JB es un miembro clínico CRUK, AS es un estudiante de doctorado Wellcome Trust, el laboratorio de SR es financiado por una Beca de Investigación Superior CRUK (C99667/A12918). Este trabajo fue apoyado por dos premios Strategic Wellcome Trust (097945/B/11/Z y 095931/Z/11/Z).

1. Cultivos Celulares y Tratamiento <ol><li> Reúna los reactivos y equipos que figuran en la Tabla 1 para las células (U2OS osteosarcoma) la cultura humana. Preparar todos los reactivos y llevar a cabo todas las técnicas de cultivo de tejidos en la campana de flujo laminar de aire para asegurar la esterilidad </li><li> Preparar el medio de cultivo como sigue: Añadir 50 ml de FCS, 5 ml L-glutamina y 5 ml de penicilina / estreptomicina al DMEM para lograr concentraciones finales de 10% (FCS), 2 mM (L-glutamina), 50 U / ml ( la penicilina) y 50 U / ml (estreptomicina). Calentar el medio de cultivo a 37 ° C en un baño de agua. </li><li> Preparar las células para el tratamiento de: <ol><li> Esterilizar varios cubreobjetos en etanol al 70%, dejar secar al aire y colocar uno en la parte inferior de seis 3,5 cm placas. </li><li> Sumergir el cubreobjetos en 2 ml de DMEM completo se calentaron (37 ° C), presionando hacia abajo con los fórceps cubreobjetos para asegurarse de que permanecen adheridos a la parte inferior de los pozos. </li><li> Separe las células U2OS de su culto tejidoUre placa por lavado una vez con 3 ml de PBS, la aplicación de 4 ml se calentó 0,05% de tripsina-EDTA (1%) e incubando a 37 º C durante 7 min. </li><li> Resuspender las células en 6 ml calentado DMEM completo para inactivar la tripsina-EDTA y contar utilizando un hemocitómetro. </li><li> Plate 2 x 10 5 células a cada uno de los 3,5 cm platos preparados en el punto 1.3.1. Agite suavemente la placa para asegurar una distribución celular, incluso. Permitir que las células se adhieran durante la noche antes del tratamiento. </li></ol></li><li> Tratar las células mediante la colocación de cuatro placas de 3,5 cm en la estación de trabajo hipoxia y dejar los otros dos 3,5 cm placas en la incubadora a 37 ° C en condiciones normales de oxígeno. Esté listo para comenzar el ensayo de ARN etiquetado en condiciones tratadas (en la cámara de hipoxia para las células tratadas hipoxia) 1 hora antes de que termine el tratamiento de hipoxia. </li><li> Exponer las células a la hipoxia durante 1 h 15 min, 1 h 30 min, 2 h, y 24 h. Estos momentos son flexibles y determinada por el usuario. </li><li> Utilice un normoxic 3,5 cm placa como control positivo y un 3,5 cm placa normóxico tratados con actinomicina D (/ ml concentración final de 10 mg) durante 4 horas como control negativo. Actinomicina D es un inhibidor de la síntesis de ARN mundial. </li></ol> Precauciones: Hoechst 33342 es un mutágeno conocido. DMSO es conocido para facilitar la entrada de moléculas orgánicas en los tejidos. NaOH es corrosivo. HCl es corrosivo. El paraformaldehido es altamente tóxico para los animales y puede causar la muerte en los seres humanos. Triton X-100 puede causar irritación de la piel por contacto directo. Actinomicina D es tóxico cuando está en contacto con la piel o por ingestión. Tome las debidas precauciones al manejar todos los productos químicos peligrosos. 