JB هو CRUK زميل السريرية، وكما هو الطالب ويلكوم ترست دكتوراه، ويتم تمويل المختبر ريال عن طريق زمالة أبحاث أول CRUK (C99667/A12918). وأيد هذا العمل من قبل اثنين من ويلكوم ترست جوائز الاستراتيجية (097945/B/11/Z و095931/Z/11/Z).

1. خلية ثقافة والعلاج <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكواشف والمعدات المدرجة في الجدول 1 إلى ثقافة عظمية الإنسان (U2OS) الخلايا. إعداد جميع الكواشف وإجراء جميع تقنيات زراعة الأنسجة في الصفحي هود تدفق الهواء لضمان العقم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحضير مستنبت على النحو التالي: إضافة 50 مل FCS، 5 مل L-الجلوتامين و 5 مل البنسلين / الستربتوميسين إلى DMEM لتحقيق تركيزات النهائي من 10٪ (FCS)، 2 مم (L-الجلوتامين)، 50 U / مل ( البنسلين) و 50 U / مل (الستربتوميسين). تدفئة مستنبت عند 37 درجة مئوية في حمام مائي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا للعلاج: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم عدة coverslips في الايثانول 70٪، والسماح للهواء الجاف ومكان واحد على الجزء السفلي من ست 3.5 سم لوحات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تزج لل coverslips في 2 مل تحسنت DMEM كاملة (37 درجة مئوية)، والضغط إلى أسفل مع ملقط ساترة للتأكد من أنها لا تزال تلتزم الجزء السفلي من الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الخلايا U2OS من عبادة أنسجتهملوحة لدى عودتهم عن طريق الغسيل مرة واحدة مع 3 مل PBS، تطبيق 4 مل تحسنت 0.05٪ التربسين EDTA-(1٪) واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 7 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خلايا resuspend في 6ML تحسنت DMEM كاملة لإبطال نشاط التربسين EDTA-والعد باستخدام عدادة الكريات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة 2 × 10 5 خلايا لكل من الطول 3.5 وحات أعدت في النقطة 1.3.1. صخرة بلطف لوحة لضمان التوزيع الخلية حتى. تسمح للخلايا على الانضمام بين عشية وضحاها قبل العلاج. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج الخلايا عن طريق وضع أربع لوحات 3.5 سم في محطة نقص الأكسجة وترك الأخريين 3.5 سم لوحات في الحاضنة عند 37 درجة مئوية في ظروف الأكسجين العادي. تكون على استعداد لبدء وضع العلامات فحص الحمض النووي الريبي في ظل ظروف المعالجة (في غرفة نقص الأكسجة نقص الأكسجين للخلايا المعالجة) 1 ساعة قبل انتهاء العلاج نقص الأكسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعرض الخلايا لنقص الأكسجين لمدة 1 ساعة 15 دقيقة، 1 ساعة و 30 دقيقة، 2 ساعة، و 24 ساعة. هذه النقاط الوقت تتسم بالمرونة ويحدد المستخدم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام normoXIC 3.5 سم لوحة باسم مراقبة إيجابية وnormoxic 3.5 سم لوحة تعامل مع أكتينوميسين D (10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) لمدة 4 ساعة كما سيطرة سلبية. أكتينوميسين D هو المانع من توليف الحمض النووي الريبي العالمية. </li></ol> يحذر: هويشت 33342 هو المغير معروفة. ومن المعروف DMSO لتسهيل دخول الجزيئات العضوية إلى الأنسجة. هيدروكسيد الصوديوم هو تآكل. حمض الهيدروكلوريك هو تآكل. بارافورمالدهيد هي سامة للغاية لجميع الحيوانات ويمكن أن يسبب الموت في البشر. تريتون X-100 يمكن أن يسبب تهيج الجلد بعد الاتصال المباشر. أكتينوميسين D هي سامة عند ملامسة الجلد أو ابتلاعها. اتخاذ الاحتياطات المناسبة عند التعامل مع جميع المواد الكيميائية الخطرة. 2 انقر فوق-IT الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الكواشف التالية المطلوبة بالإضافة إلى فحص عدة نقرة-IT: الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) درجة الحموضة 7،2-7،6، 3.7٪ بارافورمالدهيد (PFA) في برنامج تلفزيوني، 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني، والماء منزوع الأيونات (DH 2 O)، ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)، 10 M هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم)، وحمض الهيدروكلوريك 37٪ (حمض الهيدروكلوريك)؛ شرائط مؤشر الرقم الهيدروجيني - اختياري. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعد حل الطازجة PFA الأسهم قبل تنفيذ رد فعل نقرة-على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1.85 ز PFA، 3.5 مل O 2 درهم و 10 ميكرولتر of10 M هيدروكسيد الصوديوم في أنبوب فالكون 50 مل. يغلي 300 - 400 مل من H 2 O في كوب كبير في الميكروويف لجعل حمام مائي ويقف هذا في غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع فالكون 50 مل في حمام ماء وتستنهض الهمم برفق لمدة 10 دقيقة، والإفراج عن دوري الغطاء حتى يذوب PFA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> محقنة الحل PFA من خلال مرشح 0.2 ميكرون إلى 50 مل أنبوب فالكون أخرى، مما أدى إلى حل 37٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع هذه 10X بإضافة برنامج تلفزيوني وجلب الرقم الهيدروجيني إلى 6.8 بإضافة حوالي 12 ميكرولتر من حمض الهيدروكلوريك المركز. الخيار: تأكيد الرقم الهيدروجيني الصحيح مع شرائط مؤشر في غطاء الدخان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدامها على الفور أو تخزين سvernight في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الحلول الأسهم من عدة التصوير الحمض النووي الريبي على النحو التالي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 373 ميكرولتر DH 2 O إلى مكون A مما أدى إلى محلول المخزون من 100 ملم من الاتحاد الأوروبي. