The authors thank P. Levin, S. Moriya, S. Foster, and M. Pinho for the gift of strains and antibodies. They also thank L. Ferrand, P. Goodwin, J. Cooper, and B. Dougherty for expert technical assistance. CBW is supported by an Australian National Health and Medical Research Council Senior Research Fellowship (571905). LT was supported by a UTS Chancellors Postdoctoral Fellowship. MPS and ATFL were supported by Australian Postgraduate Awards. This work was supported by an Australian Research Council Discovery Project Grant (DP120102010) to EJH.

<ol>
	<li>Harry, E., Monahan, L., Thompson, L., Kwang, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+Cell+Division+The+Mechanism+and+Its+Precison.">Bacterial Cell Division The Mechanism and Its Precison.</a> Int Rev Cytol. 253, 27-94 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Hell, S. W., Wichmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+diffraction+resolution+limit+by+stimulated+emission+stimulated-emission-depletion+fluorescence+microscopy.">Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy.</a> Opt Lett. 19, 780-782 (1994).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-High+Resolution+Imaging+by+Fluorescence+Photoactivation+Localization+Microscopy.">Ultra-High Resolution Imaging by Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy.</a> Biophys j. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Heilemann, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction-resolution+fluorescence+imaging+with+conventional+fluorescent+probes.">Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes.</a> Angew Chem Int Ed (English). 47, 6172-6176 (2008).</li><li>Bretschneider, S., Eggeling, C., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaking+the+Diffraction+Barrier+in+Fluorescence+Microscopy+by+Optical+Shelving.">Breaking the Diffraction Barrier in Fluorescence Microscopy by Optical Shelving.</a> Phys Rev Lett. 98, 218103 (2007).</li><li>Gustafsson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surpassing+the+lateral+resolution+limit+by+a+factor+of+two+using+structured+illumination+microscopy.">Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy.</a> J. Microsc. 198, 82-87 (2000).</li><li>Gustafsson, M. G. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Resolution+Doubling+in+Wide-Field+Fluorescence+Microscopy+by+Structured+Illumination.">Three-Dimensional Resolution Doubling in Wide-Field Fluorescence Microscopy by Structured Illumination.</a> Biophys J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Schermelleh, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subdiffraction+multicolor+imaging+of+the+nuclear+periphery+with+3D+structured+illumination+microscopy.">Subdiffraction multicolor imaging of the nuclear periphery with 3D structured illumination microscopy.</a> Science. 320, 1332-1336 (2008).</li><li>Heintzmann, R., Cremer, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lateral+modulated+excitation+microscopy:+Improvement+of+resolution+by+using+a+diffraction+grating.">Lateral modulated excitation microscopy: Improvement of resolution by using a diffraction grating.</a> Proc SPIE 3568. , 185-195 (1999).</li><li>Gould, T. J., Burke, D., Bewersdorf, J., Booth, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adaptive+optics+enables+3D+STED+microscopy+in+aberrating+specimens.">Adaptive optics enables 3D STED microscopy in aberrating specimens.</a> Opt Express. 20, 20998-21009 (2012).</li><li>Urban, N. i. c. o. l. a. i. . T., Willig, K. a. t. r. i. n., Hell, S. t. e. f. a. n. . W., N&#228;gerl, U. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+Nanoscopy+of+Actin+Dynamics+in+Synapses+Deep+Inside+Living+Brain+Slices.">STED Nanoscopy of Actin Dynamics in Synapses Deep Inside Living Brain Slices.</a> Biophys J. 101, 1277-1284 (2011).</li><li>Galbraith, C. G., Galbraith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-resolution+microscopy+at+a+glance.">Super-resolution microscopy at a glance.</a> J Cell Sci. 124, 1607-1611 (2011).</li><li>Strauss, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-SIM+Super+Resolution+Microscopy+Reveals+a+Bead-Like+Arrangement+for+FtsZ+and+the+Division+Machinery+Implications+for+Triggering+Cytokinesis.">3D-SIM Super Resolution Microscopy Reveals a Bead-Like Arrangement for FtsZ and the Division Machinery Implications for Triggering Cytokinesis.</a> PLoS biol. 10, e1001389 (2012).</li><li>Adams, D. W., Errington, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+assembly,+maintenance+and+disassembly+of+the+Z+ring.">Bacterial cell division assembly, maintenance and disassembly of the Z ring.</a> Nature Rev Microbiol. 7, 642-653 (2009).</li><li>Boer, P. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+understanding+E+coli+cell+fission.">Advances in understanding E coli cell fission.</a> Curr Opin Microbiol. 13, 730-737 (2010).</li><li>Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+the+physics+of+FtsZ+assembly+and+force+generation.">Modeling the physics of FtsZ assembly and force generation.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 9238-9243 (2009).</li><li>Erickson, H. P., Anderson, D. E., Osawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+in+Bacterial+Cytokinesis+Cytoskeleton+and+Force+Generator+All+in+One.">FtsZ in Bacterial Cytokinesis Cytoskeleton and Force Generator All in One.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 74, 504-528 (2010).</li><li>Lan, G., Wolgemuth, C. W., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Z-ring+force+and+cell+shape+during+division+in+rod-like+bacteria.">Z-ring force and cell shape during division in rod-like bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 104, 16110-16115 (2007).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+Contractile+FtsZ+Rings+in+Liposomes.">Reconstitution of Contractile FtsZ Rings in Liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Osawa, M., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposome+division+by+a+simple+bacterial+division+machinery.">Liposome division by a simple bacterial division machinery.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 11000-11004 (2013).</li><li>Murphy, G. E., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+cryotomography.">Electron cryotomography.</a> BioTechniques. 43, 413-415 (2007).</li><li>Liew, A. T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+plasmid-based+system+that+allows+rapid+generation+of+tightly+controlled+gene+expression+in+Staphylococcus+aureus.">A simple plasmid-based system that allows rapid generation of tightly controlled gene expression in Staphylococcus aureus.</a> Microbiology. 157, 666-676 (2011).</li><li>Riglar, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Super-Resolution+Dissection+of+Coordinated+Events+during+Malaria+Parasite+Invasion+of+the+Human+Erythrocyte.">Super-Resolution Dissection of Coordinated Events during Malaria Parasite Invasion of the Human Erythrocyte.</a> Cell Hos., &amp; Microbe. 9, 9-20 (2011).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> EMBO J. 26, 4694-4708 (2007).</li></ol>