2. Haga clic-iT Ensayo <ol><li> Reúna los siguientes reactivos que se requieren, además del kit de ensayo de Click-iT: tampón fosfato salino (PBS) de pH 7.2 a 7.6, 3.7% de paraformaldehído (PFA) en PBS, 1% Tritón X-100 En PBS, agua desionizada (dH2O), dimetil sulfóxido (DMSO), 10 M de hidróxido de sodio (NaOH), y ácido clorhídrico al 37% (HCl); Tiras indicadoras de pH - Opcional. </li><li> Prepare una solución fresca stock PFA antes de realizar la reacción de Click-iT de la siguiente manera: <ol><li> Poner 1,85 g PFA, 3,5 ml dH 2 O y 10 l de10 M NaOH en un tubo Falcon de 50 ml. Hervir 300-400 ml de H2O en un gran vaso de precipitados en el microondas para hacer un baño de agua y soportar esto en una campana de humos. </li><li> Coloque el Falcon de 50 ml en el baño de agua y agitar suavemente durante 10 minutos, liberando periódicamente la tapa hasta que el PFA se ha disuelto. </li><li> La jeringa la solución de PFA a través de un filtro de 0,2 micras en otro tubo Falcon de 50 ml, resultando en una solución al 37%. </li><li> Diluir esta 10x añadiendo PBS y llevar el pH a 6,8 mediante la adición de aproximadamente 12 l de HCl concentrado. Opción: Confirmar el pH correcto con las tiras indicadoras en la campana de humos. </li><li> Utilizar inmediatamente o almacenar overnight a 4 ° C. </li></ol></li><li> Preparar las soluciones madre de el kit de imagen de ARN de la siguiente manera: <ol><li> Añadir 373 l dH 2 O para el componente A que resulta en una solución madre de 100 mM de la UE. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de un mes. </li><li> Añadir 85 l de DMSO al componente B (Alexa Fluor 594) y mezclar mediante pipeteo o vórtex. Guarde tanto a -20 ° C durante un máximo de un año. </li><li> Añadir 2 ml de dH2O para el componente E para crear una solución de 10 veces del aditivo tampón de reacción kit de imagen de ARN. Almacenar a -20 ° C durante un máximo de un año, cuando deseche la solución se torna de color marrón. </li></ol></li><li> Etiquetado de las células con la UE: Prepare una solución de trabajo de 2X de la UE de la madre 100 mM preparada en la etapa 2.3 en medio completo precalentado (37 ° C) Realizar el resto de este paso y paso de 2.5 en la cámara de hipoxia de las células tratadas con la hipoxia. . Diluir a 1X mediante la adición de un volumen igual de esta solución de trabajo 2X a la CONT mediosaining células. Incubar durante 1 h bajo tratamiento de condiciones de cultivo celular. </li><li> La fijación de la célula: Lavar cada pocillo una vez con PBS y añadir 1 ml de la PFA de stock 3,7% preparados en la etapa 2.2 en condiciones de tratamiento. Incubar durante 15 min bajo condiciones de tratamiento. Las muestras tratadas con la hipoxia pueden ser removidos de la cámara de la hipoxia en este punto. Quite el fijador y lavar cada pocillo una vez con PBS (Tenga cuidado de eliminar los residuos de forma responsable PFA). Lleve a cabo los siguientes pasos a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilización: Retire la solución de lavado y añadir 1 ml de 1% de Triton X-100 en PBS a cada pocillo. Incubar durante 15 min a temperatura ambiente. Retire la permeabilización de amortiguación y lavarla una vez con PBS. </li><li> Detección de ARN marcado: <ol><li> Preparar una solución de trabajo 1X fresca de aditivo tampón de reacción kit de imagen de ARN mediante la dilución de la solución 10 veces (preparado en el paso 2.3) 01:10 en dH 2 O. </li><li> Prepare el kit de imagen RNAcóctel de reacción de acuerdo con la Tabla 2 para su uso inmediatamente después de su preparación. </li><li> Quitar