223</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Goat 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21113</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Donkey Anti Rabbit 594&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen&#160;</td>
			<td>A21207</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">CMTPX CellTracker</td>
			<td style="width:159px;">Lifetechnologies</td>
			<td style="width:119px;">C34552</td>
			<td>Carlsbad, California</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Histocryl (surgical glue)</td>
			<td style="width:159px;">Braun Aesculap</td>
			<td style="width:119px;">1050060</td>
			<td>Tuttlingen, Germany</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">Cell Culture Reagents&#160;</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle&#8217;s medium (DMEM</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>E15-843&#160;</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal bovine serum (FBS</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td>25300062</td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:515px;">PBS&#160;</td>
			<td>Gibco Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Grand Island, NY</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

long-term intravital immunofluorescence imaging of tissue matrix components with epifluorescence and two-photon microscopy

Doku morfolojisi muhafaza edilmesi için bir fiziksel bir iskele olmanın yanı sıra, hücre dışı matris (ECM) gelişim ve organ aktif homeostazı sırasında, hücre ve doku fonksiyonlarının düzenlenmesinde yer almaktadır. Bu biyolojik olarak aktif ECM protein fragmanlarının salınmasıyla gibi, biyomekanik biyokimyasal ve biyofiziksel sinyal yollarının, aracılığıyla etki doku gerilimi düzenlemek ve hücre göçü için yollar sağlayarak yapar. Tümör mikro-hücre dışı matris bozulması, birikimi ve fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin düzenlenmesi ile karakterize edilen önemli yeniden, maruz kalır. Tümör mikro stromal sertleşmesi tümör büyümesini ve istilasını teşvik, kan ve lenfatik damarların yeniden neden olabilir. Matris proteinlerinin canlı görüntüleme, ancak bu noktaya matris bileşenlerinin çoğunluğu l bırakarak, çoklu foton mikroskopi kullanılarak ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilebilir fibril kolajenlerin sınırlıdırargely görünmez. Burada hücre dışı matris proteinleri ve Epifloresans ve iki foton mikroskopi kullanılarak canlı farelerde maruz doku intravital görüntüleme immün, ince dorsal deri, kulak tümör aşılama için işlemleri tarif eder. Bizim intravital görüntüleme yöntemi büyüyen tümör dermal bağlamında fibriler ve fibriler olmayan matris proteinlerinin her ikisinin de doğrudan saptanması için izin verir. Biz yerel matris kasılması neden gemi yeniden örneklerini göstermektedir. Ayrıca, ikinci harmonik oluşumu ile tespit edilen tümör fibriler matris Ayrıca tümör hücreleri ve tümör hücreleri ile T-hücre etkileşiminin uzun süreli (12 saat) gibi görüntüleme gösterdi tenaskin C gibi yeni yatırılan matris bileşenleri uzamsal olarak ayrı olduğu bulunmuştur bazal membran kolajen IV boyunca göç. Birlikte ele alındığında, bu yöntem, benzersiz ata olabilir tümör hücrelerinin eş zamanlı saptanması, fiziksel mikro-ve zaman içinde endojen doku immün tepkisi için, izin verirtümör ilerlemesi ve nihai başarı veya tedaviye direnç altında yatan mekanizmalar içine ide önemli anlayışlar.