This publication is sponsored by GE Healthcare.

الفلورسنت التصوير الخلية الحية هو أداة قوية تتيح مراقبة التغيرات الدينامية داخل الخلايا مع مرور الوقت. وقد تم تصوير حي من الأحياء الخلية البكتيرية صعبة بسبب حجم الخلايا الصغيرة وانخفاض قدرة الخلايا البكتيرية على تحمل التعرض المتكرر للضوء الإثارة. F3D-SIM توسعت الأدوات المتاحة لاستجواب كل بيولوجيا الخلية ولكن من الضروري القيام بعناية هذه التقنية كما يمكن إدخال القطع الأثرية إذا ما نفذت بشكل سيئ. هناك عدد من الاعتبارات الهامة لنجاح استخدام هذه التقنية. كما هو طريقة التصوير مضان واسعة المجال التي تعتمد على استخدام وظيفة انتشار نقطة ضوء المنبعث، وعدم تطابق مؤشر الانكسار انحراف كروية من الضوء المنبعث يجب تجنبها لتمكين إعادة الإعمار صورة دقيقة. استخدام coverslips من 0.17 مم سمك من نوعية عالية لتجنب اختلاف كثافة إشارة نظرا لسماكة الزجاج التباين في الأغطيةينصح بشدة الشفة. ومن الأهمية بمكان لتقييم بعناية انحراف كروية من الضوء المنبعث أثناء المراحل الأولية من جميع التجارب وضبط معامل الانكسار النفط الغمر حسب الحاجة. هذا قد تختلف من يوم إلى يوم كما أنها تعتمد على كل من درجة الحرارة وتزايد وسائل الإعلام / الركيزة العينة. فإن استخدام زيت غير صحيحة يؤدي إلى إعادة البناء أدنى من الصور مع التحف مثل هالات وإشارات الصدى. في نهاية عملية إعادة الإعمار صورة، لكل مرحلة مقياسا لجودة إعادة الإعمار ويمكن الحصول على &quot;أفضل لائقا للKO زاوية&quot; لكل مرحلة / زاوية الإضاءة. إذا كانت هذه القيمة أقل من 1 لكل زاوية، ثم نوعية بناؤها على الأرجح أن تكون عالية. إذا كانت هذه القيمة فوق 6، فمن الأرجح أن الصورة التي أعيد بناؤها ستحتوي التحف. وتشمل القطع الأثرية المشتركة ط) ظهور خطوط في الصورة التي تتوافقإلى واحدة من زوايا الشبكة. قد يؤدي هذا إشارة من أقل من هذه الزاوية الشبكة. ب) haloing حول الهياكل. قد ينتج هذا عن مستويات متفاوتة جدا من إشارة من الهياكل مشرق مقارنة الهياكل المحيطة بها، وعدم تطابق معامل الانكسار من النفط والعينة أو قد يكون بسبب الهياكل في صورة كونها غير متبلور جدا والتي لا تحتوي على ما يكفي من &quot;هيكل&quot; أن تكون معترف بها من قبل الخوارزمية. ج) &quot;honeycombing&quot; الذي ينتج عن إشارة إلى انخفاض نسبة الضوضاء في الصورة، وعادة بسبب ارتفاع إشارة الخلفية؛ د) الهياكل التي امتدت / ممدود في س ص التي قد تكون بسبب عدم تطابق مؤشر الانكسار النفط والعينة. هذه الأداة من الصعب تمييز للمستخدم عديم الخبرة. فمن المستحسن أن المستخدمين الجدد استشارة باحث SIM من ذوي الخبرة لتقديم المشورة بشأن تفسير الصور والتحليل عند البدء في استخدام هذه التقنية. كما هو الحال مع جميع تجارب التصوير الخلية الحية الفلورسنت، هو استيرادنملة إلى توازن دقيق للمدخلات طاقة الإثارة من أجل تقليل درجة photobleaching من والضيائية من الخلايا مع إشارة كافية الانبعاثات اللازمة لإعادة بناء الصور مع الحد الأدنى من القطع الأثرية. سوف photobleaching من الإفراط (أكبر من 30٪ عبر الاستحواذ ض المكدس واحد) يؤدي إلى نمط شريطية في الصورة أعيد بناؤها. مع استخدام الكاميرات sCMOS والصور فائقة الدقة يمكن بناؤها بنجاح من الصور الخام مع إشارة انبعاثات منخفضة تصل إلى 1،000 التهم فوق الخلفية. هذا يمكن أن تسمح لمرات التعرض قصيرة جدا وبالتالي تقليل photobleaching من وتمكين التقاط السريع لكل إطار. كما أنه يزيد من مقدار الوقت بين الإطارات للخلايا للتعافي من مدخلات طاقة الإثارة. بالإضافة إلى ذلك، كما في الوقت التقاط لكل إطار على حدة يمكن أن تكون قصيرة جدا، يتم تقليل درجة من القطع الأثرية التي أدخلتها &#39;الضبابية&#39; أثناء القبض على الأفراد مع استخدام هذا الأسلوب. هذا فاريمن أوجه 3D-SIM تقدم عددا من المزايا الأخرى خلال فائقة المتاحة وعالية الدقة التصوير تقنيات أخرى للتصوير الحي من قبل علماء الأحياء الخلايا البكتيرية. 