la solución de lavado y añadir 500 l de cóctel de formación de imágenes ARN kit de reacción para cada muestra. Incubar durante 30 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. </li><li> Retire la imagen RNA cóctel reacción kit y lavar una vez con 1 ml de tampón de lavado de imagen de ARN reacción kit (componente F), a continuación, eliminar el tampón de enjuague reacción RNA kit de imagen. </li></ol></li><li> Reacción múltiplex Opcional: Realice etiquetado anticuerpo adicional de las muestras en este punto de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. </li><li> ADN de tinción: Lávese las muestras con PBS y luego eliminar la solución de lavado. Diluir el Hoechst 33342 (componente G) 1:1000 en PBS. Añadir 1 ml de Hoechst 33342 diluido a cada pocillo y se incuba durante 15 minutos a temperatura ambiente, protegido de la luz. Eliminar la solución de Hoechst 33342 y se lavan las células dos veces con PBS. Retire la soluci lavadon y proceder a la microscopía de luz. </li></ol> 3. Microscopía de Luz <ol><li> Mount Cubreobjetos: <ol><li> Coloque 10 l de medio de montaje en el centro de un portaobjetos de microscopio estándar. </li><li> Coloque el cubreobjetos con la célula hacia abajo en el centro de la platina de microscopio para cubrir la parte alícuota de medio de montaje. Tenga cuidado de evitar la generación de burbujas en el medio de montaje, ya que ocultará la adquisición de imagen posterior. </li><li> Pegue el cubreobjetos al portaobjetos mediante la aplicación de barniz de uñas transparente a su perímetro. Deje que se seque durante 5 minutos a temperatura ambiente. Proteger de la luz. Las muestras pueden ser almacenadas a -20 ° C después de montaje. </li></ol></li><li> La adquisición de imágenes: Adquirir imágenes utilizando un microscopio de campo amplio capaz de detección de fluorescencia. Aproximado de fluorescencia / de excitación máximo de emisión para el colorante Alexa Fluor y Hoechst 33342 unido al ADN se muestran en la Tabla 3. </li><li> Perform Imaging utilizando una lente de inmersión en aceite 40X/1.30 NA y capturar imágenes con una cámara CCD enfriado. </li></ol> 4. Análisis de Datos <ol><li> Imágenes deconvoluir utilizando el software de procesamiento de imágenes (ver la tabla de Materiales) antes de importar al cliente OMERO. Normalizar la prestación de los ajustes para todas las imágenes en el mismo experimento en el software de microscopio de imagen de visualización y análisis mediante la aplicación de los ajustes de renderizado de células normoxic control para todas las demás condiciones. </li><li> Utilice la región de interés (ROI) en la herramienta de software de microscopio de imagen de visualización y análisis (véase la tabla de Materiales) para seleccionar los núcleos de cada imagen. Obtener intensidades medias para cada ROI y calcular el promedio y la desviación estándar para cada condición por la elección de la opción de análisis de intensidad, incluyendo un número de entre 30 a 50 células. </li><li> Construir diagramas de dispersión usando un software de gráficos de datos (véase el cuadro Materiales) por el trazado de todos los valores de intensidad media individual obtenida en el paso 4.2 to reflejar la variabilidad entre las células en cada condición. Alternativamente construir gráficos de barras para representar la intensidad media media más desviación estándar de ARN naciente. </li></ol>

