JB הוא עמית קליני CRUK, כתלמיד Wellcome Trust PhD, המעבדה SR ממומנת על ידי מלגת מחקר בכירה CRUK (C99667/A12918). עבודה זו נתמכה על ידי שני פרסים Wellcome Trust אסטרטגיים (097945/B/11/Z ו095931/Z/11/Z).

1. תא תרבות וטיפול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את חומרים כימיים וציוד מפורט בטבלה 1 לאוסטאוסרקומה האנושית תרבות תאים (U2OS). הכן את כל חומרים כימיים ולנהל את כל הטכניקות בתרבית הרקמה בזרימת אוויר למינרית מכסה המנוע כדי להבטיח סטריליות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מדיום התרבות כדלקמן: הוסף FCS 50 מיליליטר, 5 L-גלוטמין מיליליטר ו 5 מיליליטר פניצילין / סטרפטומיצין לDMEM כדי להשיג ריכוזים סופיים של 10% (FCS), 2 מ&quot;מ (L-גלוטמין), 50 U / ml ( פניצילין) ו50 U / ml (סטרפטומיצין). לחמם את מדיום התרבות על 37 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התאים לטיפול: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר כמה coverslips ב70% אתנול, לאפשר לאוויר יבש ומקום אחד בחלק התחתון של שש צלחות 3.5 סנטימטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטבול את coverslips ב2 מיליליטר חימם DMEM המלא (37 מעלות צלזיוס), לחיצה עם המלקחיים coverslip כדי להבטיח שהם יישארו דבקים בחלק התחתון של הבארות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתק את תאי U2OS מפולחן רקמתםצלחת יור על ידי שטיפת פעם אחת עם 3 מיליליטר PBS, החלת 4 מיליליטר חיממה 0.05% טריפסין-EDTA (1%) ודוגרת על 37 מעלות צלזיוס למשך 7 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי resuspend ב 6ml חיממו DMEM להשלים כדי להשבית טריפסין-EDTA ולספור באמצעות hemocytometer. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת 2 x 10 5 תאים לכל אחד מ3.5 צלחות סנטימטר שהוכנו בשלב 1.3.1. נער בעדינות את הצלחת כדי להבטיח חלוקה שווה של תאים. אפשר התאים לדבוק לילה לפני הטיפול. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פנק את התאים על ידי הצבת ארבע 3.5 צלחות סנטימטר לתוך תחנת העבודה היפוקסיה ולהשאיר את שתי צלחות 3.5 סנטימטר האחרים בחממה על 37 מעלות צלזיוס בתנאי חמצן רגילים. להיות מוכן להתחיל את assay RNA התיוג בתנאים שטופלו (בתא היפוקסיה לתאים שטופל היפוקסיה) 1 שעות לפני טיפול היפוקסיה מסתיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף תאים להיפוקסיה עבור שעה 1 15 דקות, 1 שעות 30 דקות, 2 שעות, ו24 שעות. נקודות זמן אלה הן גמישות ונקבע משתמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש normoxic 3.5 צלחת סנטימטר כביקורת החיובית וצלחת 3.5 סנטימטר normoxic טופלה אקטינומיצין D (10 מיקרוגרם / מיליליטר בריכוז סופי) עבור 4 שעות כביקורת השלילית. אקטינומיצין D היא מעכב של סינתזת RNA הגלובלית. </li></ol> אזהרות: Hoechst 33,342 הוא mutagen ידוע. DMSO ידוע כדי להקל על הכניסה של מולקולות אורגניות לרקמות. NaOH הוא מאכל. HCl הוא מאכל. Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד לכל בעלי החיים, ויכול לגרום למוות בבני אדם. טריטון X-100 יכולים לגרום לגירוי בעור הבא במגע ישיר. אקטינומיצין D היא רעילה כאשר במגע עם עור או בליעה. לנקוט באמצעי זהירות מתאימה בעת טיפול בכל החומרים הכימיים המסוכנים. 2. לחץ עליו Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסוף את ריאגנטים הבאים הנדרשים בנוסף לערכת assay לחץ עליו: בופר פוספט pH (PBS) 7.2-7.6, paraformaldehyde .3.7% (PFA) ב-PBS, 1% X טריטון-100 ב-PBS, מים deionized (DH 2 O), sulfoxide דימתיל (DMSO), הידרוקסיד 10 M נתרן (NaOH), ו37% חומצה הידרוכלורית (HCl); רצועות אינדיקטור pH - אופציונאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות PFA טרי לפני ביצוע התגובה לחץ עליו באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים 1.85 גרם PFA, 3.5 מיליליטר DH 2 O ו10 μl of10 M NaOH לתוך צינור פלקון 50 מיליליטר. מרתיחים 300-400 מיליליטר של H 2 O בכוס גדולה במיקרוגל כדי להפוך את אמבט מים ולסבול את זה במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את פלקון 50 מיליליטר לתוך אמבט מים ובעדינות להתסיס עבור 10 דקות, מעת לעת לשחרר את המכסה עד PFA נמס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק פתרון PFA דרך מסנן 0.2 מיקרומטר לעוד צינור פלקון 50 מיליליטר, וכתוצאה מכך פתרון 37%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל זה 10x על ידי הוספת PBS ולהביא את ה-pH 6.8 על ידי הוספה על 12 μl של HCl המרוכז. אפשרות: אישור ה-pH הנכון עם רצועות המחוון במנדף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש מייד או לאחסן overnight ב 4 ° C. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מניית הפתרונות של ערכת ההדמיה RNA באופן הבא: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 373 μl DH 2 O לרכיב וכתוצאה מכך פתרון מניות של של איחוד אירופי 100 מ&quot;מ. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד לחודש אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 85 μl של DMSO למרכיב B (אלקסה פלואוריד 594) ומערבבים על ידי pipetting או vortexing. אחסן את שניהם ב-20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר DH 2 O ל-E מרכיב כדי ליצור פתרון 10X של תוסף חיץ תגובת ערכת ההדמיה-RNA. חנות ב -20 מעלות צלזיוס למשך עד שנה, להשליך כאשר פתרון מפתחת צבע חום. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תיוג של תאים עם איחוד אירופי: הכן פתרון עובד 2X של איחוד אירופי ממניות מ&quot;מ 100 מוכנות בשלב 2.3 במדיום prewarmed מלא (37 ° C) לבצע את יתרת על שלב זה ושלב 2.5 בתא היפוקסיה לתאים שטופלו היפוקסיה. . לדלל ל1X על ידי הוספת נפח שווה של פתרון זה 2X פועל להמשך התקשורתaining תאים. דגירה עבור שעה 1 בתנאי תרבית תאי טיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קיבוע תא: לשטוף היטב כל פעם עם PBS ולהוסיף 1 מיליליטר של .3.7% מניית PFA מוכנים בשלב 2.2 לעיל בתנאי טיפול. דגירה במשך 15 דקות בתנאי טיפול. הדגימות שטופלו בהיפוקסיה ניתן להסיר תא היפוקסיה בשלב זה. הסר את מקבע ולשטוף היטב כל פעם עם PBS (תשמור על עצמך להיפטר מPFA לבזבז באחריות). בצע את השלבים הבאים בטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization: הסר את הפתרון לשטוף ולהוסיף 1 מיליליטר של 1% טריטון X-100 ב PBS היטב כל אחד. דגירה של 15 דקות בטמפרטורת חדר. הסר את חיץ permeabilization ולשטוף היטב כל פעם עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איתור RNA שכותרתו: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון עובד טרי 1X של תוסף חיץ תגובת ערכת הדמיה-RNA על ידי דילול פתרון 10X (מוכן בשלב 2.3) 1:10 ב DH 2 O. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ערכת ההדמיה-RNAקוקטייל תגובה בהתאם לטבלת 2 לשימוש מייד לאחר הכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפתרון לשטוף ולהוסיף 500 μl של קוקטייל תגובת ערכת ההדמיה RNA מדגם זה. דגירה במשך 30 דקות בטמפרטורת חדר, להגן מפני אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קוקטייל תגובת ערכת ההדמיה-RNA ולשטוף פעם עם 1 מיליליטר של חיץ ההדמיה RNA תגובת ערכת שטיפה (F רכיב), ולאחר מכן להסיר את חיץ שטיפת תגובת ערכת ההדמיה-RNA. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תגובה זמנית אופציונלית: בצע תיוג נוגדן נוסף של דגימות בשלב זה על פי המלצות יצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA מכתים: לשטוף דגימות עם PBS ולאחר מכן להסיר את הפתרון לשטוף. לדלל את Hoechst 33,342 (רכיב G) 1:1,000 ב-PBS. הוסף 1 מיליליטר של Hoechst המדולל 33,342 לכל היטב דגירה ל15 דקות בטמפרטורת חדר, להגן מפני אור. הסר את פתרון Hoechst 33342 ולשטוף את התאים פעמיים עם PBS. הסר את solutio לשטוףn ולהמשיך במיקרוסקופ אור. </li></ol> 3. אור מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ההר Coverslips: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח 10 μl של הרכבה בינונית במרכז שקופית מיקרוסקופ רגילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום coverslip עם תא בצד למטה במרכז שקופית מיקרוסקופ כדי לכסות את aliquot של הרכבה בינונית. תשמור על עצמך, כדי למנוע את הדור של בועות בהרכבה בינונית כמו זה יהיה לטשטש רכישת תמונה שלאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היצמד coverslip לשקופית מיקרוסקופ על ידי יישום לכה מסמר ברור להיקפה. לאפשר לו להתייבש במשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. להגן מפני אור. דוגמאות ניתן לאחסן ב -20 ° C הבאים הרכבה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישת תמונה: לרכוש תמונות באמצעות מיקרוסקופ שדה רחב מסוגל גילוי הקרינה. מקסימום פליטת הקרינה / עירור משוער לצבע אלקסה פלואוריד וHoechst 33342 חייב DNA מוצג בלוח 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perforהדמיה מ &#39;באמצעות עדשת טבילת שמן 40X/1.30 NA וללכוד תמונות עם מצלמת CCD מקוררת. </li></ol> 4. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונות Deconvolve באמצעות תוכנת עיבוד תמונה (ראה טבלת חומרים) לפני היבוא ללקוח OMERO. לנרמל עיבוד הגדרות עבור כל התמונות באותו הניסוי בתוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח על ידי יישום הגדרות טיוח מתאי normoxic שליטה לכל תנאים אחרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באזור של עניין (ROI) בכלי התוכנה להדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח (ראה טבלת חומרים) כדי לבחור גרעינים מכל תמונה. השג עוצמות ממוצעים עבור כל החזר על השקעה ולחשב את הסטייה הממוצעת וסטנדרטית עבור כל תנאי על ידי בחירה באפשרות ניתוח עוצמה, כולל מספר בין 30-50 תאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבנות מגרשי פיזור באמצעות תוכנת גרפים הנתונים (ראה טבלת חומרים) על ידי התוויית כל ערכי העצמה הממוצעים הבודדים שהושגו בt 4.2 הצעדo משקף השתנות בין תאים מתחת לכל מצב. לחלופין לבנות גרפים בר לייצג את העצמה ממוצעת ממוצעת בתוספת סטיית התקן של RNA המתהווה. </li></ol>