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 85 ميكرولتر من DMSO إلى مكون B (فلور اليكسا 594) ومزيج من قبل pipetting أو vortexing ل. تخزين سواء في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى سنة واحدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 2 مل درهم 2 O لعنصر E لإيجاد حل 10X من التصوير RNA رد فعل عدة عازلة المضافة. تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة سنة واحدة، ونبذ الحل عندما يطور اللون البني. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توسيم الخلايا مع الاتحاد الأوروبي: يعد حل العاملة 2X من الاتحاد الأوروبي من 100 ملي الأسهم أعدت في الخطوة 2.3 في prewarmed المتوسطة كاملة (37 ° C) تنفيذ ما تبقى من هذه الخطوة والخطوة 2.5 في غرفة نقص الأكسجين للخلايا تعامل مع نقص الأكسجة. . تمييع ل1X بإضافة حجم مساو من هذا الحل يعمل 2X إلى تابع وسائل الإعلامaining الخلايا. احتضان لمدة 1 ساعة تحت العلاج الظروف ثقافة الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت الخلية: يغسل كل مرة بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من 3.7٪ الأسهم PFA أعدت في الخطوة 2.2 أعلاه في ظل ظروف العلاج. احتضان لمدة 15 دقيقة في ظل ظروف العلاج. العينات تعامل مع نقص الأكسجة يمكن إزالتها من غرفة نقص الأكسجين عند هذه النقطة. إزالة تثبيتي، ويغسل مرة واحدة مع كل بئر PBS (الحرص على التخلص من النفايات بطريقة مسؤولة PFA). نفذ الخطوات التالية في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization: إزالة الحل يغسل وإضافة 1 مل من 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني إلى كل بئر. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة المخزن المؤقت permeabilization ويغسل مرة واحدة كل بئر مع برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصفت الكشف عن الحمض النووي الريبي: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 1X حل العاملة جديدة من التصوير RNA العازلة رد فعل عدة المضافة عن طريق تمييع الحل 10X (المعد في الخطوة 2.3) 1:10 في DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد عدة التصوير RNAكوكتيل رد فعل وفقا لجدول 2 للاستخدام مباشرة بعد التحضير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل يغسل وإضافة 500 ميكرولتر من الحمض النووي الريبي التصوير تفاعل عدة كوكتيل لكل عينة. احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة التصوير RNA رد فعل عدة الكوكتيل ويغسل مرة واحدة مع 1 مل من الحمض النووي الريبي التصوير تفاعل عدة العازلة شطف (المكون F)، ثم إزالة التصوير RNA رد فعل عدة العازلة الشطف. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رد فعل متعددة اختيارية: تنفيذ وضع العلامات الضد إضافية من العينات في هذه المرحلة وفقا لتوصيات الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي تلطيخ: غسل العينات مع برنامج تلفزيوني ثم إزالة الحل يغسل. تمييع هويشت 33342 (مكون G) 1:1،000 في برنامج تلفزيوني. إضافة 1 مل من المخفف هويشت 33342 إلى كل بئر واحتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، بعيدا عن الضوء. إزالة هويشت 33342 حل وغسل الخلايا مرتين مع برنامج تلفزيوني. إزالة محلول غسلن، والشروع في المجهر الضوئي. </li></ol> 3. ضوء المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل Coverslips: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 10 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة على وسط شريحة المجهر القياسية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع ساترة مع الجانب الخلية أسفل على وسط شريحة المجهر لتغطية قسامة من تصاعد المتوسطة. الحرص على تجنب توليد فقاعات في المتوسطة المتزايدة لأن هذا سوف تحجب الحصول على الصور اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عصا ساترة إلى الشريحة المجهر من خلال تطبيق طلاء الأظافر واضحة لمحيطه. السماح ليجف لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. يحفظ بعيدا عن الضوء. قد يتم تخزين العينات في -20 ° C التالية في تصاعد مستمر. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الصور: الحصول على الصور باستخدام المجهر واسعة المجال قادرة على الكشف عن مضان. يتم عرض تقريبي مضان / الإثارة القصوى لانبعاث الصبغة اليكسا فلور وهويشت 33342 منضمة إلى الحمض النووي في الجدول 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادائهام التصوير باستخدام عدسة 40X/1.30 NA الغمر النفط والتقاط الصور مع كاميرا CCD تبريده. </li></ol> 4. تحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الصور Deconvolve باستخدام برامج معالجة الصور (انظر الجدول مواد) قبل المستوردة إلى العميل أوميرو. تطبيع جعل الإعدادات لكافة الصور في نفس التجربة في المجهر التصور الصورة وتحليل البرامج من خلال تطبيق الإعدادات جعل من خلايا normoxic السيطرة على جميع الشروط الأخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المنطقة ذات الاهتمام (ROI) في أداة المجهر التصور الصورة وتحليل البرامج (انظر الجدول مواد) لتحديد نوى من كل صورة. الحصول على شدة متوسط ​​العائد على الاستثمار لكل وحساب الانحراف المتوسط ​​وموحدة لكل حالة عن طريق اختيار الخيار تحليل كثافة، بما في ذلك عدد بين 30-50 الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء المؤامرات مبعثر باستخدام البرمجيات والبيانات برسوم بيانية (انظر الجدول مواد) من خلال التآمر على كل القيم كثافة متوسط ​​الفرد الحصول عليها في الخطوة 4.2 طنس تعكس التباين بين الخلايا تحت كل شرط. بدلا من بناء الرسوم البيانية لتمثيل متوسط ​​كثافة الوسط بالإضافة إلى الانحراف المعياري من الحمض النووي الريبي الوليدة. </li></ol>