<ol>
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JRS es Fundador de Glencoe Software, Inc., una empresa comercial con sede en EE.UU. de código abierto que contribuye a OMERO.

Hemos descrito el uso de un kit de imagen de ARN para examinar los efectos de la hipoxia en la síntesis de ARN en células U2OS (osteosarcoma). Esta técnica es relativamente sencillo y proporciona datos acerca de la transcripción global a un nivel de células individuales. Hemos modificado el protocolo convencional para este kit para incorporar el etiquetado en una cámara de hipoxia. Para nuestro conocimiento, este es el primer informe del uso de esta técnica para medir los cambios en la síntesis de ARN en la hipoxia. El kit de imagen RNA se utilizó es adecuado para la experimentación en la hipoxia, ya que no requiere de isótopos radiactivos y es técnicamente compatibles con las limitaciones de trabajar en una estación de trabajo de atmósfera controlada. Problemas comunes con esta técnica preocupación fijación y el etiquetado de la muestra eficiente. Es extremadamente importante que la PFA utiliza para fijar la muestra es fresca y las etapas de lavado que siguen la reacción &quot;clic&quot; se realizó como se describió para asegurar bajo la tinción de fondo de la muestra. Si background fluorescencia se convierte en un problema, se recomienda lavar una vez más con las imágenes de ARN 1 ml de tampón de lavado reacción kit después de la etapa 2.7.4. El kit de imagen ARN mencionado aquí representa un avance significativo en la tecnología de imágenes de ARN en términos de facilidad de uso y especificidad y la velocidad de reacción. Esta técnica está limitada principalmente por el tiempo que toma para etiquetar la muestra. El kit de imagen ARN requiere de un período de marcado 1 hr que impide el examen de los rápidos cambios en el ARN mundial que suele ocurrir dentro de este plazo. Es por esta razón nuestro punto primera vez que se limita a 1 h y 15 min. La técnica está asociado con algunas otras limitaciones que se relacionan en gran medida el agente reactivo, la compatibilidad con otros marcadores fluorescentes, por ejemplo, este kit de imagen de ARN no es compatible con tinción faloidina. Todos los enfoques existentes de estudio de la síntesis de ARN en las células se basan en la incorporación de nucleósidos modificados en laARN naciente y la detección de etiquetas incorporadas por diferentes medios. El enfoque innovador se basa en el uso de precursores de ARN marcadas radiactivamente seguido por la detección con autorradiografía. Este método dio lugar a un descubrimiento de las fases del ciclo celular y otros hallazgos importantes; sin embargo, tiene una gran cantidad de inconvenientes tales como la lentitud de los trabajos radiactividad, largos tiempos de exposición y las imágenes de baja resolución de autorradiografía 6. El siguiente avance en el campo explotado medio de inmunoquímica para eliminar la necesidad de radiactividad. ARN se marcó mediante la incorporación de BrU seguido de la detección inmunoquímica. Sin embargo, el anticuerpo unión eficiente requiere la desnaturalización de ácido nucleico para mejorar el acceso a ADN o ARN que causó la pérdida de la morfología celular y daña los epítopos de muchas proteínas, la prevención de su aún más la detección con anticuerpos marcados con fluorescencia 13. La introducción de la tecnología &quot;click química &#39;simplifica la etapa de detección y tl procedimiento en comparación con autorradiografía e inmunoquímica. La tecnología se basa en azida-alquino reacción de cicloadición de Huisgen donde alquino terminal de 5-ethyniluridine se une con azida conjugado con el fluoróforo en presencia de Cu (I). La reacción es específica, rápida, no requiere ningún paso adicional, y es fácilmente compatible con la detección inmunoquímica de otros constituyentes celulares. Utilizando esta tecnología de formación de imágenes de ARN que mostraron que las células, en la misma población monocapa, tienen diferentes niveles de la síntesis de ARN en respuesta a la hipoxia. Hemos restringido nuestro experimento para examinar el efecto de la única producción de ARN; Sin embargo, es totalmente posible con este kit de imagen de ARN para realizar modificados, reacciones múltiplex adicionales que permiten un análisis más complejo de la producción de ARN. Por ejemplo, la tinción secundaria usando un anticuerpo específico para los marcadores de la transcripción activa tales como los niveles de fosforilados ARN polimerasa II o incluso componentes de la tramaquinaria ción para dar una indicación de la cantidad de este ARN recién producido que se convierte en proteína son posibles. Proteínas adicionales, tales como actina, una proteína que no debe cambiar significativamente con la hipoxia, podrían probarse como un control adicional. Además, diferentes tipos de células podrían ser probados, ya que es muy probable que diferentes células tienen diferentes tasas de síntesis de ARN e incluso respuestas diferentes a la hipoxia. El uso de este kit de imagen de ARN es bastante sencillo siempre que los pasos se realizaron como se describe. Los pasos críticos en el protocolo implican chapado celular, la fijación de células y la tinción y la adquisición de imágenes. Es importante a la placa las células a la densidad descrito para prevenir la sobre o debajo de confluencia en la experimentación que afectará de manera significativa el resultado. También es importante usar fijador fresco, lo que garantiza el mejor &quot;instantánea&quot; de la celda se toma y tener cuidado al lavado de las células después de la tinción de reducir la tasa de alcoholemiakground a un nivel que es aceptable para el análisis eficiente. Por último, el método de adquisición de la imagen es de vital importancia para lograr imágenes que son de una buena calidad suficiente para su posterior análisis. Le recomendamos que utilice el mejor microscopio de luz disponible para examinar muestras ópticamente como el microscopio usado en este protocolo que está disponible en la mayoría de los centros de investigación intensiva a nivel mundial.