<ol>
	<li>Kenneth, N. S., Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+gene+expression+by+hypoxia.">Regulation of gene expression by hypoxia.</a> Biochem J. 414, 19-29 (2008).</li><li>Appelhoff, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+function+of+the+prolyl+hydroxylases+PHD1,+PHD2,+and+PHD3+in+the+regulation+of+hypoxia-inducible+factor.">Differential function of the prolyl hydroxylases PHD1, PHD2, and PHD3 in the regulation of hypoxia-inducible factor.</a> J Biol Chem. 279, 38458-38465 (2004).</li><li>Lancaster, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+dimerization+and+substrate+phosphorylation+inhibit+factor+inhibiting+hypoxia-inducible+factor+(FIH)+activity.">Disruption of dimerization and substrate phosphorylation inhibit factor inhibiting hypoxia-inducible factor (FIH) activity.</a> Biochem J. 383, 429-437 (2004).</li><li>Rocha, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+under+low+oxygen:+holding+your+breath+for+transcription.">Gene regulation under low oxygen: holding your breath for transcription.</a> Trends Biochem Sci. 32, 389-397 (2007).</li><li>Schodel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+genome-wide+mapping+of+HIF-binding+sites+by+ChIP-seq.">High-resolution genome-wide mapping of HIF-binding sites by ChIP-seq.</a> Blood. 117, (2011).</li><li>Jao, C. Y., Salic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+RNA+transcription+and+turnover+in+vivo+by+using+click+chemistry.">Exploring RNA transcription and turnover in vivo by using click chemistry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 15779-15784 (2008).</li><li>Breinbauer, R., Kohn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Azide-alkyne+coupling:+a+powerful+reaction+for+bioconjugate+chemistry.">Azide-alkyne coupling: a powerful reaction for bioconjugate chemistry.</a> Chembiochem. 4, 1147-1149 (2003).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioconjugation+by+copper(I)-catalyzed+azide-alkyne+[3+++2]+cycloaddition.">Bioconjugation by copper(I)-catalyzed azide-alkyne [3 + 2] cycloaddition.</a> J Am Chem Soc. 125, 3192-3193 (2003).</li><li>Rostovtsev, V. V., Green, L. G., Fokin, V. V., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stepwise+huisgen+cycloaddition+process:+copper(I)-catalyzed+regioselective+"ligation"+of+azides+and+terminal+alkynes.">A stepwise huisgen cycloaddition process: copper(I)-catalyzed regioselective "ligation" of azides and terminal alkynes.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 41, 2596-2599 (2002).</li><li>Kolb, H. C., Finn, M. G., Sharpless, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Click+Chemistry:+Diverse+Chemical+Function+from+a+Few+Good+Reactions.">Click Chemistry: Diverse Chemical Function from a Few Good Reactions.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 40, 2004-2021 (2001).</li><li>Allan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=OMERO:+flexible,+model-driven+data+management+for+experimental+biology.">OMERO: flexible, model-driven data management for experimental biology.</a> Nat Methods. 9, 245-253 (2012).</li><li>Culver, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+hypoxia-induced+NF-kappaB.">Mechanism of hypoxia-induced NF-kappaB.</a> Mol Cell Biol. 30, 4901-4921 (2010).</li><li>Darzynkiewicz, Z., Traganos, F., Zhao, H., Halicka, H. D., Li, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytometry+of+DNA+replication+and+RNA+synthesis:+Historical+perspective+and+recent+advances+based+on+"click+chemistry.">Cytometry of DNA replication and RNA synthesis: Historical perspective and recent advances based on "click chemistry.</a> Cytometry A. 79, 328-337 (2011).</li></ol>

JRS הוא מייסד של Glencoe תוכנה, Inc, חברה מסחרית שבסיסן בקוד פתוח שתורמת לOMERO.