<ol>
	<li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia.">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li><li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1,+PHD2,+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor.">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li><li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+(FIH)+activity.">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li><li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+under+low+oxygen:+holding+your+breath+for+transcription.">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li><li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq.">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide-alkyne+coupling:+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry.">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+by+copper(I)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li><li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB.">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis:+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+"click+chemistry.">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li></ol>

JRS هو مؤسس جلينكو البرمجيات، وشركة، وهي شركة تجارية مقرها الولايات المتحدة المفتوحة المصدر التي تساهم في أوميرو.

وصفناها استخدامنا لعدة التصوير الحمض النووي الريبي لدراسة آثار نقص الأكسجين على توليف الحمض النووي الريبي في عظمية (U2OS) الخلايا. هذا الأسلوب هو بسيط نسبيا ويوفر بيانات حول النسخ العالمية على مستوى خلية واحدة. نحن تعديل البروتوكول التقليدي لهذه المجموعة لدمج الوسم في غرفة نقص الأكسجة. على حد علمنا هذا هو أول تقرير عن استخدام هذه التقنية لقياس التغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي في نقص الأكسجة. عدة التصوير الحمض النووي الريبي التي استخدمناها هي مناسبة للتجريب في نقص الأكسجين لأنه لا يتطلب أي نظائر مشعة ومتوافق من الناحية الفنية مع القيود المفروضة على العمل في محطة عمل الغلاف الجوي للرقابة. المشاكل المشتركة مع هذا التثبيت كفاءة تقنية القلق ووضع العلامات من العينة. فمن المهم للغاية أن PFA تستخدم لإصلاح العينة هو جديد ويتم تنفيذ الخطوات غسل أن متابعة رد فعل &#39;فوق&#39; كما هو موضح لضمان انخفاض تلوين الخلفية من العينة. إذا بackground يصبح مضان مشكلة فمن المستحسن أن يغسل مرة أخرى مع 1 مل التصوير RNA العازلة شطف رد فعل عدة بعد الخطوة 2.7.4. عدة التصوير RNA المذكورة هنا يمثل تقدما كبيرا في تكنولوجيا التصوير RNA من حيث سهولة الاستخدام والخصوصية وسرعة رد الفعل. وهذه التقنية محدودة في المقام الأول من خلال الوقت الذي يستغرقه لتسمية العينة. يتطلب عدة التصوير RNA فترة الوسم 1 ساعة يمنع فحص التغيرات السريعة في الحمض النووي الريبي العالمية التي من شأنها أن تحدث عادة في غضون هذا الإطار الزمني. ولهذا السبب يقتصر لدينا نقطة لأول مرة إلى 1 ساعة و 15 دقيقة. ويرتبط تقنية مع قليل من القيود الأخرى التي تتعلق إلى حد كبير إلى كاشف التوافق مع علامات الفلورسنت الأخرى، على سبيل المثال، هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي غير متوافق مع تلطيخ phalloidin. وتستند جميع النهج الحالي لدراسة تخليق الحمض النووي الريبي في الخلايا على إدماج النيوكليوسيدات تعديل فيالحمض النووي الريبي الوليدة وكشف عن تسميات أدرجت بوسائل مختلفة. واستند النهج الرائد على استخدام السلائف الحمض النووي الريبي المسمى بالإشعاع تليها الكشف مع تصوير الإشعاع الذاتي. أدت هذه الطريقة إلى اكتشاف مراحل دورة الخلية والنتائج الهامة الأخرى؛ ومع ذلك، فإنه لديه الكثير من العيوب مثل طبيعة مرهقة من العمل الإشعاعي، مرات التعرض الطويل والصور منخفضة الدقة من تصوير الإشعاع الذاتي 6. تقدم المقبلة في مجال استغلال وسائل كيمياء مناعية للقضاء على ضرورة النشاط الإشعاعي. وقد وصفت من قبل RNA إدماج برو تليها الكشف كيمياء مناعية. ومع ذلك، الأجسام المضادة كفاءة الربط المطلوبة تمسخ الحمض النووي لتحسين فرص الحصول على الحمض النووي الريبي أو التي تسببت في فقدان مورفولوجيا الخلايا وتلف الحواتم من العديد من البروتينات، ومنع مزيد من الكشف عنها مع الأجسام المضادة fluorescently المسمى 13. إدخال التكنولوجيا &#39;نقرة الكيمياء &quot;مبسطة الخطوة الكشف ورانه إجراء مقارنة لتصوير الإشعاع الذاتي وكيمياء مناعية. وتستند هذه التقنية على أزيد-آلكاين Huisgen إضافة حلقية رد فعل حيث آلكاين محطة من 5 ethyniluridine يتحد مع أزيد مترافق مع fluorophore في وجود النحاس (I). رد فعل غير محددة، السريع، لا يتطلب أي خطوات إضافية، ومتوافق بسهولة مع الكشف عن immunochemical من مكونات الخلية الأخرى. باستخدام هذه التكنولوجيا التصوير RNA أظهرنا أن الخلايا، في نفس السكان أحادي الطبقة، لديهم مستويات مختلفة توليف الحمض النووي الريبي في استجابة لنقص الأكسجة. نحن تقييد تجربتنا لدراسة تأثير إنتاج الحمض النووي الريبي فقط؛ ومع ذلك، فمن الممكن تماما مع هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي لأداء المعدلة، ردود فعل متعددة إضافية تسمح لإجراء تحليل أكثر تعقيدا من إنتاج الحمض النووي الريبي. على سبيل المثال، وتلطيخ الثانوية باستخدام الأجسام المضادة المحددة للعلامات من النسخ النشطة مثل مستويات الحمض النووي الريبي بوليميراز فسفرته الثاني أو حتى مكونات translaآلات نشوئها لتعطي مؤشرا لمقدار هذا الحمض النووي الريبي المنتجة حديثا أن يتم تحويلها إلى بروتين ممكنة. يمكن اختبار البروتينات إضافية، مثل أكتين، وهو البروتين الذي لا ينبغي أن تتغير بشكل ملحوظ مع نقص الأكسجة، كعنصر تحكم إضافية. علاوة على ذلك، يمكن اختبار أنواع مختلفة من الخلايا، كما أنه من المرجح جدا أن الخلايا المختلفة سوف يكون مختلفا معدلات تخليق الحمض النووي الريبي وحتى استجابات مختلفة لنقص الأكسجة. استخدام هذه المجموعة التصوير الحمض النووي الريبي واضحة تماما شريطة أن يتم تنفيذ الخطوات كما هو موضح. الخطوات الحاسمة في البروتوكول ينطوي الطلاء الخلية، تثبيت الخلية وتلطيخ والحصول على الصور. من المهم أن لوحة الخلايا في كثافة وصفها لمنع فوق أو تحت التقاء في التجريب والتي سوف تؤثر تأثيرا كبيرا على النتيجة. من المهم أيضا لاستخدام تثبيتي الطازجة، وضمان أفضل &#39;قطة&#39; من الخلية يؤخذ واتخاذ الحيطة والحذر عند غسل الخلايا بعد تلطيخ للحد من البكالورياkground إلى مستوى مقبول لتحليل كفاءة. أخيرا، وطريقة الحصول على الصور أمر في غاية الاهمية لتحقيق الصور التي هي من نوعية جيدة بما فيه الكفاية لتحليلها لاحقا. نوصي باستخدام أفضل مجهر الضوء المتاح لفحص عينات مثل بصريا كما المجهر المستخدمة في هذا البروتوكول والذي يتوفر في معظم مراكز الأبحاث المكثفة على الصعيد العالمي.