2 أضعاف الزيادة في القرار في جميع أبعاد 3 والقدرة على صورة يصل إلى 30 ميكرون في عينة تمكن من تصوير الخلايا البكتيرية (والثدييات) كلها خلال التجربة. تقنيات مثل واحد جزيء التعريب التي يتم تنفيذها عادة في موجة زائل لا يمكن أن تحقق عمق تغلغل في عينة ولا تقدم المعلومات على الخلايا بأكملها. التطورات الحديثة التي تسمح أعماق أخذ العينات أعلى لهذه التقنية قد تؤدي في القرار المحوري أفضل الخلايا بأكملها. بالإضافة إلى ذلك، وتقنيات التعريب واحد جزيء التي تتطلب الآلاف من الصور الخام محدودة أيضا في معدل الإطار الذي يمكن التقاطها وربما تتطلب تسوية بين القبض ومعدل الإطار في نهاية المطاف القرار المكانية التي تحققت، حيث أن القرار المكانية التي سيتم شراؤها تعتمد على عدد من ليلةاليلة المسجلة ضمن مساحة محددة. وخفض عدد الإطارات الملتقطة يؤدي إلى انخفاض القرار المكانية ولكن قد يكون كافيا لتحقيق الاستبانة الزمنية اللازمة لعملية بيولوجية من الفائدة. قد تحتاج كمية الانتعاش مرة بين الإطارات أيضا إلى زيادة للحد الضيائية في الخلايا الحية مما يحد من مدة وتردد في ذلك الوقت سلسلة يمكن الحصول على. تقنيات عالية الدقة مثل المجهر الإلكتروني (EM) أو الإلكترون cryotomography (ECT) عرض قرار زيادة مدى 3D-SIM (وتقنيات المجهر الضوئي فائقة الدقة أخرى) ولكن يجب أن تجرى على عينات ثابتة. لتحديد ومعالجة قد يعرض القطع الأثرية وعدم وضع العلامات قد تجعل من الصعب تفسير. خالية من التسمية ECT على النقيض الفقراء ويمكن تحقيق اختراق أعماق عينة من حوالي 500-200 نانومتر 24، لذلك حتى لو كان البروتين من الفائدة يمكن تحديدها، لا يمكن ملاحظة هيكل البروتين في الخلية البكتيرية بأكملها.حتى عندما يمكن استخدامها في وضع العلامات EM، مثل مع immunogold، يتم إجراء التصوير فقط في 2D. 3D هو تحقيقه فقط مع باجتزاء رقيقة وإعادة الإعمار الحسابية الأقسام. وباجتزاء رقيقة يتطلب فني من ذوي الخبرة ولكن يمكن أن يكون مشكلة وتؤدي إلى قطعة أثرية. مع الخلايا الحية أو ثابتة، 3D-SIM لا تحتاج إلى تكون جزءا لا يتجزأ بطريقة محددة والخلايا يمكن أن تكون على استعداد للتصوير بسرعة في حالة الأم القريب. هذه الطريقة سهلة نسبيا لتنفيذ من قبل الباحثين من ذوي الخبرة في الحد الأدنى المجهر الفلورسنت. التجارب لا يمكن أن يؤديها في وسائل الإعلام التي تدعم وظيفة خلايا صحية طالما أنه لا يتألق أو توليد إشارة الخلفية لا داعي لها. عن الخلايا البكتيرية، وهذا يمكن أن تسمح باستخدام أنواع عديدة من مجمع والحد الأدنى من وسائل الإعلام أو استخدام وسائل الإعلام صلبة أو شبه صلبة للسيطرة على الحركة الخلية البكتيرية. العديد من علماء الأحياء الذين المهندسة بالفعل البروتين الفلوري (FP) اندماج واختبار وظيفةيمكن لهذه اندماج يستغرق فترة تصل هذه التكنولوجيا بسرعة دون مزيد الهندسية والتحقق من صحة مع اندماج FP photoactivatable جديدة. لقد وجدنا، وملاحظة عامة، أن S. كانت العنقودية الذهبية أكثر عرضة للphotobleaching من خلال التصوير مع اندماج FP من B. الرقيقة. استخدام لدينا الأصلي أساليب 3D-SIM، حيث تم إنشاء نمط الشبكة من قبل صريف المادي، كنا قادرين على أداء تصوير الخلايا الحية مع عدد من S. اندماج الذهبية FP. ولكن، مع هذا الأسلوب المتقدم F3D-SIM، كنا قادرين على اندماج هذه الصورة FP وتنفيذ سلسلة زمنية قصيرة لالتقاط ديناميات هذه البروتينات الموسومة. هذا ويرجع ذلك إلى انخفاض مرات التعرض اللازمة للتصوير وزيادة الوقت بين الإطارات للانتعاش خلية الأرجح. OMX السعير 3D-SIM هو التكنولوجيا المتاحة تجاريا التي يمكن تنفيذها بسهولة نسبيا في مختبر واحد أو مرفق التصوير الأساسية. يجب توخي الحذر لأداء الأسلوب لتجنب ARTIحقائق بسبب ضعف إعداد العينات أو ضعف التقاط الصور. بمجرد يتقن هذه التقنية، يمكن إجراء دراسات لبنية البروتين وديناميكية في الكائنات الصغيرة مثل البكتيريا في واحد أو متعدد الألوان مضان.