שתארנו השימוש שלנו בערכת הדמיה RNA כדי לבחון את ההשפעות של חוסר חמצן בסינתזת RNA בתאי אוסטאוסרקומה (U2OS). טכניקה זו היא פשוטה יחסית, ומספקת נתונים על שעתוק הגלובלי ברמת תא בודדת. אנחנו שינינו את הפרוטוקול הקונבנציונלי עבור ערכה זו לשלב תיוג בתא היפוקסיה. למיטב ידיעתנו זה הדו&quot;ח הראשון של השימוש בטכניקה זו כדי למדוד שינויים בסינתזת RNA בהיפוקסיה. ערכת ההדמיה RNA השתמשנו מתאימה לניסויים בהיפוקסיה שכן הוא לא דורש איזוטופים רדיואקטיביים והוא מבחינה טכנית בקנה אחד עם המגבלות של עבודה בתחנת עבודה באווירה מבוקרת. בעיות נפוצות בקיבעון הזה הדאגה טכניקה יעיל וסימון של המדגם. זה חשוב מאוד כי PFA משמש כדי לתקן את המדגם הוא טרי והצעדים לשטוף שבצעו את התגובה &#39;קליק&#39; מבוצעים כפי שתוארו על מנת להבטיח מכתים רקע נמוך של המדגם. אם בackground הקרינה הופכת לבעיה מומלץ לשטוף שוב עם חיץ שטיפת תגובת ערכת ההדמיה RNA מיליליטר 1 לאחר שלב 2.7.4. ערכת ההדמיה RNA שהוזכר כאן מייצגת התקדמות משמעותית בטכנולוגיית ההדמיה RNA במונחים של קלות שימוש וספציפיות ומהירות התגובה. טכניקה זו היא מוגבלת בעיקר על ידי הזמן שנדרש כדי לתייג את המדגם. ערכת ההדמיה RNA דורשת תקופת תיוג 1 שעות שמונעת הבדיקה של שינויים מהירים בRNA הגלובלי, כי בדרך כלל היה להתרחש בפרק זמן זה. זה מסיבה זו נקודת הזמן הראשון שלנו מוגבלת לשעה 1 ו15 דקות. הטכניקה קשורה עם כמה מגבלות אחרות שמידה רבה מתייחסות למגיב תאימות עם סמני ניאון אחרים, למשל, ערכת ההדמיה RNA זה אינה תואמת עם מכתים phalloidin. כל הגישות הקיימות של לימוד סינתזת RNA בתאים מבוססות על שילוב של nucleosides שונה לתוךRNA המתהווה וזיהוי של תוויות משולבות על ידי אמצעים שונים. הגישה החלוצית הייתה מבוססת על שימוש בסימנים מקדימים RNA שכותרתו רדיואקטיבית ואחרי זיהוי עם autoradiography. שיטה זו הובילה לגילוי של שלבי מחזור התא וממצאים חשובים אחרים; עם זאת, יש לו הרבה חסרונות כגון האופי המסורבל של עבודת רדיואקטיביות, זמן חשיפה ארוך ותמונות ברזולוציה נמוכות של autoradiography 6. מראש הבאים בתחום ניצל אמצעי immunochemistry לחסל את הצורך של רדיואקטיביות. RNA היה מתויג על ידי שילוב של הבר ואחריו גילוי immunochemistry. עם זאת, המחויב נוגדן יעיל denaturation חומצות גרעין כדי לשפר את הגישה ל-DNA או RNA שגרם לאובדן של מורפולוגיה של תאים פגומים אפיטופים של חלבונים רבים, מניעת הגילוי נוסף שלהם עם נוגדנים שכותרתו fluorescently 13. כניסתה של טכנולוגיה של כימיה לחץ &quot;פישטה את צעד זיהוי ולאהוא הליך בהשוואה לautoradiography וimmunochemistry. הטכנולוגיה מבוססת על אזיד-alkyne תגובת cycloaddition Huisgen בי alkyne מסוף של 5-ethyniluridine נקשר עם אזיד מצומד עם fluorophore בנוכחות של Cu (I). התגובה ספציפית, מהירה, אינו דורשת כל צעדים נוספים, והוא בקלות בקנה אחד עם גילוי immunochemical של מרכיבי תא אחרים. שימוש בטכנולוגיית ההדמיה RNA זה הראו שתאים, באותה האוכלוסייה monolayer, יש רמות סינתזת RNA שונות בתגובה להיפוקסיה. אנחנו מוגבלים הניסוי שלנו כדי לבחון את ההשפעה של ייצור RNA בלבד; עם זאת, הוא מלא אפשרי עם ערכת ההדמיה RNA זה כדי לבצע הותאמו תגובות זמנית נוספות, המאפשרות ניתוח מורכב יותר של ייצור RNA. לדוגמא, מכתים המשני באמצעות נוגדן ספציפי לסמנים של שעתוק פעיל כגון רמות של פולימראז פוספורילציה RNA השני או אפילו רכיבים של התרגומיםמכונות tion לתת אינדיקציה לכמות של RNA הפיק החדש הזה שהופך לחלבון אפשריות. חלבונים נוספים, כגון אקטין, חלבון זה לא צריך לשנות באופן משמעותי עם היפוקסיה, יכולים להיבדק כבקרה נוספת. יתר על כן, סוגי תאים שונים יכולים להיבדק, כפי שהוא מאוד סביר להניח כי תאים שונים יהיו תעריפים שונים RNA סינתזה ואפילו תגובות שונות להיפוקסיה. שימוש בערכת ההדמיה RNA זה הוא פשוט למדי סיפק את הצעדים מבוצעים כפי שתואר. שלבים קריטיים בפרוטוקול כרוך ציפוי תא, קיבוע תא מכתים ורכישת תמונה. חשוב צלחת התאים בצפיפות תיארה כדי למנוע מעל או מתחת לנקודת מפגש בניסויים אשר תשפיע על התוצאה באופן משמעותי. כמו כן, חשוב להשתמש במקבע טרי, כדי להבטיח את &quot;תמונת המצב&quot; הטובה ביותר של התא נלקח ולטפל בעת שטיפת התאים לאחר הצביעה כדי לצמצם את בחינות הבגרותkground לרמה שמקובלת לניתוח יעיל. לבסוף, שיטת רכישה של תמונה היא חשובה וחיוני על מנת להשיג תמונות כי הם באיכות מספיק טובה לניתוח שלאחר מכן. אנו ממליצים להשתמש במיקרוסקופ האור הטוב ביותר העומד לרשות לבחון דגימות אופטית כגון מיקרוסקופ שימוש בפרוטוקול זה שהוא זמין ברוב מרכזי המחקר האינטנסיביים ברחבי העולם.

