هضم DNAzyme يعتمد على طريقة مفيدة لدراسة وظائف snoRNAs. بل هو طريقة سريعة وبسيطة لتحليل ميثييشن RNA محددة الموقع. يتطلب وجود أوليغنوكليوتيدات الحمض النووي قصيرة والكواشف الأساسية الموجودة في أي مختبر البيولوجيا الجزيئية.
تبدأ بتصميم DNAzyme للتسلسل من الفائدة. العثور على تسلسل RNA أو موقع المثيل المفترض باستخدام قاعدة بيانات مناسبة. لأهداف S.cerevisiae سنورنا، استخدم قاعدة بيانات سنورنا الخميرة.
للعثور على موقع مثيل من الفائدة، على سبيل المثال، موقع snR13 تعتمد على، حدد snR13 واجعل علما موقف النيوكليوتيد المعدلة. أوجد تسلسلاً في المنبع والمصب من النيوكليوتيدات المعدلة باستخدام قاعدة بيانات مناسبة، مثل قاعدة بيانات الجينوم Saccharomyces. البحث عن اسم الجين الهدف.
إذا كان استخدام مقايسة DNAzyme 10 إلى 23 DNAzyme، حدد 10 إلى 15 نوكليوتيدات المنبع والمصب من موقع المثيل. إذا كان استخدام DNAzyme 8-17، حدد 20 النيوكليوتيدات. إنشاء تسلسلات تكميلية من خمسة prime و ثلاثة prime الأسلحة واستخدامها لجناح تسلسل الحفاز DNAzyme على ثلاثة prime و خمسة prime ينتهي.
اطلب الـ DNAzyme كـ (أليوغنوكليوتيد) طبيعي زراعة سلالات الخميرة من الاهتمام في المتوسطة المناسبة والظروف. عندما تصل الخلايا إلى المرحلة الأسية المتوسطة، بيليه لهم عن طريق الطرد المركزي في 1، 000 مرات ز لمدة ثلاث دقائق في أربع درجات مئوية والتخلص من المتوسطة.
المضي قدما مع عزل الجيش الملكي النيبالي وفقا لاتجاهات المخطوطات. ثم، resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 30 ميكرولترات من RNase والمياه الخالية من DNase. ضع الأنبوب على الجليد ومقياس تركيز الحمض النووي الريبي على مقياس ميكروستروفوتو.
لأداء DNAzyme الهضم باستخدام DNAzyme 10 إلى 23، وإعداد مزيج الحضانة مع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي، 200 picomoles من 10 إلى 23 DNAzyme، واحد X 10 إلى 23 حضانة العازلة في حجم إجمالي 10 ميكروليتر. ثم، احتضان الأنابيب على كتلة الحرارة الجافة تعيين إلى 95 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق. بعد ذلك مباشرة، ضع الأنابيب على الجليد واتركها هناك لمدة خمس دقائق.
تدور لفترة وجيزة أسفل الأنابيب ووضعها مرة أخرى على الجليد. إضافة 20 وحدة من مثبط RNase ووضع الأنابيب على كتلة الحرارة الجافة تعيين إلى 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. وفي الوقت نفسه، إعداد خليط التفاعل من خلال الجمع بين خمسة ميكرولترات من أربعة X 10 إلى 23 العازلة رد فعل مع أربعة ميكرولترات من كلوريد المغنيسيوم 300-المولر والمياه ميكرولتر واحد.
سخني مزيج التفاعل هذا على كتلة حرارة جافة منضبطة إلى 37 درجة مئوية. ضع الأنبوب مع مزيج الحضانة على كتلة الحرارة الجافة 37 درجة مئوية وإضافة 10 ميكرولترات من مزيج التفاعل قبل الجفاف. احتضان الخليط في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ومن ثم، وضع الأنبوب على الجليد.
لأداء عملية الهضم DNAzyme باستخدام DNAzyme 8-17, إعداد 1.5 ملليلتر ميكروتيتوب مع خمسة ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في حجم إجمالي قدره ستة ميكرولترات. ثم، إعداد أنبوب منفصل مع 400 picomoles من 8-17 DNAzyme. أثناء العمل، والحفاظ على كلا الأنابيب على الجليد.