Bugüne kadar, canlı dokuda immüno-boyama tipik olarak yüksek bir arka plan ve İmmünotoksisite 20 yol açan immün komplekslerin oluşumu için kullanılmaz. Bu nedenle daha sonraki dolaylı güçlü immünoboyamayla bu hücreleri &quot;kör&quot;, doku makrofajlar üzerinde Fcy reseptörleri öncesi bloke ederek üstesinden oldu. Etiketleme dışı olduğu gibi, fototoksisite ve fluorofor ağartıcı, doğal bir antioksidan, tamponlu, isosmotic askorbik asit (Şekil 1) &#39;de doku içine daldırma ile kontrol edilebilir. Photobleaching şimdi inhibe ama tamamen (Şekil 1B) önlenebilir değil, böylece bu yöntemin 5 bizim ilk tanımlanmasından bu yana, biz anti-beyazlatma ve anti-fototoksik tekniği geliştirdi. Bu, kulak hareketsizleştirildiği oda içindeki antioksidan (100 ul) büyük bir hacimde kulak gömerek yapılır. Resim zaman 300 saniye sabit görüntüleme zamanı görüntüleme 10 saate karşılık unutmayın500 msn her dakika (ortalama görüntüleme ayarları) için toplandı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig1.jpg" /> Şekil 1. Photobleaching ve fototoksisite Ringer tampon maddesi içinde ascorbateyle klorür yerine ve solüsyon 100 ul hacim içinde maruz kulak gömme durdurulmuştur. (A) Doku kolajen IV, bazal membran bileşenine karşı bir biyotinlenmiş antikor ile ilk boyandı. Boyama daha sonra streptavidin-647 (kırmızı) ile tespit edilir ve daha sonra sürekli normal Ringer tampon maddesi (üst panel) veya askorbat-Ringer (alt panel) ya da 300 saniye boyunca görüntülenmiştir. Pictures 500 msn her dakika (her zamanki görüntüleme ayarları) için toplandığı zaman 300 saniye sabit görüntüleme zamanı görüntüleme 10 saate karşılık geldiğini unutmayın. Pi parlak 25%xel yoğunluk değerleri yeşil renklidir. Immünofloresan çürüme (B) miktarının (Ringer vs içinde% 50 askorbat-Ringer olarak% 0). Değerler başlangıç ​​floresans normalleştirildi. Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. A Ölçeği bar, 100 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> Tümör hücreleri ve metastatik tümör stroma arasındaki etkileşimi araştıran tümör hücre göçü ve tümör dokunulmazlık sürecini anlamak için çok önemlidir. Tümör-stroma ilişkili tümör kütlesinin% 90 kadar aktif oluşturan ve tümör büyümesi ve metastaz yayılması 21 düzenler olmasıdır. Ancak, lenfatik veya kan damarlarının ya doğru matris sürücüler tümör hücresi göçü 22 eksik nasıl içine mekanik anlayış. Bu durum, kısmen bağlı olduğu intravital immatris proteinlerinin yaşlanma iki foton mikroskopi 23 ikinci harmonik nesil kullanarak fibriler kolajenlerin olgunlaşmış liflerin görselleştirilmesi ile sınırlıdır. Bu nedenle, hücre dışı matriks bileşenlerinin doğrudan görselleştirme dahil kan ve lenf damarları, perisitlerden, sinirler, kas ve adipositlere dahil doku mikroçevresinin görselleştirme için bizim yöntemi uyarlanmış. Birçok yapıları, kolajen IV veya perlekan (Şekil 2A), ancak, belirli bir hücre yüzey belirteçleri için doğrudan boyanması, örneğin Lyve1 (Şekil 2B ve C) ve podoplanin gibi bazal membran bileşenleri için immün sonra morfolojiye göre ayırt edilebilir (Şekil .) - 2C), ayrıca ilk, kılcal lenfatiklerince lenfatik toplayıcıları (Lyve1 +) (Lyve1 ayırt sağlar. Deride matris bağlı CCL21 için boyama, lenfatik toplayıcıları ide bazal membran bu kemokinin depolanmalarıperlekan için boyama, heparan sülfat proteoglikan (Şekil 2D) ile ntified. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig2.jpg" /> Normal bir fare kulakları canlı boyama 2. Örnekleri Şekil. (A) perlekan için boyandığında, bir bazal membran bileşeni, tüm kan ve lenf damarları, sinirleri, kas lifleri ve adipositleri gösteriyor. (B) Lyve1 boyama ilk lenfatik kılcal ağ işaretler. Lyve1 ve podoplanin, bir pan-lenfatik işaretleyici için (C) Co-boyama başlangıç ​​ve toplama lenfatiklerden ağları gösteriyor. Dorsal kulak dermis kulak dermis olarak (optik kesit olmadan) klasik epifluorışıma mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir aksi görüntüleme alanını kapsayacak adipositlere düşük numarası vardır. (D) CCL21 stai<html> perlekan (kırmızı) için boyanmış lenfatik bazal membran üzerine ning (yeşil). Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. A ve B Ölçek çubukları, 1 mm; C, 100 mikron ve D 50 mikron. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.</a> En önemlisi, normal SHG, klasik matris saptama yöntemi 23 ile tespit edilemez yapısal proteinler, görselleştirilebilir. Örneğin, bu tenaskin C (Şekil 3A), kanser gelişimi sürecinde ifade edilen bir matris protein bulundu, yara iyileştirici ve iltihap 19 fibriler kolajenler (Şekil 3B), tümör stromanın farklı yerlerde yatırılır. Bu matris heterojenlik tümör hücre dağılımı ve metastaz (Şekil 3C) etkileyebilir. <html> t &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51388/51388fig3.jpg" /> Şekil 3.. Dorsal kulak dermiş canlı çoklu foton mikroskopi kullanılarak görüntülü olabilir. Tümör B16-F10 tek bir alan. Tümör stroma tenaskin C antikor ile etiketlenmiştir ve boyama anti-keçi-594 eşek antikoru ile tespit edildi. Tenaskin C (kırmızı) immünofloresan ağ A&#39;da gösterilen ve fibriler kollajen B&#39;de ikinci harmonik oluşumu (SGH) ile tespit edilir. Bu iki ağlar (birleştirilmiş) C tümör hücreleri (mavi) ile bindirilmiş. Tenaskin C tarafından işaretlenen yeni tümör matris SHG (yeşil) ile tespit fibrillar kolajenlerin ile örtüşen değildir. 44, dört kez z adım 1,0 mikron ile z-bölümleri ortalama ile görüntü 16 bit renk derinliği modunda satın alındı. Iki foton mikroskop ile toplanan görüntüler. Ölçek çubuğu, 100 mikron.ref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/51388fig3highres.jpg&quot; target = &quot;_blank&quot;&gt; bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız. Farklı tümör matris bileşenlerinin tümör matris (örneğin, tenaskin C ve kolajen IV) immunolabeling sonra biz olabilir tespit sınırlı ve tümör matris yönlü yeniden ani etkinlik (Video 1). Biz yaralar 11,24 iyileşme olması durumunda, daha önce gösterdiği gibi tümör mikro-Kuvvetler içinde geliştirmek tümör matris ve sonuç şekillenmesi ve benzer ölçüde tümör damar uzama genişleme ya da daralmaya neden olabilir. Kollajen IV (kırmızı) ve tenaskin C (camgöbeği), kan damarları (ok) uzayacağı ve pasif üç tümör hücreleri (yeşil) translocate ile etiketlenmiş tümör matriks Video 1. Genişleme. Teascin C-zengin tümör matris translocate kan damarı (kırmızı yatay odaklı structur lokalize daralmae) görüntüleme 12 saat boyunca yaklaşık 100 mikron ile. Immünfloresans steriomikroskop toplanan Görüntüler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video1_New.