היפוקסיה (מתחים נמוכים של חמצן) מתרחשת כאשר אספקת החמצן הרגילה לרקמה היא מופרעת. חמצן סביבתי הוא גם מזין ומולקולת איתות, מתן רמזים חשובים עבור סוגים רבים של תאים. שינויים בחמצן סביבתי הם חשו על ידי קבוצה של dioxygenases ששולטים על פעילותם של בני משפחה גורם שעתוק חיוני המכונים גורמי היפוקסיה העין מתנהלת (HIFs). HIFs מורכב משתי תת יחידות, α וβ. ישנם שלושה isoforms הידוע של HIF-α (1, 2, ו -3) וגרסאות אחוי מרובות של HIF-1β. HIF-1β מתבטאים constitutively ולא מוסדרים על ידי רמות חמצן סביבתיות 1. בני משפחת HIF-α מוסדרים באופן דינמי על ידי כיתה של prolyl-hydroxylases (תואר דוקטור) והגורם המעכב HIF (FIH); שניהם דורשים חמצן כשיתוף גורם לזרז הידרוקסילציה של HIF-α 2,3. בnormoxia בני משפחת HIF-α הם hydroxylated ומתויגים לproteosomאל השפלה ידי E3-האנזים, פון היפל לינדאו (VHL). בהיפוקסיה הדוקטורים וFIH אינם פעילים או שיש פעילות מופחתת. Isoforms HIF-α הפך התייצב, יוצר heterodimer עם HIF-1β, ולהשפיע על השעתוק של גנים המספקים את התגובה התאית לסביבת חוסר חמצן (איור 1 א) 4. טכניקות הנוכחיות לניתוח RNA להתמקד בכימות של ערכים בממוצע על פני אוכלוסיית תא נתון. תאים מגיבים לגירוי חוסר חמצן על ידי ייזום השעתוק של מספר עצום של גנים המאפשרים להם להסתגל לסביבה העוינת שלהם 5. עם זאת, לעתים קרובות קיימת היפוקסיה כשיפוע, ותאים בסביבת חוסר חמצן אינם כפופים לגירוי חוסר חמצן אחיד. אנו מתארים יישום של ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר כדי לבחון סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא הבודד בהיפוקסיה. ערכת ההדמיה RNA משתמשתנוקלאוזידים הותאם-lkyne, uridine 5-ethynyl (EU) וקשירת chemoselective כדי לאפשר זיהוי של סינתזת RNA הגלובלית temporally ומרחבית בתאים וברקמות 6. בקצרה, טיפול בתאים עם חוסר חמצן ותרבית בנוכחות של איחוד אירופי. לאחר מכן הם קבועים וpermeabilized וההתאגדות של האיחוד האירופי לרנ&quot;א המתהווה הוא זוהה על ידי קשירת chemoselective של איחוד אירופי עם צבע המכיל אזיד. עבודה אופיינית לתגובה זו מוצגת באיור 1. אנחנו השתמשנו בערכת ההדמיה RNA לבחון סינתזת RNA ברמת התא הבודד שנבעה מטיפול בחוסר חמצן. גדליו הקטנים של תג alkyne מאפשרים שילוב יעיל של נוקלאוזידים שונה לתוך RNA באופן ספציפי. קשירת chemoselective או התגובה &#39;קליק&#39; היא יעילה ביותר, מהירה וספציפית 7-10. כל מרכיבי התגובה הם bioinert והתגובה לא דורשת טמפרטורות או ממסים קיצוניים. תגובת הלחיצה שוללתהדרישה לradiolabelling קונבנציונלי ומאפשר הדמיה ישירה של התוצאות שכן התפוקה היא אור. בנוסף לכך, מולקולת זיהוי יכולה לחדור בקלות דגימות מורכבות המאפשרות ניתוח זמנית כוללים נוגדנים לזיהוי של חלבוני RNA-אינטראקטיבי. assay ההדמיה RNA זה תואם עם צבעים אורגניים, כולל Alexa פלואוריד והעמסה (FITC). מדדנו את השינוי בסינתזת RNA לאחר טיפול של התאים שלנו באמצעות יישום של הסביבה הפתוחה מיקרוסקופיה לעצמים מרוחקים (OMERO). OMERO הוא תוכנת קוד פתוח, זמינה <a href="http://openmicroscopy.org/">בhttp://openmicroscopy.org/.</a> תוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה מאפשרת גישה ולשימוש במגוון רחב של נתונים ביולוגיים, כולל הניהול של מערכי נתונים רב ממדיים, הטרוגנית. יישום לקוח מאפשר הדמיה וניתוח של נתוני תמונה ביולוגית מורכבים 11 מרחוק;אנחנו השתמשנו בו כדי לכמת את השינויים החזותיים בסינתזת RNA התא הגלובלית ורווקה. נתונים אלה ואת הצעדים הנדרשים כדי לנתח את ניסוי ההדמיה RNA שלנו באמצעות הדמיה זו מיקרוסקופ תמונה ותוכנת ניתוח מוצגים להלן. הסתכלנו על שינויים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות הטיפול באוסטאוסרקומה אדם תאים (U2OS) עם היפוקסיה עד 24 שעה. בכל התנאים, זיהינו וריאציה תא אל התא ברמת ייצור RNA. זמנים קצרים של חשיפת היפוקסיה לא הביאו לשינויים משמעותיים ברמה של RNA המתהווה בתאים. עם זאת, חשיפה ל24 שעות של היפוקסיה הביאה לעלייה משמעותית בכמות של RNA המיוצרת בתאים. רוב התגובות תאיות להיפוקסיה נמדדים הבא תקופות ממושכות של חשיפה, כגון 4-24 שעה. עם זאת, הם הכניסו כמה מנגנונים במקום הרבה יותר מוקדם, למשל; הפעלת NF-κB מתרחשת בתוך 5-15 דקות של חשיפת היפוקסיה 12. חוקר היפו קצר יותרזמני חשיפת שיה הוא מוצדקים ולכן ויכולים לגרוע מתגובות מורכבות יותר כגון מחזור התא ואפופטוזיס.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1313px;" width="1314">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:236px;">U-2 OS Primary Cells</td>
			<td style="width:92px;">European Collection of Cell Cultures</td>
			<td align="right" style="width:115px;">92022711</td>
			<td style="width:168px;"></td>
			<td style="width:703px;"><a href="http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&amp;dosearch=true">http://www.hpacultures.org.uk/products/celllines/generalcell/search.jsp?searchtext=u2os&#38;dosearch=true</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">14190094</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/14190094</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">41966029</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029">https://products.invitrogen.com/ivgn/product/41966029?ICID=search-41966029</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">FCS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">10270106</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/10270106?ICID=search-10270106</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>DE17-603E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/antibiotics-antimycotics/penicillin-streptomycin.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">L-Glutamine</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>BE17-605E</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx">http://www.lonza.com/products-services/bio-research/cell-culture-products/reagents/cell-culture-reagents/l-glutamine-200mm.aspx</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.05% Trypsin-EDTA (1%)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062">http://products.invitrogen.com/ivgn/product/25300062</a></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Hypoxia Chamber</td>
			<td>Ruskinn</td>
			<td>InVivo2 300</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.ruskinn.com/products/invivo2300">http://www.ruskinn.com/products/invivo2300</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Click-iT assay Kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>C-10329/C10330</td>
			<td></td>
			<td>http://products.invitrogen.com/ivgn/en/US/adirect/invitrogen?cmd=catDisplayStyle&#38;catKey=601107&#38;filterDispName=Nascent%2BRNA%2BDetection%2B%2526amp%253B%2BCapture%2BKits&#38;_bcs_=H4sIAAAAAAAAAMWP3WrDMAyFn8Y3MwtOUrrcZg0dpVAGZbs3jpYIEjvYSoLffvK6jbKV3Q6EhP44%0A37nPhaqevWtnQ0GKYivP4Bc0EP6Y90STKGtR7DnWdc3QLkjedWAz40YeBiTgMgdOYDn1boSsp3Hg%0Ad1GUKVRFfobUqwfFJVc5H1aFyu%2B4O%2BJFV48s9SjrEHT8pT19Av4EKOtK8RqXzn4BvJw56RY9GEqr%0A7wdR7s3YirI5vD6djKYGwzTouNMEnfOREXh4hMgXie2a%2F00P4aYBLsV2czFyms0AaGRtsJUNEOuj%0As9fWrB5iwCCT5X92%2BEF9y%2BI7x9UoYCgCAAA%3D</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pFA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>76240</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/fluka/76240?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Triton X-100</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>X-100</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/x100?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10M NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/72068?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">37% HCl</td>
			<td>VWR</td>
			<td>20252.335</td>
			<td></td>
			<td><a href="https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&amp;searchOp=or">https://uk.vwr.com/app/search/Search?keywords=%2720252.244%27%20%2720252.290%27%20%2720252.324%27%20%2720252.335%27%20%2720252.368%27%20%2720252.420%27%20%2720252.448%27%20%2720252.980%27&#38;searchOp=or</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VectaShield Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1400</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483">http://www.vectorlabs.com/catalog.aspx?prodID=1483</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Actinomycin D</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A9415</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&amp;region=GB">http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/a9415?lang=en&#38;region=GB</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Deltavision Core Microscope</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.appliedprecision.com/">http://www.appliedprecision.com/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">softWoRx [Refered to in text as image processing software]</td>
			<td>Applied Precision</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.api.com/softworx.asp">http://www.api.com/softworx.asp</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CoolSnap HQ2 CCD Camera</td>
			<td>Photometrics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php">http://www.photometrics.com/products/ccdcams/coolsnap_hq2.php</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Open Microscopy Environment for Remote Objects (OMERO) [refered to in text as microscope image visualisation and analysis software]</td>
			<td>OME</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://openmicroscopy.org/">http://openmicroscopy.org/</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SigmaPlot v12.0 [Refered to in text as data graphing software]</td>
			<td>Systat Software Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
			<td><a href="http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php">http://www.sigmaplot.co.uk/products/sigmaplot/sigmaplot-details.php</a></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of global rna synthesis at the single cell level following hypoxia