نقص الأكسجة (الأكسجين المنخفضة التوتر) ويحدث عندما يضطرب تزويد الأكسجين العادي إلى الأنسجة. الأكسجين البيئية على حد سواء والمغذيات وجزيء إشارة، وتوفير الاشارات الهامة لكثير من أنواع الخلايا. ومست التغييرات في الأكسجين البيئية من قبل مجموعة من dioxygenases التي تتحكم في نشاط عائلة عامل النسخ الأساسية المعروفة باسم عوامل محرض نقص الأكسجة (HIFs). وتتألف من اثنين من مفارز HIFs، α β و. هناك ثلاثة الإسوية معروفة من مؤسسة الحرمين، α (1، 2، و 3) والمتغيرات لصق متعددة من مؤسسة الحرمين، 1β. يتم التعبير عن مؤسسة الحرمين، 1β جوهري والتي لا تنظمها مستويات الاوكسجين البيئية 1. ويتم تنظيم أفراد الأسرة مؤسسة الحرمين، α بشكل حيوي بواسطة فئة من prolyl-hydroxylases (الدكتوراه) وعامل تثبيط مؤسسة الحرمين (FIH)؛ وكلاهما يتطلب الأكسجين باعتبارها عامل مساعد لتحفيز الهيدروكسيل من مؤسسة الحرمين، α 2،3. في normoxia والهيدروكسيلية أعضاء الأسرة مؤسسة الحرمين α والمعلمة لproteosomتدهور آل من E3-يغاز، فون هيبل لينداو (VHL). في نقص الأكسجة والدكتوراه وFIH غير نشطة أو لديهم انخفاض النشاط. تصبح الأشكال الإسوية-α استقرت مؤسسة الحرمين، تشكيل مغاير مع مؤسسة الحرمين، 1β، وتؤثر على نسخ من الجينات التي توفر استجابة الخلايا للبيئة ميتة (الشكل 1A) 4. التقنيات الحالية لتحليل الحمض النووي الريبي التركيز على القياس الكمي للقيم المتوسط ​​عبر السكان خلية معينة. خلايا الاستجابة لحافز نقص الأوكسجين قبل بدء النسخ من عدد لا يحصى من الجينات التي تسمح لهم للتكيف مع بيئة معادية لهم 5. ومع ذلك، في كثير من الأحيان نقص الأكسجين كما هو معمول به التدرج، وخلايا في بيئة ميتة لا تخضع لحافز نقص الأوكسجين موحدة. نحن تصف تنفيذ مجموعات التصوير RNA نقرة-IT في محطة الأكسجين للرقابة لفحص الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة. يستخدم عدة التصوير الحمض النووي الريبي للنوكليوزيد lkyne تعديل، 5-إيثينيل يوريدين (الاتحاد الأوروبي) وربط chemoselective لتمكين الكشف عن الحمض النووي الريبي التوليف العالمي زمنيا ومكانيا في الخلايا والأنسجة 6. لفترة وجيزة، ويتم التعامل مع الخلايا نقص الأكسجة والمثقف في وجود الاتحاد الأوروبي. ثم تم إصلاحها وأنها permeabilized ويتم الكشف عن إدماج الاتحاد الأوروبي في الحمض النووي الريبي الوليدة عن طريق ربط chemoselective من الاتحاد الأوروبي مع أزيد التي تحتوي على الصبغة. ويرد سير العمل النموذجية لهذا التفاعل في الشكل 1B. استخدمنا عدة التصوير الحمض النووي الريبي لفحص الحمض النووي الريبي التوليف على مستوى خلية واحدة التي نتجت عن المعاملة مع نقص الأكسجة. صغر حجم العلامة آلكاين يتيح إدماج الفعال للنوكليوزيد تعديل في الحمض النووي الريبي على وجه التحديد. وربط chemoselective أو رد فعل &#39;فوق&#39; هو ذات كفاءة عالية وسريعة ومحددة 7-10. كافة المكونات هي رد فعل bioinert ويتطلب رد فعل لا درجات الحرارة القصوى أو المذيبات. ينفي رد فعل نقرةشرط radiolabelling التقليدية ويسمح التصور المباشر للنتائج منذ الإخراج هو الضوء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن للجزيء كشف اختراق بسهولة عينات معقدة مما يسمح للتحليل المتعدد بما في ذلك الأجسام المضادة للكشف عن البروتينات الحمض النووي الريبي التفاعلية. هذا الاختبار الحمض النووي الريبي التصوير متوافق مع الأصباغ العضوية بما في ذلك اليكسا فلور وفلوريسئين (FITC). قمنا بقياس التغير في تخليق الحمض النووي الريبي بعد العلاج من خلايانا باستخدام تنفيذ بيئة مفتوحة المجهري للكائنات عن بعد (أوميرو). أوميرو هو برنامج مفتوح المصدر، متاح على <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . هذا المجهر التصور الصورة وتحليل البرمجيات تمكن من الوصول إلى واستخدام مجموعة واسعة من البيانات البيولوجية، بما في ذلك إدارة متعددة الأبعاد، قواعد البيانات غير المتجانسة. تطبيق العميل يسمح التصور عن بعد وتحليل البيانات البيولوجية المعقدة الصورة 11؛نحن استخدامه لقياس التغيرات البصرية في توليف الحمض النووي الريبي الخلية العالمية واحدة. وتظهر هذه البيانات والخطوات المطلوبة لتحليل الحمض النووي الريبي لدينا تجربة التصوير باستخدام هذا المجهر التصور الصورة وبرامج التحليل أدناه. ونحن ننظر في تغيرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية التالية علاج عظمية الإنسان (U2OS) الخلايا مع نقص الأكسجين لمدة تصل إلى 24 ساعة. في جميع الظروف، ونحن الكشف عن الاختلاف الخلية الى خلية في مستوى إنتاج الحمض النووي الريبي. لم أوقات قصيرة من التعرض نقص الأكسجة لا تؤدي إلى تغييرات كبيرة على مستوى الحمض النووي الريبي في الخلايا الوليدة. ومع ذلك، أدى التعرض إلى 24 ساعة من نقص الأكسجة إلى زيادة كبيرة في كمية من الحمض النووي الريبي التي تنتج في الخلايا. يتم قياس معظم الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة التالي فترات طويلة من التعرض، مثل 4-24 ساعة. ومع ذلك، يتم وضع بعض الآليات في مكانها في وقت سابق من ذلك بكثير، على سبيل المثال؛ يحدث تفعيل NF كيلوبايت في غضون 5-15 دقيقة من التعرض نقص الأكسجة 12. التحقيق أقصر فراش لا تسببوبالتالي هناك ما يبرر مرات التعرض شيا ويمكن أن ينتقص من استجابات أكثر تعقيدا مثل دورة الخلية وموت الخلايا المبرمج.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