La hipoxia (bajas tensiones de oxígeno) ocurre cuando se altera el normal abastecimiento de oxígeno a un tejido. Oxígeno ambiental es tanto un nutriente y una molécula de señalización, proporcionando señales importantes para muchos tipos de células. Los cambios en oxígeno del medio ambiente son detectadas por un grupo de dioxigenasas que controlan la actividad de una familia de factores de transcripción esencial conocido como los factores inducibles por hipoxia (HIF). Los HIF están compuestos de dos subunidades, α y β. Hay tres isoformas conocidas de HIF-α (1, 2, y 3) y múltiples variantes de empalme de HIF-1β. HIF-1β se expresa constitutivamente y no regulada por los niveles de oxígeno del medio ambiente 1. Los miembros de la familia HIF-α se regulan dinámicamente por una clase de prolil-hidroxilasas (doctores) y el factor de inhibición de HIF (FIH); ambos de los cuales requieren oxígeno como un co-factor para catalizar la hidroxilación de HIF-α 2,3. En normoxia los miembros de la familia HIF-α son hidroxilados y etiquetados para proteosomAl degradación por la E3-ligasa, de von Hippel Lindau (VHL). En la hipoxia los doctores y FIH son inactivos o tienen una actividad reducida. Las isoformas HIF-α se estabilizan, forman un heterodímero con HIF-1β, y efectuar la transcripción de genes que proporcionan la respuesta celular al entorno hipóxico (Figura 1A) 4. Las técnicas actuales para el análisis de ARN se centran en la cuantificación de los valores promediados a través de una población de células dada. Las células responden a un estímulo hipóxico mediante el inicio de la transcripción de un gran número de genes que les permiten adaptarse a su ambiente hostil 5. Sin embargo, la hipoxia menudo existe como un gradiente, y las células en un ambiente hipóxico no están sujetos a un estímulo hipóxico uniforme. Se describe una implementación de los kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado para examinar la síntesis del ARN mundial a nivel de células individuales en la hipoxia. El kit de imagen utiliza un ARN de unanucleósido lkyne modificado-, 5-etinil uridina (UE) y la ligadura quimioselectiva para permitir la detección de la síntesis del ARN mundial temporal y espacialmente en las células y tejidos 6. Brevemente, las células se tratan con la hipoxia y se cultivaron en la presencia de la UE. A continuación se fijan y se permeabilizaron y la incorporación de la UE en el ARN naciente se detecta mediante ligación quimioselectiva de la UE con un colorante que contiene azida. Un flujo de trabajo típico para esta reacción se muestra en la Figura 1B. Se utilizó el kit de imagen de ARN para examinar la síntesis de ARN en el nivel de células individuales que resultó de tratamiento con la hipoxia. El pequeño tamaño de la etiqueta alquino permite la incorporación eficiente de la nucleósido modificado en ARN específicamente. La ligadura quimioselectiva o &quot;clic&quot; reacción es altamente eficiente, rápida y específica 7-10. Todos los componentes de la reacción son bioinerte y la reacción no requiere de temperaturas extremas o disolventes. La reacción click niegael requisito para el marcado radiactivo convencional y permite la visualización directa de los resultados ya que la salida es la luz. Además, la molécula de detección puede penetrar fácilmente en muestras complejas que permiten para el análisis múltiplex incluyendo anticuerpos para la detección de proteínas de ARN-interactivo. Este ensayo de formación de imágenes de ARN es compatible con colorantes orgánicos incluyendo Alexa Fluor y de fluoresceína (FITC). Se midió el cambio en la síntesis de ARN después del tratamiento de las células usando una implementación del medio ambiente microscopía abierto para objetos remotos (OMERO). OMERO es un software de código abierto, disponible en <a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a> . Este software microscopio de imagen de visualización y análisis permite el acceso a, y el uso de una amplia gama de datos biológicos, incluida la gestión de bases de datos heterogéneas, multidimensionales. La aplicación cliente permite la visualización y el análisis de datos de imágenes biológicas complejas 11 a distancia;lo usamos para cuantificar los cambios visuales en la síntesis global y única de ARN celular. Estos datos y los pasos necesarios para analizar nuestro experimento de formación de imágenes de ARN usando este microscopio imagen software de visualización y análisis se muestran a continuación. Nos fijamos en los cambios en la síntesis de ARN mundial después del tratamiento del osteosarcoma humano U2OS células (hipoxia), con capacidad para 24 hr. En todas las condiciones, se detectó la variación de célula a célula en el nivel de producción de ARN. Tiempos cortos de exposición a la hipoxia no dio lugar a cambios significativos en el nivel de ARN naciente en las células. Sin embargo, la exposición a 24 h de hipoxia resultó en un aumento significativo en la cantidad de ARN producido en las células. La mayoría de las respuestas celulares a la hipoxia se miden después de períodos prolongados de exposición, tales como 4 a 24 horas. Sin embargo, algunos mecanismos se ponen en marcha mucho antes, por ejemplo; La activación de NF-kB se produce dentro de 5-15 minutos de exposición a la hipoxia 12. La investigación de hipo más cortoPor lo tanto, los tiempos de exposición xia está garantizado y podría menoscabar las respuestas más complicados como el ciclo celular y la apoptosis.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