היפוקסיה או הפחתה של זמינות החמצן מעורבת בתהליכים פיסיולוגיים רבים ופתולוגיים. ברמה המולקולרית, תאים ליזום תכנית תעתיק מסוימת על מנת לעלות תגובה תאית מתאימה ומתואמת. התא בעל כמה אנזימי חיישן חמצן שדורשים חמצן מולקולרי כcofactor לפעילות שלהם. אלה נעים בין prolyl-hydroxylases לdemethylases היסטון. רוב מחקרי ניתוח תגובות תאיות להיפוקסיה מבוססים על אוכלוסיות סלולריות ומחקרי ממוצע, וכניתוח תא בודד כזה של חוסר חמצן בתאים מבוצעים רק לעתים רחוקות. כאן אנו מתארים שיטת ניתוח של סינתזת RNA הגלובלית ברמת התא והתא בהיפוקסיה באמצעות ערכות ההדמיה RNA לחץ עליו בתחנת עבודה של חמצן מבוקר, ואחריו ניתוח מיקרוסקופית וכימות. שימוש בתאי סרטן שנחשפו לחוסר חמצן לאורכים שונים של זמן, RNA מסומן ונמדד בכל תא. ניתוח זה מאפשרההדמיה של ושינויי תא אל התא זמניים בסינתזת RNA הגלובלית בעקבות לחץ חוסר חמצן.