نقل كلا الأنابيب إلى كتلة الحرارة الجافة تعيين إلى 95 درجة مئوية واحتضان لهم لمدة دقيقتين. نقل عينة RNA مرة أخرى على الجليد وتدور أسفل الأنبوب مع DNAzyme لمدة خمس ثوان. احتضان DNAzyme في 25 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
في حين أن DNAzyme هو احتضان، وإعداد 10 mircoliters من اثنين X 8-17 العازلة رد الفعل وprewarm ذلك إلى 25 درجة مئوية. إضافة العازلة قبل الدفء إلى أنبوب مع DNAzyme ومن ثم، نقل 14 ميكرولترات من هذا المزيج رد فعل إلى أنبوب مع الجيش الملكي النيبالي، جنبا إلى جنب مع 20 وحدة من مثبط RNase. احتضان رد الفعل في 25 درجة مئوية لمدة ساعتين ومن ثم، وضع الأنبوب على الجليد.
لتنقية الحمض النووي الريبي بعد الهضم DNAzyme، إضافة 350 ميكرولترات من الماء و 400 ميكرولترات من الكلوروفورم إلى أنبوب التفاعل. دوامة لمدة 30 ثانية والطرد المركزي في 20،000 مرات ز لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي، نقل المرحلة العليا إلى أنبوب جديد يحتوي على الإيثانول ملليلتر واحد، 40 ميكرولتر من خلات الأمونيوم 7.5 الولير، وميكر واحد من الجليكوجين.
الوجه أنبوب عدة مرات لخلط واحتضان إما في درجة مئوية سلبية 80 لمدة ساعتين أو في درجة مئوية سلبية بين عشية وضحاها. المضي قدما في تنقية الحمض النووي الريبي وفقا لتوجيهات المخطوطات ومن ثم، إعادة تعليق بيليه رنا في 10 ميكرولتر RNase والمياه الخالية من DNase. ضع أنبوب الحمض النووي الريبي على الجليد مباشرة بعد التنقية.
لتنفيذ RNA electrophoresis، تبدأ عن طريق حل 1.5 غرام من agarose في 127.5 ملليلتر من الماء المقطر مزدوجة عن طريق تسخين الخليط في الميكروويف. ثم، إضافة 15 ملليلتر من 10X MOPS و 7.5 ملليلتر من 37٪ الفورمالديهايد إلى حل agarose. إضافة كمية مناسبة من وصمة هلام إلى حل agarose.
صب agarose في علبة والسماح لها تبرد لمدة 45 دقيقة. إعداد عينات RNA عن طريق الجمع بين 10 ميكرولترات من الحمض النووي الريبي هضم وتنقية مع خمسة microliters من عينة عازلة denaturing و 0.5 ميكرولترات من صبغة التحميل ستة X. احتضان العينات في 70 درجة مئوية لمدة خمس دقائق وبعد ذلك، على الجليد لمدة خمس دقائق.
وضع هلام المعدة في خزان الكهرباء وملء خزان مع واحد X مخزنة. تحميل كامل 15 ميكرولترات من العينة على هلام وتشغيل الجل في 80 فولت حتى بروموثيمول الأزرق يصل إلى 2/3 من طول هلام. تحليل هلام مع التصوير المناسب.
يمكن إثبات قيمة هذه التقنية على نظام النسخ SnoRNA غير قابل للانسخ. إدراج المروج GAL1 غير قابل للتكرار من الجينات snR13 أو snR47 يسمح لتحليل المثيلات التي تعتمد على سنرنا من 25S الريبوزومية RNA. عندما تزرع الخلايا على galactose، يتم وميثي 25S الحمض النووي الريبي في مواقع موجهة سنورنا ويبقى سليما بعد العلاج DNAzyme.
في المقابل، عندما يتم إيقاف التعبير سنورنا بسبب عدم وجود galactose، يحدث DNAzyme الانقسام التابعة. وعلاوة على ذلك، لا يوجد هضم RNA لوحظ في الضوابط من النوع البري منذ التعبير سنرنا هو galactose مستقلة. وقد تم مؤخراً إظهار نشاط الانقسام المعتمد على DNAzyme في تحليل تعديلاتنا في الحمض النووي الريبي النووي في سياق نضج سنورنا.
تم استخدام المقايسة DNAzyme التي تعتمد على إظهار أن عدم وجود معالجة خمسة رؤساء الوزراء وما قبل سنرنا يؤثر على مستويات الميثيل من 25S و 18S rRNA في Saccharomyces cerevisiae. يتطلب هذا البروتوكول استخدام الفينول والكلوروفورم، وهما سامان، وينبغي التعامل معهما تحت غطاء أبخرة.