وتشارك نقص الأكسجة أو خفض توافر الأكسجين في العديد من العمليات الفسيولوجية والمرضية. على المستوى الجزيئي، خلايا بدء برنامج النسخي خاصة من أجل جبل استجابة الخلوية مناسبة ومنسقة. الخلية تمتلك العديد من الانزيمات مستشعر الاوكسجين التي تتطلب الأكسجين الجزيئي كما العامل المساعد لنشاطها. هذه مجموعة من prolyl-hydroxylases لdemethylases هيستون. وتستند غالبية الدراسات تحليل الاستجابات الخلوية لنقص الأكسجة الخلوية على السكان ومتوسط ​​الدراسات، وعلى هذا النحو تحليل خلية واحدة من خلايا ميتة ونادرا ما يؤديها. نحن هنا تصف طريقة لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية على مستوى خلية واحدة في نقص الأكسجة باستخدام نقرة-IT مجموعات التصوير الحمض النووي الريبي في محطة الأكسجين للرقابة، يليه التحليل المجهري والكمي. باستخدام الخلايا السرطانية تتعرض لنقص الأكسجين لفترات مختلفة من الزمن، هو المسمى الحمض النووي الريبي ويقاس في كل خلية. يسمح هذا التحليلتصور والخلية الى خلية التغيرات الزمنية في توليف الحمض النووي الريبي العالمية عقب التوتر ميتة.