סכמטי של תגובת ערכת ההדמיה RNA הוא מוצג באיור 1. אנחנו השתמשנו תגובה זו כדי לקבוע כמותית סינתזת RNA הכוללת בתאים U2OS לאחר טיפול עם היפוקסיה בשני בודד (תא בודד) ורמה הגלובלית (אוכלוסייה של תאים). טופלו התאים עם היפוקסיה ותרבית בנוכחות של איחוד אירופי. לאחר מכן הם היו קבועים וpermeabilized וההתאגדות של האיחוד האירופי התגלתה על ידי קשירת chemoselective של איחוד אירופי עם צבע המכיל אזיד. זה &#39;לחץ על&#39; תוצאות תגובה בפליטת הקרינה שניתן לאתרם ולכמת באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי אור. איור 2A מראה תוצאה אופיינית מניסוי זה. תאי שכותרתו fluorescently הם pseudocolored אדומים והתמונה כבר נפתחו בסביבה הפתוחה במיקרוסקופ לעצמים מרוחקים (OMERO). יש תוכנה להדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה מובנה בכלי החזר על השקעה שניתן להשתמש בם כדי לבחור struc משנה הסלולר הבודדטורס וכמותית לנתח עוצמת תמונה בתוך האזור שנבחר. דוגמא אופיינית לפלט הנתונים הבאים את השימוש בכלי זה בתכנית הלקוח שניתן לראות באיור 2; עוצמות תא בודדות מוצגות לצד תמונה מייצגת מהניסוי המשמש כבדיקה חזותית כדי להבטיח תקפות נתונים. ניתן להתוות עוצמות הקרינה סלולרי בודדות כמו תרשים פיזור כדי להראות את חלוקת העוצמות הסלולריות הבודדים בתוך אוכלוסיית התאים שטופלה. דוגמא לסוג זה של גרף ניתן לראות באיור 2 ג. זוממים נתוני עוצמת בדרך זו היא שימושי משום שהוא מאפשר השוואה מהירה של תוצאות טיפול ומדגים בבירור את ההטרוגניות המשמעותית בתוך אוכלוסיית תאי טיפול שהוא מוסתר כל שימוש אחר בייצוג נתונים סטנדרטי. ההטרוגניות התגובה מעניינת בניסוי זה, כי למרות שגירוי חוסר חמצן אחיד היהpplied לתאים, ברור שכל תא מאותה האוכלוסייה monolayer מגיב באופן שונה לגירוי זה. איור 2 ד מתאר את התוצאה הכוללת מהניסוי שלנו. עוצמות הקרינה מכל התאים בתוך אוכלוסיית טיפול היו בממוצע ולאחר מכן להתוות בתרשים עמודות זה. מבחן t של סטודנט נעשה שימוש כדי לחשב את ההסתברות הסטטיסטית של כל קבוצת טיפול השונה באופן משמעותי מכלל השליטה. מעניין לציין, כי נתונים אלה מראים כי יש עלייה משמעותית מבחינה סטטיסטית בסינתזת RNA הגלובלית לאורך זמן כאשר הם מטופלים תאי U2OS עם היפוקסיה (HR בפעמים יותר מאשר 1 30 דקות * p &lt;0.01;. ** P &lt;0.05 ו*** p &lt;0.001 וn&gt; 30). נתונים אלו מראים כי בעקבות תקופות ארוכות יותר של טיפול בחמצן, התא מתמקד מאמציה בייצור של RNA אפילו בסביבה של חוסר חמצן עוינת זו. טיפול D אקטינומיצין ablates לחלוטין את עוצמת הקרינה כצפוי.<img alt="איור 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig1.jpg" /> איור 1. מערכת א HIF מגיבה לשינויים בחמצן הסלולר. בהיפוקסיה סכמטית הפשוטה הזה מייצב את heterodimer HIF ידי מניעת הידרוקסילציה HIF-α (-OH) על ידי אנזימי hydroxylase prolyl (תואר דוקטור) וpolyubquitination הבא שלה על ידי חלבון פון היפל-Lindau (VHL). תוצאות ייצוב HIF בהפעלה של גנים רבים המסייעים להגיב תא היפוקסיה סלולרית סינתזת RNA ב &#39;ניתן לאתר באמצעות assay Click-IT.; תאים מסומנים עם האיחוד האירופי לאחר טיפול התגובה לחץ מזהה סינתזת RNA אשר ניתן לכמת על ידי עוצמת הקרינה ומיקרוסקופ אור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בvers גדול יותר</a>יון של נתון זה. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51420/51420fig2.jpg" /> איור 2. א מסך מOMERO להראות תפוקה מיקרוסקופית אופיינית הבא תיוג רנ&quot;א. תוכנת הדמיה תמונת מיקרוסקופ וניתוח זה יכול לחלץ את הנתונים במהירות בעוצמה ברמת תא בודד באמצעות מאקרו ההחזר על ההשקעה המובנה שלה. צילום מסך של הפלט מפקודה זו מוצג בסינתזה ב גלובל RNA ניתן להסיק מעוצמת תא בודדת, בטווח של אשר ניתן לראות בעלילת פיזור ג ייצוג פורמלי של נתונים מצרפיים אלה ניתן לראות ד * p &lt;0.01; ** P &lt;0.05 ו*** p &lt;0.001 וn&gt; 30. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51420/51420fig2highres.jpg" target="_blank">לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <tablדואר border = &quot;0&quot; cellpadding = &quot;0&quot; cellspacing = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> ריאגנטים תרבית תאים </td></tr><tr><td> בופר פוספט pH (PBS) 7.2-7.6 </td></tr><tr><td> של Dulbecco נשרים השתנה בינוני (DMEM) </td></tr><tr><td> עגל בסרום עוברי מסנן (FCS) מעוקר </td></tr><tr><td> פניצילין / סטרפטומיצין </td></tr><tr><td> L-גלוטמין </td></tr><tr><td> 0.05% טריפסין-EDTA (1%) </td></tr><tr><td> 70% אתנול </td></tr><tr><td> אקטינומיצין D (1 מיקרוגרם / μl מניות) </td></tr><tr><td> ציוד תרבית תאים </td></tr><tr><td> סטרילי פסטר פיפטות </td></tr><tr><td> מגוון של כלים שטופלו בתרבית תאי פלסטיק מתאים לתחזוקה וטיפול בתאים בתרבית </td></tr><tr><td> אמבט מים נקבע על 37 מעלות צלזיוס </td></tr><tr><td> זרימת אוויר ברדס למינרית </td></tr><tr><td> חממה שנקבעה על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 </td></tr><tr><td> היפוקסיה Workstation נקבע על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, 1% O 2 </td></tr><tr><td> coverslips זכוכית </td></tr><tr><td> מלקחיים דיוק </td></tr><tr><td> Hemocytometer </td></tr></tbody></table> טבלה 1. חומרים כימיים וציוד הנדרשים לculturing של תאי U2OS. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="514" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"> רכיבי תגובה </td><td colspan="6"> מספר Coverslips </td></tr><tr><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> תגובת חיץ RNA לחץ עליו (רכיב C) </td><td> 428 μl </td><td> 856 μl </td><td> 1.7 מיליליטר </td><td> 2.1 מיליליטר </td><td> 2.58 מיליליטר </td><td> 4.3 מיליליטר </td></tr><tr><td> CuSO 4 (רכיב D) </td><td> 20 μl </td><td> 40 μl </td><td> 80 μl </td><td> 100 μl </td><td> 120 μl </td><td> 200 μl </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד יזיד (מוכן בשלב 2.3) </td><td> 1.8 μl </td><td> 3.7 μl </td><td> 7.4 μl </td><td> 9.3 μl </td><td> 11.28 μl </td><td> 18.8 μl </td></tr><tr><td> תוסף חיץ תגובה לחץ עליו (מוכן בשלב 2.3) </td><td> 50 μl </td><td> 100 μl </td><td> 200 μl </td><td> 250 μl </td><td> 300 μl </td><td> 500 μl </td></tr><tr><td> סך היקף משוער </td><td> 500 μl </td><td> 1 מיליליטר </td><td> 2 מיליליטר </td><td> 2.5 מיליליטר </td><td> 1.5 מיליליטר </td><td> 5 מיליליטר </td></tr></tbody></table> . טבלה 2 קוקטיילים תגובת ערכת הדמיה-RNA: טבלת עזר המפרטת את היחס בין מרכיבי תערובת אב תגובת ערכת ההדמיה RNA לפי מספר coverslips להיות מוכתמים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> Fluorophore </td><td> עירור (ננומטר) </td><td> פליטה (ננומטר) </td></tr><tr><td> אלקסה פלואוריד 488 </td><td> 495 </td><td> 519 </td></tr><tr><td> 33342 Hoechst, קשור לדנ&quot;א </td><td> 350 </td><td> 461 </td></tr></tbody></table> . טבלה 3 מקסימום הקרינה / עירור פליטה: מקסימאלי פליטת הקרינה / עירור משוער לצבע אלקסה פלואוריד וHoechst 33342 קשור ל-DNA.

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia at JoVE.com

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא אל תא שינויים בסינתזת RNA הגלובלי.

ניתוח של גלובל RNA סינתזה ברמת התא בודד הבאות היפוקסיה

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

analysis-global-rna-synthesis-at-single-cell-level-following

Google

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Dundee, UK.  אנו מתארים טכניקה לניתוח של סינתזת RNA העולמית בהיפוקסיה באמצעות הדמיה. תיוג לחץ כימיה של RNA עד עתה לא בוצע תחת היפוקסיה ומאפשר הדמיה של שינויי RNA הגלובליים ברמת התא הבודד. גישה זו משלימה את טכניקות RNA ממוצע הקיימות, המאפשרת הדמיה ישירה של תא א...

Video: Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Method for Measurement of Viral Fusion Kinetics at the Single Particle Level

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion events, making it difficult to quantitatively analyze the sequence of the molecular steps involved. We have developed an in vitro, two-color fluorescence assay to monitor kinetics of single virus particles fusing with a target bilayer on an essentially fluid support.
Influenza viral particles are incubated with a green lipophilic fluorophore to stain the membrane and a red hydrophilic fluorophore to stain the viral interior. We deposit a ganglioside-containing lipid bilayer on the dextran-functionilized glass surface of a flow cell, incubate the viral particles on the planar bilayer and image the fluorescence of a 100 x 100 &mu;m2 area, containing several hundreds of particles, on a CCD camera. By imaging both the red and green fluorescence, we can simultaneously monitor the behavior of the membrane dye (green) and the aqueous content (red) of the particles.
Upon lowering the pH to a value below the fusion pH, the particles will fuse with the membrane. Hemifusion, the merging of the outer leaflet of the viral membrane with the outer leaflet of the target membrane, will be visible as a sudden change in the green fluorescence of a particle. Upon the subsequent fusion of the two remaining distal leaflets a pore will be formed and the red-emitting fluorophore in the viral particle will be released under the target membrane. This event will give rise to a decrease of the red fluorescence of individual particles. Finally, the integrated fluorescence from a pH-sensitive fluorophore that is embedded in the target membrane reports on the exact time of the pH drop.
From the three fluorescence-time traces, all the important events (pH drop, lipid mixing upon hemifusion, content mixing upon pore formation) can now be extracted in a straightforward manner and for every particle individually. By collecting the elapsed times for the various transitions for many individual particles in histograms, we can determine the lifetimes of the corresponding intermediates. Even hidden intermediates that do not have a direct fluorescent observable can be visualized directly from these histograms.

We present an in vitro, two-color fluorescence assay to visualize the fusion of single virus particles with a fluid target bilayer. By labeling viral particles with fluorophores that differentially stain the viral membrane and its interior, we are able to monitor the kinetics of hemifusion and pore formation.