La hipoxia o disminución de la disponibilidad de oxígeno está involucrado en muchos procesos fisiológicos y patológicos. A nivel molecular, las células inician un programa transcripcional particular, con el fin de montar una respuesta celular apropiada y coordinada. La célula posee varias enzimas sensor de oxígeno que requieren oxígeno molecular como cofactor para su actividad. Estos van desde prolil-hidroxilasas a desmetilasas histonas. La mayoría de los estudios de análisis de las respuestas celulares a la hipoxia se basan en poblaciones celulares y estudios medios, y, como tal, el análisis de células individuales de células hipóxicas se realiza rara vez. Aquí se describe un método de análisis de la síntesis del ARN mundial a nivel de célula única en la hipoxia mediante el uso de kits de imagen RNA Click-iT en una estación de trabajo de oxígeno controlado, seguido por análisis de microscopía y cuantificación. El uso de células cancerosas expuestas a hipoxia durante diferentes periodos de tiempo, el ARN se marca y se mide en cada célula. Este análisis permitela visualización de los cambios temporales y de célula a célula en la síntesis de ARN mundial siguientes estrés hipóxico.

Un esquema de la reacción kit de imagen de ARN se muestra en la Figura 1B. Utilizamos esta reacción para determinar cuantitativamente la síntesis de ARN total en células U2OS después del tratamiento con hipoxia tanto individuales (una sola célula) y mundial (con una población de las células). Las células fueron tratadas con la hipoxia y se cultivaron en la presencia de la UE. Ellos fueron fijadas y permeabilized y la incorporación de la UE se detectó mediante ligadura quimioselectiva de la UE con un colorante que contiene azida. Este &quot;clic&quot; reacción da como resultado una emisión de fluorescencia que puede ser detectado y cuantificado usando microscopía de luz de fluorescencia. Figura 2A muestra un resultado típico de este experimento. Células marcadas con fluorescencia se pseudocoloreada rojo y la imagen se ha abierto en el entorno de la microscopía abierto para objetos remotos (OMERO). Este software microscopio de imagen de visualización y análisis tiene una herramienta integrada de retorno de la inversión que se puede utilizar para seleccionar estructuras subcelulares individualesturas y cuantitativamente analizar intensidad de la imagen dentro de la región elegida. Un ejemplo típico de la salida de datos tras el uso de esta herramienta en el programa de cliente se puede ver en la Figura 2B; intensidades de células individuales se muestran junto a una imagen representativa del experimento que sirve como un control visual para asegurar la validez de los datos. Las intensidades de fluorescencia de células individuales se pueden representar como un gráfico de dispersión para mostrar la distribución de las intensidades celulares individuales dentro de la población de células tratadas. Un ejemplo de este tipo de gráfico se ve en la Figura 2C. Trazado de los datos de intensidad de esta manera es útil porque permite una rápida comparación de los resultados del tratamiento y demuestra claramente la heterogeneidad significativa dentro de una población de células de tratamiento que está oscurecida de otro modo el uso de la representación de datos estándar. La heterogeneidad de respuesta es interesante en este experimento porque a pesar de un estímulo hipóxico uniforme era unpplied a las células, es evidente que todas las células de la misma población monocapa responde de manera diferente a este estímulo. La figura 2D muestra el resultado global de nuestro experimento. Intensidades de fluorescencia de todas las células dentro de una población de tratamiento se promediaron y luego trazan en este gráfico de barras. T-test de un estudiante se ha utilizado para el cálculo de la probabilidad estadística de cada grupo de tratamiento que difieren significativamente del control. Curiosamente, estos datos muestran que hay un aumento estadísticamente significativo en la síntesis de ARN mundial con el tiempo cuando las células U2OS se tratan con hipoxia (a veces mayor que 1 h 30 min * p &lt;0,01;. ** P &lt;0,05 y *** p &lt;0.001 y n&gt; 30). Estos datos muestran que después de períodos de tratamiento más largos hipoxia, la célula se centra sus esfuerzos en la producción de ARN incluso en este entorno hipóxico hostil. Actinomicina D tratamiento extirpa completamente la intensidad de fluorescencia como se esperaba.