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Bu deneylerde kullanılan foton akısı oksidasyon hızlı bir şekilde 25 korunmazsınız floresan boyalar ağartılması gibi florofor etiketi ile birlikte çoklu foton mikroskopi kullanılarak sorunludur. Burada biz aynı anda hatta (Video 2) yüksek foton yoğunluğu iki-foton mikroskopi Flüoroforlann minimal photobleaching imüno tenaskin C matrisi görüntüleme ederken biz iki-foton time-lapse mikroskobu gerçekleştirebilirsiniz olduğunu göstermektedir. Iki-foton mikroskopi sırasında tenaskin C immünofloresans (kırmızı) Video 2. Düşük seviyeli photobleaching. B16-F10-GFP tümör hücreleri (mavi) 9 gün aşılamadan sonra açık dorsal kulak görüntülendi. Flüoresan sinyali, askorbat-uygulanması ile korunduGörüntülenmiş doku üzerine Ringer tamponu. Ikinci harmonik üretimi (yeşil) dört kez z aşamalı 1.9 um ile z-ortalama bölümleri 11, 15 dakika boyunca satın alınmıştır C. 16 bit renk derinliği görseli tenaskin temsil yeni matris ile üst üste değildir. Görüntüler toplanan 6 z-düzlemleri içinde her 1 dakika 5 saniye toplanmıştır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video2.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Ayrıca, metastatik tümör hücreleri ile bağışıklık-hücre etkileşimleri görüntülenmiş. 8 saat iv transfüzyon sonrası tümör-ilişkili kan damarlarından damar dışına bir tümör taşıyan fareden CMTPX etiketli splenositler, tümörün işgal matris ve aktif bir uzun süreli temas hücre (Video 2) oluşturulması ile tümör hücreleri ile etkileşim. Flüoroforla 647-etiketli kolajen IV yapıları görüntüleme 12 saat boyunca Photobleaching dirençli idi. Tümörden CMTPX etiketli splenositler (B16-F10)-b Video 3. Etkileşimbireysel tümör hücreleri (GFP-B16-F10) ile fare küpe. Splenositler kollajen IV için doku boyama sonra transfüzyonu iv idi. Kollajen IV-yeşil (647) Splenositler-kırmızı (CMTPX), B16-F10 siyan (GFP). Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. Video süresi 12 saat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video3-corrected.mov" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Yeni izole edilmiş tümör hücrelerinin maruz kulak dermiş kolajen IV için önceden lekelenmiş üzerinde kaplanmıştır. Biz dokuya yapışan sonra hücrelerin bazı gruplar, kan damarları ve adipositin bazal membran boyunca toplu göç başladı görülmektedir olabilir. Video 4. Tümör hücreleri bazal membran boyunca göç ederler. Normal kulak derisi taze geçişli B16-F10-GFP hücreleri ile örtüldü ve 5 saat süre ile görüntülendi (kırmızı 647) kolajen IV için boyandı. Dokuya yapışık bazı tümör hücrelerinin birlikte ortak göç başladıkan damarları ve adipositlerin bazal membran. Immünfloresans steriomikroskop toplanan görüntüler. Video süresi:. 5 saat <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51388/Video4.avi" target="_blank">Videoyu izlemek için buraya tıklayın.</a> Kulak dermis neredeyse iki boyutlu olduğu için Ayrıca, biz kolayca yerine daha yavaş ve daha pahalı confocal veya multiphoton mikroskobu, hızlı, floresan stereomikroskobi kullanarak veri geniş hacimli toplamak olabilir. Ancak, bizim intravital ile söz konusu tarama mikroskobu yöntemlerden herhangi birini kullanmak da mümkündür IF preparatları (Şekil 3, Video 1).