שיטת מדידה של קינטיקס Fusion ויראלי ברמה חלקיק יחיד

Membrane fusion is an essential step during entry of enveloped viruses into cells. Conventional fusion assays typically report on a large number of fusion ...

Direct Analysis of Single Cells by Mass Spectrometry at Atmospheric Pressure

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell types exhibit heterogeneous biochemical makeup depending on their physiological conditions and interactions with the environment. Conventional methods of mass spectrometry (MS) used for the analysis of biomolecules in single cells rely on extensive sample preparation. Removing the cells from their natural environment and extensive sample processing could lead to changes in the cellular composition. Ambient ionization methods enable the analysis of samples in their native environment and without extensive sample preparation.1 The techniques based on the mid infrared (mid-IR) laser ablation of biological materials at 2.94 &mu;m wavelength utilize the sudden excitation of water that results in phase explosion.2 Ambient ionization techniques based on mid-IR laser radiation, such as laser ablation electrospray ionization (LAESI) and atmospheric pressure infrared matrix-assisted laser desorption ionization (AP IR-MALDI), have successfully demonstrated the ability to directly analyze water-rich tissues and biofluids at atmospheric pressure.3-11 In LAESI the mid-IR laser ablation plume that mostly consists of neutral particulate matter from the sample coalesces with highly charged electrospray droplets to produce ions. Recently, mid-IR ablation of single cells was performed by delivering the mid-IR radiation through an etched fiber. The plume generated from this ablation was postionized by an electrospray enabling the analysis of diverse metabolites in single cells by LAESI-MS.12 This article describes the detailed protocol for single cell analysis using LAESI-MS. The presented video demonstrates the analysis of a single epidermal cell from the skin of an Allium cepa bulb. The schematic of the system is shown in Figure 1. A representative example of single cell ablation and a LAESI mass spectrum from the cell are provided in Figure 2.

Single cell analysis is performed by mass spectrometry on plant and animal cells at atmospheric pressure by using a sharpened optical fiber to sample the cells for laser ablation electrospray ionization (LAESI) mass spectrometry.

ניתוח ישיר של תאים בודדים באמצעות ספקטרומטריית מסה בלחץ אטמוספרי

Analysis of biochemicals in single cells is important for understanding cell metabolism, cell cycle, adaptation, disease states, etc. Even the same cell ...

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization (FISH)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 protein variants encoded by the var genes.
The haploid P. falciparum genome harbors approximately 60 different var genes of which only one has been believed to be transcribed per cell at a time during the blood stage of the infection. How such mutually exclusive regulation of var gene transcription is achieved is unclear, as is the identification of individual var genes or sub-groups of var genes associated with different receptors and the consequence of differential binding on the clinical outcome of P. falciparum infections. Recently, the mutually exclusive transcription paradigm has been called into doubt by transcription assays based on individual P. falciparum transcript identification in single infected erythrocytic cells using RNA fluorescent in situ hybridization (FISH) analysis of var gene transcription by the parasite in individual nuclei of P. falciparum IE1.
Here, we present a detailed protocol for carrying out the RNA-FISH methodology for analysis of var gene transcription in single-nuclei of P. falciparum infected human erythrocytes. The method is based on the use of digoxigenin- and biotin- labeled antisense RNA probes using the TSA Plus Fluorescence Palette System2 (Perkin Elmer), microscopic analyses and freshly selected P. falciparum IE. The in situ hybridization method can be used to monitor transcription and regulation of a variety of genes expressed during the different stages of the P. falciparum life cycle and is adaptable to other malaria parasite species and other organisms and cell types.

Analysis of Single-cell Gene Transcription by RNA Fluorescent In Situ Hybridization FISH

Fluorescent in situ hybridization (FISH) to identify mRNA transcripts in individual cells allows analysis of polygenic activity such as the simultaneous transcription of more than one member of the var multigene family in Plasmodium falciparum infected erythrocytes 1. The technique is adaptable and can be used on different types of genes, cells and organisms.

ניתוח של שעתוק גנים מהתא הבודד על ידי RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה (דגים)

Adhesion of Plasmodium falciparum infected erythrocytes (IE) to human endothelial receptors during malaria infections is mediated by expression of PfEMP1 ...

Studying Proteolysis of Cyclin B at the Single Cell Level in Whole Cell Populations

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies during chromosome separation are a hallmark of malignancy and associated with progressive disease 2-4. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a mitotic surveillance mechanism that holds back cells at metaphase until every single chromosome has established a stable bipolar attachment to the mitotic spindle1. The SAC exerts its function by interference with the activating APC/C subunit Cdc20 to block proteolysis of securin and cyclin B and thus chromosome separation and mitotic exit. Improper attachment of chromosomes prevents silencing of SAC signaling and causes continued inhibition of APC/CCdc20 until the problem is solved to avoid chromosome missegregation, aneuploidy and malignant growths1.
Most studies that addressed the influence of improper chromosomal attachment on APC/C-dependent proteolysis took advantage of spindle disruption using depolymerizing or microtubule-stabilizing drugs to interfere with chromosomal attachment to microtubules. Since interference with microtubule kinetics can affect the transport and localization of critical regulators, these procedures bear a risk of inducing artificial effects 5.
To study how the SAC interferes with APC/C-dependent proteolysis of cyclin B during mitosis in unperturbed cell populations, we established a histone H2-GFP-based system which allowed the simultaneous monitoring of metaphase alignment of mitotic chromosomes and proteolysis of cyclin B 6.
To depict proteolytic profiles, we generated a chimeric cyclin B reporter molecule with a C-terminal SNAP moiety 6 (Figure 1). In a self-labeling reaction, the SNAP-moiety is able to form covalent bonds with alkylguanine-carriers (SNAP substrate) 7,8 (Figure 1). SNAP substrate molecules are readily available and carry a broad spectrum of different fluorochromes. Chimeric cyclin B-SNAP molecules become labeled upon addition of the membrane-permeable SNAP substrate to the growth medium 7 (Figure 1). Following the labeling reaction, the cyclin B-SNAP fluorescence intensity drops in a pulse-chase reaction-like manner and fluorescence intensities reflect levels of cyclin B degradation 6 (Figure 1). Our system facilitates the monitoring of mitotic APC/C-dependent proteolysis in large numbers of cells (or several cell populations) in parallel. Thereby, the system may be a valuable tool to identify agents/small molecules that are able to interfere with proteolytic activity at the metaphase to anaphase transition. Moreover, as synthesis of cyclin B during mitosis has recently been suggested as an important mechanism in fostering a mitotic block in mice and humans by keeping cyclin B expression levels stable 9,10, this system enabled us to analyze cyclin B proteolysis as one element of a balanced equilibrium 6.

Metaphase to anaphase transition is triggered through anaphase-promoting complex (APC/C)-dependent ubiquitination and subsequent destruction of cyclin B. Here, we established a system which, following pulse-chase labeling, allows monitoring cyclin B proteolysis in entire cell populations and facilitates the detection of interference by the mitotic checkpoint.

לומד Proteolysis של cyclin B ברמת התא הבודד באוכלוסיות תאים שלמות

Equal distribution of chromosomes between the two daughter cells during cell division is a prerequisite for guaranteeing genetic stability 1. Inaccuracies ...