ويرد التخطيطي للتفاعل عدة التصوير الحمض النووي الريبي في الشكل 1B. استخدمنا هذا التفاعل لتحديد كميا توليف الحمض النووي الريبي مجموع في الخلايا U2OS بعد العلاج مع نقص الأكسجين على كل فرد (وحيد الخلية) والمستوى العالمي (السكان من الخلايا). تم علاج الخلايا مع نقص الأكسجة والمثقف في وجود الاتحاد الأوروبي. كانوا ثم الثابتة وpermeabilized وتم الكشف من قبل الاتحاد الأوروبي إدراج ربط chemoselective من الاتحاد الأوروبي مع أزيد التي تحتوي على الصبغة. هذا &#39;فوق&#39; نتائج التفاعل في الانبعاثات مضان التي يمكن أن يتم الكشف عن وكميا باستخدام ضوء مضان المجهري. ويبين الشكل 2A نتيجة نموذجية من هذه التجربة. وpseudocolored خلايا fluorescently المسمى الأحمر وتم فتح الصورة في بيئة مفتوحة المجهري للكائنات عن بعد (أوميرو). هذا التصور صورة المجهر وتحليل البرمجيات لديها المدمج في أداة العائد على الاستثمار التي يمكن استخدامها لتحديد البنى الفردية شبه الخلويةتوريس وكميا تحليل كثافة الصورة داخل المنطقة المختارة. والمثال النموذجي لإخراج البيانات التالية استخدام هذه الأداة في البرنامج العميل يمكن أن ينظر إليه في الشكل 2B؛ وتظهر شدة الخلايا الفردية جنبا إلى جنب مع صورة ممثل من التجربة التي هي بمثابة الاختيار البصرية لضمان صحة البيانات. يمكن رسم الفرد كثافة مضان الخلية كما مخطط مبعثر لإظهار توزيع شدة الخلوية الفردية ضمن السكان خلية المعالجة. وينظر مثال على هذا النوع من الرسم البياني في الشكل 2C. التآمر البيانات كثافة بهذه الطريقة مفيد لأنه يسمح مقارنة نتائج العلاج السريع للويدل على عدم تجانس كبير بين السكان خلية العلاج الذي يتم حجب إلا باستخدام تمثيل البيانات القياسية بشكل واضح. عدم تجانس استجابة المثير للاهتمام في هذه التجربة أنه على الرغم من التحفيز ميتة موحدة كانpplied إلى الخلايا، فمن الواضح أن كل خلية من نفس السكان أحادي الطبقة يستجيب بشكل مختلف لهذه الحوافز. الرقم 2D يصور النتيجة الاجمالية من تجربتنا. وبلغ متوسط ​​كثافة مضان من جميع الخلايا داخل السكان العلاج ثم المرسومة في هذا الشريط المخطط. وقد استخدم اختبار t للطالب لحساب احتمال الإحصائية من كل مجموعة العلاج المختلفة كثيرا عن السيطرة. ومن المثير للاهتمام، وتظهر هذه البيانات أن هناك زيادة ذات دلالة إحصائية في تخليق الحمض النووي الريبي العالمية مع مرور الوقت عندما يتم التعامل مع الخلايا U2OS نقص الأكسجة (في بعض الأحيان أكبر من 1 ساعة 30 دقيقة * ع &lt;0.01؛. ** ع &lt;0.05 و*** ع &lt;0.001 و n&gt; 30). هذه البيانات تظهر أنه في أعقاب فترات أطول من العلاج نقص الأكسجة، الخلية يركز جهوده على إنتاج الحمض النووي الريبي حتى في هذه البيئة المعادية ميتة. أكتينوميسين D العلاج ablates تماما كثافة مضان كما هو متوقع.<img alt="الشكل 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> الشكل 1. يستجيب النظام ألف مؤسسة الحرمين للتغيرات في الأكسجين الخلوية. في هذا نقص الأكسجة التخطيطي مبسطة تستقر مؤسسة الحرمين مغاير عن طريق منع-α مؤسسة الحرمين الهيدروكسيل (OH-) عن طريق الانزيمات prolyl هيدروكسيلاز (الدكتوراه) وpolyubquitination لاحقا من قبل فون هيبل لينداو، البروتين (VHL). النتائج استقرار مؤسسة الحرمين في تفعيل الجينات لا تعد ولا تحصى التي تساعد على الاستجابة لنقص الأكسجة الخلوية الخلية يمكن الكشف عن الحمض النووي الريبي B. التوليف باستخدام مقايسة نقرة-IT؛ وصفت الخلايا مع الاتحاد الأوروبي بعد العلاج رد الفعل اضغط بالكشف عن الحمض النووي الريبي التوليف التي يمكن قياسها كميا بواسطة كثافة مضان والمجهر الضوئي. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض أكبر قيود التصدير الطوعية</a>ايون من هذا الرقم. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> الشكل 2. A. قطة من أوميرو لاظهار الناتج المجهرية النموذجية التالية وضع العلامات الحمض النووي الريبي. هذا المجهر التصور الصورة وتحليل البرمجيات يمكن استخراج البيانات بسرعة وكثافة على مستوى الخلايا الفردية باستخدام ماكرو في ROI يحمل في ثناياه عوامل. وأظهرت لقطة من الإخراج من هذا الأمر في B. العالمية الحمض النووي الريبي التوليف يمكن الاستدلال على ذلك من كثافة الخلايا الفردية، ومجموعة من وهو ما يمكن ملاحظته في مؤامرة مبعثر C. A التمثيل الرسمي لهذه البيانات المجمعة يمكن أن ينظر D. * ع &lt;0.01؛ ** ع &lt;0.05 و*** ع &lt;0.001 و n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">اضغط هنا لمشاهدة صورة أكبر.</a> <tablالبريد الحدود = &quot;0&quot; بطانة الخلايا = &quot;0&quot; هوامش الخلية = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> الكواشف الثقافة الخلية </td></tr><tr><td> الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) درجة الحموضة 7،2-7،6 </td></tr><tr><td> النسور Dulbecco ومتوسطة التعديل (DMEM) </td></tr><tr><td> الجنين مصل العجل (FCS) تصفية تعقيمها </td></tr><tr><td> البنسلين / الستربتوميسين </td></tr><tr><td> L-الجلوتامين </td></tr><tr><td> 0.05٪ التربسين EDTA-(1٪) </td></tr><tr><td> 70٪ من الإيثانول </td></tr><tr><td> أكتينوميسين D (1 ميكروغرام / ميكرولتر الأسهم) </td></tr><tr><td> خلية معدات الثقافة </td></tr><tr><td> معقمة باستور الماصات </td></tr><tr><td> وهناك مجموعة من المعالجة ثقافة الخلية البلاستيكية مناسبة لصيانة ومعالجة الخلايا في الثقافة </td></tr><tr><td> حمام مائي وضعت في 37 ° C </td></tr><tr><td> الصفحي هود تدفق الهواء </td></tr><tr><td> وضعت في الحاضنة 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2 </td></tr><tr><td> تعيين نقص الأكسجة محطة العمل عند 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 1٪ O 2 </td></tr><tr><td> coverslips الزجاج </td></tr><tr><td> ملقط الدقة </td></tr><tr><td> عدادة الكريات </td></tr></tbody></table> الجدول 1. الكواشف والمعدات اللازمة لزراعة الخلايا U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> مكونات التفاعل </td><td colspan="6"> عدد Coverslips </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> انقر-IT العازلة رد فعل الحمض النووي الريبي (المكون C) </td><td> 428 ميكرولتر </td><td> 856 ميكرولتر </td><td> 1.7 مل </td><td> 2.1 مل </td><td> 2.58 مل </td><td> 4.3 مل </td></tr><tr><td> كبريتات النحاس 4 (مكون D) </td><td> 20 ميكرولتر </td><td> 40 ميكرولتر </td><td> 80 ميكرولتر </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 120 ميكرولتر </td><td> 200 ميكرولتر </td></tr><tr><td> اليكسا فلور أزيد (المعد في الخطوة 2.3) </td><td> 1.8 ميكرولتر </td><td> 3.7 ميكرولتر </td><td> 7.4 ميكرولتر </td><td> 9.3 ميكرولتر </td><td> 11.28 ميكرولتر </td><td> 18.8 ميكرولتر </td></tr><tr><td> انقر-IT رد فعل العازلة المضافة (المعد في الخطوة 2.3) </td><td> 50 ميكرولتر </td><td> 100 ميكرولتر </td><td> 200 ميكرولتر </td><td> 250 ميكرولتر </td><td> 300 ميكرولتر </td><td> 500 ميكرولتر </td></tr><tr><td> تقريبي إجمالي حجم التداول </td><td> 500 ميكرولتر </td><td> 1 مل </td><td> 2 مل </td><td> 2.5 مل </td><td> 1.5 مل </td><td> 5 مل </td></tr></tbody></table> . الجدول 2 التصوير RNA الكوكتيلات رد فعل عدة: مرجع الجدول بالتفصيل نسبة مكونات مزيج الرئيسي لتفاعل عدة التصوير الحمض النووي الريبي وفقا لعدد من coverslips لتكون ملطخة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Fluorophore </td><td> الإثارة (نانومتر) </td><td> الانبعاثات (نانومتر) </td></tr><tr><td> فلور اليكسا 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> هويشت 33342، منضما إلى الحمض النووي </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . الجدول 3 الإسفار / الإثارة ماكسيما الانبعاثات: التقريبي مضان / الإثارة القصوى لانبعاث اليكسا فلور صبغة وهويشت 33342 منضمة إلى الحمض النووي.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia at JoVE.com