<img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> Figura 1. Sistema A. El HIF responde a los cambios de oxígeno celular. En este hipoxia esquemática simplificada estabiliza el heterodímero HIF mediante la prevención de HIF-α hidroxilación (-OH) por las enzimas prolil hidroxilasa (doctores) y su posterior polyubquitination por von Hippel-Lindau proteína (VHL). Resultados de estabilización de HIF en la miríada de activación de genes que ayudan a la célula responder a la hipoxia celular B. síntesis de ARN se puede detectar usando el ensayo de Click-TI.; células se marcan con la UE después del tratamiento la reacción Click detecta la síntesis de ARN que se puede cuantificar por la intensidad de fluorescencia y microscopía de luz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para conocer el vers grandes</a>ión de esta figura. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> Figura 2. A. Captura de pantalla de OMERO para mostrar la salida típica microscópico después de etiquetado ARN. Este software microscopio de imagen de visualización y análisis se puede extraer datos rápidamente de intensidad en un nivel de células individuales utilizando su innata macro ROI. Una captura de pantalla del resultado de este comando se muestra en la síntesis de B. Global ARN se puede deducir de la intensidad de la celda individual, la gama de los cuales se puede ver en el gráfico de dispersión C. Una representación formal de estos datos agregados puede verse D. * p &lt;0,01; ** P &lt;0,05 y *** p &lt;0.001 y n&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver la imagen más grande.</a> <table border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> Reactivos Cultivo Celular </td></tr><tr><td> Salina tamponada con fosfato (PBS) de pH 7.2 a 7.6 </td></tr><tr><td> De Dulbecco Modified Eagles Medium (DMEM) </td></tr><tr><td> Suero de ternera fetal (FCS) al filtro esterilizado </td></tr><tr><td> La penicilina / estreptomicina </td></tr><tr><td> L-glutamina </td></tr><tr><td> 0,05% de tripsina-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> Etanol 70% </td></tr><tr><td> Actinomicina D (1 mg / l de valores) </td></tr><tr><td> Equipo de Cultivo Celular </td></tr><tr><td> Estéril Pipetas Pasteur </td></tr><tr><td> Una gama de artículos de plástico de cultivo tratados celular adecuado para el mantenimiento y el tratamiento de células en cultivo </td></tr><tr><td> Baño de agua a 37 ° C </td></tr><tr><td> Campana de flujo laminar de aire </td></tr><tr><td> Incubadora a 37 ° C, 5% de CO 2 </td></tr><tr><td> La hipoxia estación de trabajo fija en 37 ° C, 5% de CO 2, 1% de O 2 </td></tr><tr><td> Cubreobjetos de vidrio </td></tr><tr><td> pinzas de precisión </td></tr><tr><td> Hemocitómetro </td></tr></tbody></table> Tabla 1. Reactivos y equipos necesarios para el cultivo de las células U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514"><tbody><tr><td rowspan="2"> Componentes de la reacción </td><td colspan="6"> Número de Cubreobjetos </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Tampón de reacción RNA Click-iT (Componente C) </td><td> 428 l </td><td> 856 l </td><td> 1,7 ml </td><td> 2,1 ml </td><td> 2,58 ml </td><td> 4,3 ml </td></tr><tr><td> CuSO4 (componente D) </td><td> 20 l </td><td> 40 l </td><td> 80 l </td><td> 100 l </td><td> 120 l </td><td> 200 l </td></tr><tr><td> Alexa Fluor azida (preparado en la etapa 2.3) </td><td> 1.8 l </td><td> 3.7 l </td><td> 7.4 l </td><td> 9.3 l </td><td> 11.28 l </td><td> 18,8 l </td></tr><tr><td> Click-iT aditivo tampón de reacción (Preparado en el paso 2.3) </td><td> 50 l </td><td> 100 l </td><td> 200 l </td><td> 250 l </td><td> 300 l </td><td> 500 l </td></tr><tr><td> Aproximado del volumen total </td><td> 500 l </td><td> 1 ml </td><td> 2 ml </td><td> 2,5 ml </td><td> 1,5 ml </td><td> 5 ml </td></tr></tbody></table> . Tabla 2 de formación de imágenes ARN cócteles de reacción kit: tabla de referencia que detalla la relación de los componentes de mezcla maestra para la reacción kit de imagen ARN de acuerdo con el número de cubreobjetos para ser teñidos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fluoróforo </td><td> La excitación (nm) </td><td> Emisión (nm) </td></tr><tr><td> Alexa Fluor 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> Hoechst 33342, unido al ADN </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . Tabla 3 Fluorescencia / excitación máximos de emisión: aproximado de fluorescencia / excitación máxima de emisión para el colorante Alexa Fluor y Hoechst 33342 unido al ADN.