Measurement of Heme Synthesis Levels in Mammalian Cells

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in various molecular and cellular processes such as gene transcription, translation, cell differentiation and cell proliferation. The biosynthesis levels of heme vary across different tissues and cell types and is altered in diseased conditions such as anemia, neuropathy and cancer. This technique uses [4-14C] 5-aminolevulinic acid ([14C] 5-ALA), one of the early precursors in the heme biosynthesis pathway to measure the levels of heme synthesis in mammalian cells. This assay involves incubation of cells with [14C] 5-ALA followed by extraction of heme and measurement of the radioactivity incorporated into heme. This procedure is accurate and quick. This method measures the relative levels of heme biosynthesis rather than the total heme content. To demonstrate the use of this technique the levels of heme biosynthesis were measured in several mammalian cell lines.

Altered intracellular heme levels are associated with common diseases such as cancer. Thus, there is a need to measure heme biosynthesis levels in diverse cells. The goal of this protocol is to provide a fast and sensitive method to measure and compare the levels of heme synthesis in different cells.

מדידה של רמות הרן סינתזה בתאי יונקים

Heme serves as the prosthetic group for a wide variety of proteins known as hemoproteins, such as hemoglobin, myoglobin and cytochromes. It is involved in ...

Identification of Key Factors Regulating Self-renewal and Differentiation in EML Hematopoietic Precursor Cells by RNA-sequencing Analysis

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as leukemia and lymphoma. Elucidating the mechanisms controlling HSCs self-renewal and differentiation is important for application of HSCs for research and clinical uses. However, it is not possible to obtain large quantity of HSCs due to their inability to proliferate in vitro. To overcome this hurdle, we used a mouse bone marrow derived cell line, the EML (Erythroid, Myeloid, and Lymphocytic) cell line, as a model system for this study.
RNA-sequencing (RNA-Seq) has been increasingly used to replace microarray for gene expression studies. We report here a detailed method of using RNA-Seq technology to investigate the potential key factors in regulation of EML cell self-renewal and differentiation. The protocol provided in this paper is divided into three parts. The first part explains how to culture EML cells and separate Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The second part of the protocol offers detailed procedures for total RNA preparation and the subsequent library construction for high-throughput sequencing. The last part describes the method for RNA-Seq data analysis and explains how to use the data to identify differentially expressed transcription factors between Lin-CD34+ and Lin-CD34- cells. The most significantly differentially expressed transcription factors were identified to be the potential key regulators controlling EML cell self-renewal and differentiation. In the discussion section of this paper, we highlight the key steps for successful performance of this experiment.
In summary, this paper offers a method of using RNA-Seq technology to identify potential regulators of self-renewal and differentiation in EML cells. The key factors identified are subjected to downstream functional analysis in vitro and in vivo.

RNA-sequencing and bioinformatics analyses were used to identify significantly and differentially expressed transcription factors in Lin-CD34+ and Lin-CD34- subpopulations of mouse EMLcells. These transcription factors might play important roles in determining the switch between self-renewing Lin-CD34+ and partially differentiated Lin-CD34- cells.

זיהוי של גורמי מפתח עם הרגולציה עצמית התחדשות והתמיינות בתאי EML המטופואטיות מבשר על ידי ניתוח RNA-רצף

Hematopoietic stem cells (HSCs) are used clinically for transplantation treatment to rebuild a patient&#39;s hematopoietic system in many diseases such as ...

Analysis of LINE-1 Retrotransposition at the Single Nucleus Level

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are inactive due to 5' truncations, ~80-100 of these elements remain retrotransposition competent and propagate to different locations throughout the genome via RNA intermediates. While older L1s are believed to target AT rich regions of the genome, the chromosomal targets of newer, more active L1s remain poorly defined. Here we describe fluorescence in situ hybridization (FISH) methodology that can be used to track patterns of L1 insertion and rates of ectopic L1 incorporation at the single nucleus level. In these experiments, fluorescein isothiocyanate/cyanine-3 (FITC/CY3) labeled neomycin probes were employed to track L1 retrotransposition in vitro in HepG2 cells stably expressing ectopic L1. This methodology prevents errors in the estimation of rates of retrotransposition posed by toxicity and account for the occurrence of multiple insertions into a single nucleus.

Here we employ FISH methodology to track LINE-1 retrotransposition at the single nuclei level in chromosome spreads of HepG2 cell lines stably expressing synthetic LINE-1.

ניתוח של ורטרו-טרנספוזיציה LINE-1 ברמת יחיד Nucleus

Long interspersed nuclear element-1 (Line-1 or L1) accounts for approximately 17% of the DNA present in the human genome. While the majority of L1s are ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

פרוטוקול מעוקב מדמיין ביטוי החלבון ברזולוציה תא יחיד תכשירים לעור הר שלם

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...

Analysis of Beta-cell Function Using Single-cell Resolution Calcium Imaging in Zebrafish Islets

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to hyperglycemia and severe, life-threatening consequences. Understanding how the beta-cells operate under physiological conditions and what genetic and environmental factors might cause their dysfunction could lead to better treatment options for diabetic patients. The ability to measure calcium levels in beta-cells serves as an important indicator of beta-cell function, as the influx of calcium ions triggers insulin release. Here we describe a protocol for monitoring the glucose-stimulated calcium influx in zebrafish beta-cells by using GCaMP6s, a genetically encoded sensor of calcium. The method allows monitoring the intracellular calcium dynamics with single-cell resolution in ex vivo mounted islets. The glucose-responsiveness of beta-cells within the same islet can be captured simultaneously under different glucose concentrations, which suggests the presence of functional heterogeneity among zebrafish beta-cells. Furthermore, the technique provides high temporal and spatial resolution, which reveals the oscillatory nature of the calcium influx upon glucose stimulation. Our approach opens the doors to use the zebrafish as a model to investigate the contribution of genetic and environmental factors to beta-cell function and dysfunction.

Beta-cell functionality is important for blood-glucose homeostasis, which is evaluated at single-cell resolution using a genetically encoded reporter for calcium influx.

ניתוח של תפקוד תאי בטא באמצעות הדמיה הסידן בתא יחיד ברזולוציה איונים דג זברה

Pancreatic beta-cells respond to increasing blood glucose concentrations by secreting the hormone insulin. The dysfunction of beta-cells leads to ...

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &#955; DNA at the Single Molecule Level

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. In single molecule assays for studying DNA-protein interactions, there are two important factors for consideration: the DNA substrate with enough length for easy observation and labeling a protein with a suitable fluorescent probe. 48.5 kb &#955; DNA is a good candidate for the DNA substrate. Quantum dots (Qdots), as a class of fluorescent probes, allow long-time observation (minutes to hours) and high-quality image acquisition. In this paper, we present a protocol to study DNA-protein interactions at the single-molecule level, which includes preparing a site-specifically modified &#955; DNA and labeling a target protein with streptavidin-coated Qdots. For a proof of concept, we choose ORC (origin recognition complex) in budding yeast as a protein of interest and visualize its interaction with an ARS (autonomously replicating sequence) using TIRFM. Compared with other fluorescent probes, Qdots have obvious advantages in single molecule studies due to its high stability against photobleaching, but it should be noted that this property limits its application in quantitative assays.

Visualizing the Interaction Between the Qdot-labeled Protein and Site-specifically Modified &amp;#955; DNA at the Single Molecule Level

Here, we present a protocol to study DNA-protein interactions by total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) using a site-specifically modified &#955; DNA substrate and a Quantum-dot labeled protein.

להמחיש את האינטראקציה בין התווית על-ידי Qdot חלבונים ו- DNA λ ששונה Site-specifically ברמת מולקולה בודדת

The fluorescence microscopy&#160;has made great contributions in dissecting the mechanisms of complex biological processes at the single molecule level. ...