تم استخدام عدد من تقنيات التصوير المختلفة على مر السنين لدراسة البكتيريا بما في ذلك مختلف الإلكترون المجهري والتقنيات البصرية. في حين يقدم المجهر الإلكتروني عالية للغاية القرار، وصولا الى نانومتر، والحاجة إلى فراغ واستخدام عوامل التباين قد حد من هذه التقنية لعينات الثابتة والمدمجة. ويمكن أيضا إدخال القطع الأثرية بسبب مطول إعداد العينات وهناك حاجة إلى ممارس المهرة لإعداد العينات، وتحليل وتفسير الصور الناتجة. المجهر الضوئي يوفر فوائد بساطة إعداد العينات وتطبيق تسميات متعددة مع السهولة النسبية مقارنة مع المجهر الإلكتروني. باستخدام البروتينات الفلورية وتقارن صبغ، والقدرة على دراسة الخلايا الحية مع مضان المجهري هو ممكن أيضا. مع تحسينات في الاستقرار fluorophore وبروتين فلوري حجم / هيكل مما يؤدي إلى انخفاض سمية الخلايا، فضلا عن التقدم في الكشف عن كاميرا ميتاليكology، المجهري مضان باستخدام أنظمة التصوير مبائر واسعة المجال، وتوسعت بشكل كبير من فهمنا لديناميات المكانية من الخلايا. باستخدام هذه التقنيات، معرفتنا الخلية البكتيرية على مدى السنوات ال 20 الماضية قد تقدم كثيرا إلى نظرة أكثر تفصيلا بكثير مما يكشف عن مستوى عال من التنظيم الهيكلي والبروتين داخل الخلية البكتيرية 1. ومع ذلك، الأساليب التقليدية للالمجهر الضوئي هي حيود محدود، وهذا يعني أن القرار الأصيل هو ما يقرب من نصف الطول الموجي للضوء الإثارة المستخدمة. ونتيجة لذلك، حتى مع النظام التقليدي المجهر الضوئي الأكثر الأمثل، وأفضل قرار الجانبي حوالي 220-250 نانومتر، والقرار المحوري حوالي 500 نانومتر (للمراجعة نرى Schermelleh وآخرون. 2). لعلماء الأحياء الخلايا البكتيرية على وجه الخصوص، وهذا لا يزال يحد بشدة فهمنا للمنظمة المكانية من هذه الخلايا الصغيرة؛ يجري فقط 1-2 ميكرون في بقطرالعطر و1-10 ميكرون في الطول. وهناك أيضا حاجة إلى تقنيات عالية الدقة التي يمكن القيام بها على الخلايا الحية حيث يمكن تحليل السلوك المكاني الديناميكي للبروتين لاستكمال البيانات في المختبر. على مدى العقد الماضي، وضعت عدة تقنيات التصوير مضان فائقة القرار. يصف فائقة قرار المجهري تقنيات التصوير التي على الأقل ضعف القرار الجانبي الحصول عليها مع ضوء المجهر التقليدي، وبالتالي التغلب على حاجز الحيود. هذه التقنيات التلاعب الإضاءة و / أو تحليل الضوء المنبعث لخلق الزيادات الحقيقية في القرار واضح. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - ط) حفز نضوب الانبعاثات المجهري 3 (STED). ب) المجهر واحدة جزيء التوطين، بما في ذلك تقنيات مثل تنشيط ضوئي توطين 4،5 المجهري (PALM)، ستوكاستيك المجهر الضوئي إعادة الإعمار <sتصل&gt; 6 (STORM)، STORM المباشر 7 (dSTORM)، والأرض استنزاف الدولة مع عودة جزيء الفردية 8 (GDSIM). والثالث) إضاءة منظم المجهري 9-12 (SIM). تقدم تقنيات التعريب واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار الجانبي، وصولا الى ما بين 10-40 نانومتر في العينات البيولوجية. في العديد من التطبيقات من جزيء واحد توطين المجهري، وعمق أخذ العينات يقتصر على موجة زائل وتطبيقات أولية STED كانت محدودة أيضا في عمق أخذ العينات. تحسينات ومع ذلك، التطورات الأخيرة مثل استخدام البصريات التكيفية، واستغلال الاستجماتيزم في وظيفة انتشار نقطة في نقاط الاتصال المختلفة، شهدت الكشف عن طائرة متعددة وباستخدام هدفين للاستدلال على الموقف المحوري للضوء المنبعث في كل من محوري قرار وأخذ العينات أعماق في كل جزيء واحد STED توطين 13،14. معدلات الحصول على البيانات لSTED وتقنيات التعريب واحد جزيءهي أيضا بطيئة نسبيا نظرا لعدد كبير من الصور التي تحتاج إلى الحصول عليها لأقصى دقة ممكنة (تصل إلى 50،000 لتقنيات التعريب). هذا الحصول على البيانات بطيئة لا تصلح لتصوير العينات الحية بدون تعديلات المخصصة التي غالبا ما تكون باهظة التكاليف. حاليا تناسب هذه التقنيات اثنين الأمثل للعينات ثابتة (للمراجعة رؤية 2،15)، ومع ذلك، يجري الكثير من العمل لمعالجة هذا القيد. ثلاثي الأبعاد منظم إضاءة المجهر (3D-SIM) هي تقنية واسعة المجال الذي يحسن قرار الجانبي والمحوري على حد سواء مما أدى إلى قرارات ما يقرب من 110 و 280 نانومتر، على التوالي. عمق أخذ العينات هو ما يصل الى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لتصوير الخلايا بأكملها. تباين 3D-SIM التي وضعتها سيدات، أجارد، وGustaffsson على (OMX) منصة بصري المجهر التجريبية يتضمن إلقاء الضوء على عينة مع نمط الشبكة المعروفة التي انتقلت الى مختلف 15مناصب في كل طائرة ض 9-11. يتم قياس هامش في أنماط تموج في النسيج الناتجة التي تم إنشاؤها في الحيز الترددي خارج المنطقة يمكن ملاحظتها. المعلومات من الحيز الترددي هي أعيد بناؤها حسابيا لتوليد فائقة دقة وضوح الصورة المرئية 10،11. السرعة النسبية في الصور الخام التي يمكن الحصول عليها باستخدام هذه التقنية تمكن من تصوير الخلايا الحية. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن العمليات البيولوجية التي تحدث لعلى نطاق ومرة ​​ثانية، فإن معدل الاستحواذ على الصور الخام لا تزال بطيئة جدا لالتقاط التغيرات الدينامية. لالسلاسل الزمنية بمعدل القبض على ثوان، يمكنك اكتساب المتكررة دون وقت كاف يؤدي إلى الانتعاش الضيائية photobleaching من و، وخصوصا خلال التصوير الحي من الخلايا البكتيرية صغيرة. للتغلب على هذه المشاكل، وقد وضعت التطورات الأخيرة لسرعة 3D-SIM (SIM-F3D). نحن هنا وصف أحد يعرف OMX الحريق 16 التي كانت طntroduced في أواخر عام 2011. هذه التكنولوجيا يخلق نمط الإضاءة من دون استخدام شبكة المادية كما كان يستخدم في النظم السابقة. استخدام التدخل ضوء الحزم والتكنولوجيا مصراع الجديدة يسمح لخلق ضوء منقوشة على العينة بطريقة سريعة جدا. تم تعزيز سرعة الحصول على الصور كذلك مع إدخال العلمي مكمل معدن أكسيد أشباه الموصلات (sCMOS) الكاميرات، وخصوصا عندما بالمقارنة مع الكاميرات EMCCD القائمة. أدت هذه التغيرات في معدل الممكن الحصول على الصور من إطار واحد في الثانية لعمق أخذ العينات من 1 ميكرون (512 x 512 بكسل، 9 ض شرائح)، مما يتيح رصد التغيرات الديناميكية التي تحدث داخل الخلايا في غضون ثوان 16. انخفاض واضح في التعرض (الإثارة) مرات للعيش الخلايا باستخدام هذا الأسلوب يسمح إما سلسلة زمنية ممتدة ليتم القبض أو زيادة في معدل الالتقاط. نحن هنا وصف تطبيق F3D-SIM المجهري لexaminالبريد هيكل والحركة الديناميكية للZ حلقة cytokinetic في خلايا اثنين من الأنواع البكتيرية: نموذج كائن العصوية الرقيقة على شكل قضيب والممرض البشري مكوراتي المكورات العنقودية الذهبية. FtsZ هو هيكل الخلية البروتين مثل تويولين التي تلعب دورا رئيسيا في انقسام الخلية في البكتيريا 17،18. فإنه يموضع الى الموقع تقسيم لتوظيف ما لا يقل عن 20 البروتينات الانقسام أخرى، وتشكيل جهاز 17،18 التقسيم، ويعتقد لتوفير القوة لخلية انقباض 19-23. يكشف هذا الأسلوب أن يتم توزيع FtsZ بتباين حول الحلبة Z في كل الكائنات في ترتيب تشبه حبة. حل القضية منذ فترة طويلة سواء من الحلبة Z هو حزام موحدة المستمر حول الخلية، كما تصور من قبل التقليدي المجهري مضان واسعة المجال، أو بنية متقطع كما اقترح الإلكترون البرد التصوير المقطعي (ECT) 24. وتبين لنا كيف أن قدرة 3D-SIM يمكن أن تحسن بشكل كبير فحص المكاني للصغيرة (1قطرها ميكرون) خلايا مستديرة مثل S. الذهبية التي تقسم في ثلاث طائرات عمودية متتالية (س، ص، ض). تظهر الدراسات الوقت الفاصل بين استخدام هذه التقنيات أن هيكل الحلقة Z ديناميكي، مع تغييرات جسيمة منظمة داخل الحلبة، بدلا من جزيئات FtsZ يدخلون ويخرجون من سقالة ثابتة 24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="663">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:161px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Agarose I (Biotecnology grade)</td>
			<td style="width:161px;">AMRESCO</td>
			<td style="width:119px;">0710-500G</td>
			<td style="width:167px;">Used for constructing 2% agarose pads. Use microwave to dissolve agarose in growth media</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">N-(3-Triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(Diethylamino) Phenyl) Hexatrienyl) Pyridinium Dibromide (FM 4-64)</td>
			<td style="width:161px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">T-13320</td>
			<td style="width:167px;">Lipophylic dye used for staining cell membranes.</td>
		</tr>
		<tr height="140">
			<td height="140" style="height:140px;width:216px;">1.5 ml microtube, graduated Natural</td>
			<td>Scientific specialties Inc.</td>
			<td style="width:119px;">1210-00</td>
			<td style="width:167px;">Made from Homopolymer polypropylene, Used to harvest bacterial cells prior to being placed on agarose pads for visualization</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">Luria broth base, Miller&#160;</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">241420</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions. Add 2%?? after autoclaving&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:216px;">BBL Antibiotic assay broth, Antibiotic medium 3</td>