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Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K vistas.  University of Dundee, UK.  Se describe una técnica para el análisis de la síntesis del ARN mundial en la hipoxia utilizando imágenes. Click-química etiquetado de ARN previamente no se ha realizado en condiciones de hipoxia y permite la visualización de los cambios globales en el nivel de ARN de una sola célula. Este enfoque complementa las técnicas de ARN promediados existentes, lo que permite la visualización directa de célula a célula de los cambios en la síntesis de ARN mundial. 

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Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

Método para la medición de la cinética de fusión viral a nivel de partícula

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Investigación

Biología

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

El análisis directo de las células individuales mediante espectrometría de masas a presión atmosférica

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

Análisis de la transcripción de genes de una sola célula de ARN fluorescente<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

El estudio de la proteólisis de ciclina B en el nivel de células individuales en poblaciones de células enteras

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

Medición de niveles hemo síntesis en células de mamífero

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

Identificación de los factores clave que regula la auto-renovación y diferenciación de las células precursoras hematopoyéticas EML por análisis de secuenciación de ARN-

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

Análisis de retrotransposition LINE-1 en el Núcleo Un piso

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

Protocolo CÚBICO Visualiza la expresión de la proteína en la resolución de la celda individual en su totalidad para la piel Mount

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

Análisis de la función de célula Beta usando proyección de imagen de resolución sola célula calcio en islotes de pez cebra

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

Visualizar la interacción entre la proteína marcada Qdot y λ Site-specifically modificada de ADN en el nivel de molécula única

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...