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

نحن تصف تقنية لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية في نقص الأكسجة باستخدام التصوير. لم يسبق إجراء انقر الكيمياء وضع العلامات من الحمض النووي الريبي في ظل نقص الأكسجين ويسمح التصور من التغييرات RNA العالمية على مستوى خلية واحدة. هذا النهج يكمل تقنيات الحمض النووي الريبي متوسط ​​الموجودة، مما يتيح رؤية مباشرة من خلية الى خلية تغييرات في تركيب الحمض النووي الريبي العالمية.

تحليل الحمض النووي الريبي العالمي التجميعي على مستوى خلية واحدة نقص الأكسجة التالي

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Dundee, UK.  نحن تصف تقنية لتحليل الحمض النووي الريبي التوليف العالمية في نقص الأكسجة باستخدام التصوير. لم يسبق إجراء انقر الكيمياء وضع العلامات من الحمض النووي الريبي في ظل نقص الأكسجين ويسمح التصور من التغييرات RNA العالمية على مستوى خلية واحدة. هذا ا...

Video: Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

طريقة لقياس حركية الانصهار الفيروسي على مستوى الجسيمات واحدة

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

التحليل المباشر للخلايا واحدة بواسطة الطيف الكتلي في الضغط الجوي

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

تحليل النسخ الجيني وحيدة الخلية التي كتبها نيون RNA<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

دراسة التحلل البروتيني B من السيكلين على مستوى خلية واحدة في الجامعة السكان الخلية

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

قياس مستويات هيم في تخليق خلايا الثدييات

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

تحديد العوامل الرئيسية تنظيم-تجديد الذات والتمايز في الخلايا المكونة للدم EML السلائف بواسطة تحليل الحمض النووي الريبي التسلسل

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

تحليل الخط-1 Retrotransposition في واحدة نواة مستوى

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

تحليل وظيفة خلايا بيتا باستخدام تصوير الكالسيوم القرار خلية واحدة في الجزيرات الزرد

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

تصور التفاعل بين المسمى قدوت البروتين والحمض النووي λ سيتيسبيسيفيكالي تم التعديل على مستوى جزيء واحد

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...