			<td style="width:161px;">BD</td>
			<td style="width:119px;">210932</td>
			<td style="width:167px;">Prepared according to manufacturer&#39;s instructions.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">Adhesive frame</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">ABGAB-0577</td>
			<td style="width:167px;">&#160;Known as Gene Frame with this company. Used to prepare 2% agarose pads (Dimensions: 15x16mm)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:216px;">Microscope cover glass</td>
			<td style="width:161px;">Thermo-Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">111512-9</td>
			<td style="width:167px;">22x22 No 1 Thickness</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:216px;">35 mm diameter petri dish with a glass coverslip bottom</td>
			<td style="width:161px;">World precision instruments</td>
			<td style="width:119px;">FD35-100</td>
			<td style="width:167px;">Known as FluoroDish with this company. Dish: &#216;35mm, Glass: &#216; 23mm, Glass thickness: 0.17 mm, non pyrogenic</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Chloramphenicol</td>
			<td style="width:161px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C0378-25G</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Lincomycin hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:119px;">L6004-5MU</td>
			<td style="width:167px;">Make a 25 mg/ml stock in 50% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Erythromycin&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Boehringer Mannheim GmbH</td>
			<td style="width:119px;">12390120-14</td>
			<td style="width:167px;">Make a 10 mg/ml stock in 95% Ethanol</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Combined Orbital/Linear Shaking waterbath&#160;</td>
			<td style="width:161px;">Grant scientific Instruments</td>
			<td style="width:119px;">OLS-200</td>
			<td style="width:167px;">Shaking speed used for cultures: 215 rpm</td>
		</tr>
		<tr height="80">
			<td height="80" style="height:80px;width:216px;">UV visible Spectrophotometer</td>
			<td style="width:161px;">Shimadzu</td>
			<td style="width:119px;">UV-1601</td>
			<td style="width:167px;">600 nm wavelength was used for measuring Optical density of bacterial cultures</td>
		</tr>
		<tr height="120">
			<td height="120" style="height:120px;width:216px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:161px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5415R</td>
			<td style="width:167px;">Pellets of bacterial culture were obtained by spidding down mid exponentially growing cultures at 8000 for 30 seconds&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Isopropyl &#946;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td>
			<td style="width:161px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">15502-10G</td>
			<td style="width:167px;">Prepare 1M stock and filter sterilze prior to use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">softWoRx software</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;">version 5.0</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:216px;">Imaris data analysis software</td>
			<td style="width:161px;">Bitplane Scientific Software, Bitplane AG</td>
			<td style="width:119px;">version 7.0.0</td>
			<td style="width:167px;">Matlab XTensions included</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">DeltaVision OMX 3D-SIM imaging system fitted with a Blaze module.</td>
			<td style="width:161px;">Applied Precision Inc/A GE Healthcare Company</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Blaze module fitted on OMX V3</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Upright fluorescence microscope</td>
			<td style="width:161px;">Zeiss Axioplan 2&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of the cytokinetic z ring in live bacteria using fast 3d-structured illumination microscopy (f3d-sim)