Watch this Scientific Journal Video about Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy at JoVE.com

Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak.

Epifluoresan ile Doku Matrix Bileşenler ve İki foton Mikroskopi uzun vadeli Intravital İmmünofloresan Görüntüleme

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

long-term-intravital-immunofluorescence-imaging-tissue-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

19.0K Görüntüleme.  École Polytechnique Fédérale de Lausanne.  Hücre dışı matris yara iyileşmesi, iltihap ve kanser gelişimi sürecinde önemli bir yeniden şekil alır. Biz lifimsi dinamiklerinin yanı sıra Epifloresans veya iki-foton mikroskopi kullanılarak yüksek uzaysal ve zamansal çözünürlüğe sahip örgü benzeri matris bileşenleri görselleştirmek için yeni bir Intravital immunofloresan mikroskopi yaklaşım sunmak. 

Video: Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Non-contact, Label-free Monitoring of Cells and Extracellular Matrix using Raman Spectroscopy

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, currently available routine methods require processing steps and alter sample integrity. Raman spectroscopy is a fast method that enables the measurement of biological samples without the need for further processing steps. This laser-based technology detects the inelastic scattering of monochromatic light.6 As every chemical vibration is assigned to a specific Raman band (wavenumber in cm-1), each biological sample features a typical spectral pattern due to their inherent biochemical composition.7-9 Within Raman spectra, the peak intensities correlate with the amount of the present molecular bonds.1 Similarities and differences of the spectral data sets can be detected by employing a multivariate analysis (e.g. principal component analysis (PCA)).10
Here, we perform Raman spectroscopy of living cells and native tissues. Cells are either seeded on glass bottom dishes or kept in suspension under normal cell culture conditions (37 &deg;C, 5% CO2) before measurement. Native tissues are dissected and stored in phosphate buffered saline (PBS) at 4 &deg;C prior measurements. Depending on our experimental set up, we then either focused on the cell nucleus or extracellular matrix (ECM) proteins such as elastin and collagen. For all studies, a minimum of 30 cells or 30 random points of interest within the ECM are measured. Data processing steps included background subtraction and normalization.

Raman spectroscopy is a suitable technique for the non-contact, label-free analysis of living cells, tissue-engineered constructs and native tissues. Source-specific spectral fingerprints can be generated and analyzed using multivariate analysis.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Non-destructive, non-contact and label-free technologies to monitor cell and tissue cultures are needed in the field of biomedical research.1-5 However, ...

Biyomühendislik

Creating Adhesive and Soluble Gradients for Imaging Cell Migration with Fluorescence Microscopy

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as growth factors. Here, we outline a method to create opposing gradients of adhesive and soluble cues in a microfluidic chamber, which is compatible with live cell imaging. A copolymer of poly-L-lysine and polyethylene glycol (PLL-PEG) is employed to passivate glass coverslips and prevent non-specific adsorption of biomolecules and cells. Next, microcontact printing or dip pen lithography are used to create tracks of streptavidin on the passivated surfaces to serve as anchoring points for the biotinylated peptide arginine-glycine-aspartic acid (RGD) as the adhesive cue. A microfluidic device is placed onto the modified surface and used to create the gradient of adhesive cues (100% RGD to 0% RGD) on the streptavidin tracks. Finally, the same microfluidic device is used to create a gradient of a chemoattractant such as fetal bovine serum (FBS), as the soluble cue in the opposite direction of the gradient of adhesive cues.

A method for the assembly of adhesive and soluble gradients in a microscopy chamber for live cell migration studies is described. The engineered environment combines antifouling surfaces and adhesive tracks with solution gradients and therefore allows one to determine the relative importance of guidance cues.

Floresan Mikroskobu ile Görüntüleme Hücre Göç Yapıştırıcı ve Çözünür Degradeler oluşturma

Cells can sense and migrate towards higher concentrations of adhesive cues such as the glycoproteins of the extracellular matrix and soluble cues such as ...

The Multi-organ Chip - A Microfluidic Platform for Long-term Multi-tissue Coculture

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need for new solutions for substance testing. Many drugs that have been removed from the market due to drug-induced liver injury released their toxic potential only after several doses of chronic testing in humans. However, a controlled microenvironment is pivotal for long-term multiple dosing experiments,&#160;as even minor alterations in extracellular conditions may greatly influence the cell physiology. We focused within our research program on the generation of a microengineered bioreactor, which can be dynamically perfused by an on-chip pump and combines at least two culture spaces for multi-organ applications. This circulatory system mimics the in vivo conditions of primary cell cultures better and assures a steadier,&#160;more quantifiable extracellular relay of signals to the cells. 
For demonstration purposes, human liver equivalents, generated by aggregating differentiated HepaRG cells with human hepatic stellate cells in hanging drop plates, were cocultured with human skin punch biopsies for up to 28 days inside the microbioreactor. The use of cell culture inserts enables the skin to be cultured at an air-liquid interface, allowing topical substance exposure. The microbioreactor system is capable of supporting these cocultures at near physiologic fluid flow and volume-to-liquid ratios, ensuring stable and organotypic culture conditions. The possibility of long-term cultures enables the repeated exposure to substances. Furthermore, a vascularization of the microfluidic channel circuit using human dermal microvascular endothelial cells yields a physiologically more relevant vascular model.