التصوير من العينات البيولوجية باستخدام المجهر مضان تقدمت بشكل كبير مع التكنولوجيات الجديدة للتغلب على قرار حاجز حيود الضوء السماح فائقة الدقة من العينات الحية. يوجد حاليا ثلاثة أنواع رئيسية من تقنيات فائقة الدقة - حفز نضوب الانبعاثات (STED)، واحدة جزيء التوطين المجهري (بما في ذلك تقنيات مثل النخيل، STORM، وGDSIM)، ومنظم المجهري إضاءة (SIM). في حين تشير توطين تقنيات STED واحد جزيء أكبر الزيادات في القرار، فقد كانت أبطأ لتقديم زيادة سرعات من الحصول على الصور. SIM ثلاثي الأبعاد (3D-SIM) هي واسعة المجال المجهري مضان تقنية أن تقدم عددا من المزايا على حد سواء واحدة جزيء التوطين وSTED. تم تحسين القرار، مع قرارات نموذجية الجانبية ومحوري من 110 و 280 نانومتر، على التوالي وعمق أخذ العينات تصل إلى 30 ميكرون من ساترة، والسماح لالتصوير الخلايا بأكملها. التطورات الأخيرة (سريع 3D-SIM) في التكنولوجيا زيادة معدل التقاط الصور الخام تسمح لالتقاط سريع من العمليات البيولوجية التي تحدث في ثوان، في حين خفض ملموس الصور وphotobleaching من سمية. نحن هنا وصف استخدام واحدة من هذه الطريقة لصورة الخلايا البكتيرية إيواء fluorescently البروتين المسمى cytokinetic FtsZ لاظهار كيف يتم تحليل الخلايا ونوع المعلومات الفريدة التي يمكن أن توفر هذه التقنية.