Here, we present a protocol to coculture primary cells, tissue models and punch biopsies in a microfluidic multi-organ chip for up to 28 days. Human dermal microvascular endothelial cells, liver aggregates and skin biopsies were successfully combined in a common media circulation.

Çok organ Chip - Uzun vadeli Çok doku kokültürü için mikroakışkan Platformu

The ever growing amount of new substances released onto the market and the limited predictability of current in vitro test systems has led to a high need ...

Long-term Live Imaging Device for Improved Experimental Manipulation of Zebrafish Larvae

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for live high-resolution microscopic imaging of dynamic biological phenomena in space and time with cellular resolution. However, the traditional method of agarose encapsulation for live imaging can impede larval development and tissue regrowth. Therefore, this manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which was designed and fabricated as a functionally compartmentalized device to orient larvae for high-resolution microscopy while permitting caudal fin transection within the device and subsequent unrestrained tail development and re-growth. This device allows for wounding and long-term imaging while maintaining viability. Given that the zWEDGI mold is 3D printed, the customizability of its geometries make it easily modified for diverse zebrafish imaging applications. Furthermore, the zWEDGI offers numerous benefits, such as access to the larva during experimentation for wounding or for the application of reagents, paralleled orientation of multiple larvae for streamlined imaging, and reusability of the device.

This manuscript describes the zWEDGI (zebrafish Wounding and Entrapment Device for Growth and Imaging), which is a compartmentalized device designed to orient and restrain zebrafish larvae. The design permits tail transection and long-term collection of high-resolution fluorescent microscopy images of wound healing and regeneration.

Zebra balığı larva geliştirilmiş deneysel manipülasyon için uzun vadeli canlı görüntüleme aygıtı

The zebrafish larva is an important model organism for both developmental biology and wound healing. Further, the zebrafish larva is a valuable system for ...

A Novel Tenorrhaphy Suture Technique with Tissue Engineered Collagen Graft to Repair Large Tendon Defects

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily identified and used. Currently, this gap is filled with tendon auto-, allo-, xeno-, or artificial grafts, but clinical methods to secure them are not necessarily translatable to animals because of the scale. In order to evaluate new biomaterials or study a tendon graft made up of collagen type 1, we have developed a modified suture technique to help maintain the engineered tendon in alignment with the tendon ends. Mechanical properties of these grafts are inferior to the native tendon. To incorporate engineered tendon into clinically relevant models of loaded repair, a strategy was adopted to offload the tissue engineered tendon graft and allow for the maturation and integration of the engineered tendon in vivo until a mechanically sound neo-tendon was formed. We describe this technique using incorporation of the collagen type 1 tissue engineered tendon construct.

In this paper, we present an in vitro and in situ protocol to repair a tendon gap of up to 1.5 cm by filling it with engineered collagen graft. This was performed by developing a modified suture technique to take the mechanical load until the graft matures into the host tissue.

Büyük Tendon Kusurlarını Onarmak İçin Doku Mühendisliği Kollajen Greftli Yeni Bir Tenorhaphy Dikiş Tekniği

Surgical management of large tendon defects with tendon grafts is challenging, as there are a finite number of sites where donors can be readily ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

Hücreleri tarafından seçilmiş adezyon oluşumunda görselleştirme gelişmiş Disk-toplam iç yansıma floresans mikroskobu iplik

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D Hücre Yüklü Pankreas Dokusu Yapıları Baskı için Pankreas Doku Türetilmiş Ekstrasellüler Matrix Bioink

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding these biological processes often requires long-term and repeated imaging of the same animal. Long recovery times associated with conventional immobilization methods done on agar pads have detrimental effects on animal health making it inappropriate to repeatedly image the same animal over long periods of time. This paper describes a microfluidic chip design, fabrication method, on-chip C. elegans culturing protocol, and three examples of long-term imaging to study developmental processes in individual animals. The chip, fabricated with polydimethylsiloxane and bonded on a cover glass, immobilizes animals on a glass substrate using an elastomeric membrane that is deflected using nitrogen gas. Complete immobilization of C. elegans enables robust time-lapse imaging of cellular and sub-cellular events in an anesthetic-free manner. A channel geometry with a large cross-section allows the animal to move freely within two partially sealed isolation membranes permitting growth in the channel with a continuous food supply. Using this simple chip, imaging of developmental phenomena such as neuronal process growth, vulval development, and dendritic arborization in the PVD sensory neurons, as the animal grows inside the channel, can be performed. The long-term growth and imaging chip operates with a single pressure line, no external valves, inexpensive fluidic consumables, and utilizes standard worm handling protocols that can easily be adapted by other laboratories using C. elegans.

A Simple Microfluidic Chip for Long-Term Growth and Imaging of Caenorhabditis elegans

The protocol describes a simple microfluidic chip design and microfabrication methodology used to grow C. elegans in presence of a continuous food supply for up to 36 h. The growth and imaging device also enables intermittent long-term high-resolution imaging of cellular and sub-cellular processes during development for several days.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Caenorhabditis elegans (C. elegans) have proved to be a valuable model system for studying developmental and cell biological processes. Understanding ...

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic molecular vibration, thus providing a perfect tool for in vivo study of biological processes at subcellular resolution. By integrating two-photon excited fluorescence (TPEF) imaging into the SRS microscope, the dual-modal in vivo imaging of tissues can acquire critical biochemical and biophysical information from multiple perspectives which helps understand the dynamic processes involved in cellular metabolism, immune response and tissue remodeling, etc. In this video protocol, the setup of a TPEF-SRS microscope system as well as the in vivo imaging method of the animal spinal cord is introduced. The spinal cord, as part of the central nervous system, plays a critical role in the communication between the brain and peripheral nervous system. Myelin sheath, abundant in phospholipids, surrounds and insulates the axon to permit saltatory conduction of action potentials. In vivo imaging of myelin sheaths in the spinal cord is important to study the progression of neurodegenerative diseases and spinal cord injury. The protocol also describes animal preparation and in vivo TPEF-SRS imaging methods to acquire high-resolution biological images.

In vivo Imaging of Biological Tissues with Combined Two-Photon Fluorescence and Stimulated Raman Scattering Microscopy

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy allows label-free imaging of biomolecules based on their intrinsic vibration of specific chemical bonds. In this protocol, the instrumental setup of an integrated SRS and two-photon fluorescence microscope is described to visualize cellular structures in the spinal cord of live mice.

İn vivo Kombine İki Foton Floresan ve Stimüle Raman Saçılma Mikroskobu ile Biyolojik Dokuların Görüntülenmesi

Stimulated Raman scattering (SRS) microscopy enables label-free imaging of the biological tissues in its natural microenvironment based on intrinsic ...

Highly-Multiplexed Tissue Imaging with Raman Dyes

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. Hence, highly multiplexed imaging technologies have been increasingly appreciated. Here, we describe an emerging platform of highly-multiplexed vibrational imaging of specific proteins with comparable sensitivity to standard immunofluorescence via electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes. This method circumvents the limit of spectrally-resolvable channels in conventional immunofluorescence and provides a one-shot optical approach to interrogate multiple markers in tissues with subcellular resolution. It is generally compatible with standard tissue preparations, including paraformaldehyde-fixed tissues, frozen tissues, and formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) human tissues. We envisage this platform will provide a more comprehensive picture of protein interactions of biological specimens, particularly for thick intact tissues. This protocol provides the workflow from antibody preparation to tissue sample staining, to SRS microscope assembly, to epr-SRS tissue imaging.

Electronic pre-resonance stimulated Raman scattering (epr-SRS) imaging of rainbow-like Raman dyes is a new platform for highly multiplexed epitope-based protein imaging. Here, we present a practical guide including antibody preparation, tissue sample staining, SRS microscope assembly, and epr-SRS tissue imaging.

Raman Boyaları ile Yüksek Oranda Çoklanmış Doku Görüntüleme

Visualizing a vast scope of specific biomarkers in tissues plays a vital role in exploring the intricate organizations of complex biological systems. ...