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

super-resolution-imaging-cytokinetic-z-ring-live-bacteria-using-fast

Research

JoVE Journal

Biology

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

19.8K Views.  University of Technology, Sydney. Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring. 

Video: Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Visualizing Bacteria in Nematodes using Fluorescent Microscopy

Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on earth, nematodes and bacteria form a wide array of symbiotic associations that range from beneficial to pathogenic 1-3. One such association is the mutually beneficial relationship between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, which has emerged as a model system of symbiosis 4. Steinernema nematodes are entomopathogenic, using their bacterial symbiont to kill insects 5. For transmission between insect hosts, the bacteria colonize the intestine of the nematode's infective juvenile stage 6-8. Recently, several other nematode species have been shown to utilize bacteria to kill insects 9-13, and investigations have begun examining the interactions between the nematodes and bacteria in these systems 9.
We describe a method for visualization of a bacterial symbiont within or on a nematode host, taking advantage of the optical transparency of nematodes when viewed by microscopy. The bacteria are engineered to express a fluorescent protein, allowing their visualization by fluorescence microscopy. Many plasmids are available that carry genes encoding proteins that fluoresce at different wavelengths (i.e. green or red), and conjugation of plasmids from a donor Escherichia coli strain into a recipient bacterial symbiont is successful for a broad range of bacteria. The methods described were developed to investigate the association between Steinernema carpocapsae and Xenorhabdus nematophila 14. Similar methods have been used to investigate other nematode-bacterium associations 9,15-18and the approach therefore is generally applicable.
The method allows characterization of bacterial presence and localization within nematodes at different stages of development, providing insights into the nature of the association and the process of colonization 14,16,19. Microscopic analysis reveals both colonization frequency within a population and localization of bacteria to host tissues 14,16,19-21. This is an advantage over other methods of monitoring bacteria within nematode populations, such as sonication 22or grinding 23, which can provide average levels of colonization, but may not, for example, discriminate populations with a high frequency of low symbiont loads from populations with a low frequency of high symbiont loads. Discriminating the frequency and load of colonizing bacteria can be especially important when screening or characterizing bacterial mutants for colonization phenotypes 21,24. Indeed, fluorescence microscopy has been used in high throughput screening of bacterial mutants for defects in colonization 17,18, and is less laborious than other methods, including sonication 22,25-27and individual nematode dissection 28,29.

To study the mutualism between Xenorhabdus bacteria and Steinernema nematodes, methods were developed to monitor bacterial presence and location within nematodes. The experimental approach, which can be applied to other systems, entails engineering bacteria to express the green fluorescent protein and visualizing, using fluorescence microscopy bacteria within the transparent nematode.

تصور البكتيريا في نيماتودا باستخدام المجهر الفلورسنت

 
Symbioses, the living together of two or more organisms, are widespread throughout all kingdoms of life. As two of the most ubiquitous organisms on ...

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

The proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal development in all metazoan organisms. Apoptotic cell clearance is a highly dynamic process intimately associated with cell death; unengulfed apoptotic cells are barely seen in vivo under normal conditions. In order to understand the different steps of apoptotic cell clearance and to compare 'professional' phagocytes - macrophages and dendritic cells to 'non-professional' - tissue-resident neighboring cells, in vivo live imaging of the process is extremely valuable. Here we describe a protocol for studying apoptotic cell clearance in live Drosophila embryos. To follow the dynamics of different steps in phagocytosis we use specific markers for apoptotic cells and phagocytes. In addition, we can monitor two phagocyte systems in parallel: 'professional' macrophages and 'semi-professional' glia in the developing central nervous system (CNS). The method described here employs the Drosophila embryo as an excellent model for real time studies of apoptotic cell clearance.

Live Imaging of Apoptotic Cell Clearance during Drosophila Embryogenesis

Here we describe an effective method for studying dynamics of apoptotic cell clearance in vivo. This method employs live Drosophila embryos as a powerful model for monitoring phagocytosis of apoptotic cells using specific labeling of apoptotic cells and phagocytes.

يعيش التصوير من تخليص الخلية أفكارك أثناء<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مرحلة التطور الجنيني

The  proper elimination of unwanted or aberrant cells through apoptosis and  subsequent phagocytosis (apoptotic cell clearance) is crucial for normal  ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

Specific Labeling of Mitochondrial Nucleoids for Time-lapse Structured Illumination Microscopy

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and several essential mitochondrial polypeptides. Mitochondrial nucleoids divide and distribute within the dynamic mitochondrial network that undergoes fission/fusion and other morphological changes. High resolution live fluorescence microscopy is a straightforward technique to characterize a nucleoid&#39;s position and motion. For this technique, nucleoids are commonly labeled through fluorescent tags of their protein components, namely transcription factor a (TFAM). However, this strategy needs overexpression of a fluorescent protein-tagged construct, which may cause artifacts (reported for TFAM), and is not feasible in many cases. Organic DNA-binding dyes do not have these disadvantages. However, they always show staining of both nuclear and mitochondrial DNAs, thus lacking specificity to mitochondrial nucleoids. By taking into account the physico-chemical properties of such dyes, we selected a nucleic acid gel stain (SYBR Gold) and achieved preferential labeling of mitochondrial nucleoids in live cells. Properties of the dye, particularly its high brightness upon binding to DNA, permit subsequent quantification of mitochondrial nucleoid motion using time series of super-resolution structured illumination images.

The protocol describes specific labeling of mitochondrial nucleoids with a commercially available DNA gel stain, acquisition of time lapse series of live labeled cells by super-resolution structured illumination microscopy (SR-SIM), and automatic tracking of nucleoid motion.

وضع علامات محددة من النيوكليويدات الميتوكوندريا لمرور الوقت المجهر الإضاءة منظم

Mitochondrial nucleoids are compact particles formed by mitochondrial DNA molecules coated with proteins. Mitochondrial DNA encodes tRNAs, rRNAs, and ...