المنحة: 5RO1GM086447-02.

1. تحضير العينة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطعيم وسائل الإعلام LB مع مستعمرة واحدة من سلالة JB281 [BW25113 / pJB042 (P لاك: FtsZ-mEos2)]. تنمو بين عشية وضحاها في شاكر في 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الثقافة 1:1،000 إلى الحد الأدنى من وسائل الإعلام M9 + [M9 الأملاح، السكر بنسبة 0.4٪، 2 مم MgSO 4، 0،1 CaCl 2 مم، الأحماض الأمينية والفيتامينات MEM] وتنمو لمرحلة منتصف سجل (OD 600 = 0،2-0،3) في وجود الكلورامفينيكول (150 ميكروغرام / مل) في درجة حرارة الغرفة (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حمل الثقافة مع 20 ميكرومتر لمدة 2 ساعة IPTG (انظر الملاحظة رقم 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الثقافة في ميكروسنتريفوج (8،000 دورة في الدقيقة، 1 دقيقة) و resuspend في حجم مساو من M9 +؛ تكرار. بعد إعادة تعليق الثاني، مواصلة النمو في RT لمدة 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الثقافة التي يسببها مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني = 7.4) في RT لمدة 40 دقيقة. بيليه الثقافة و resuspend في حجم مساو من PBS؛ تكرار. إذا الخلايا الحية التصوير، انتقل التثبيت والثقافة بيليه، و resuspend مع حجم مساومن M9 - [M9 الأملاح، السكر بنسبة 0.4٪، 2 مم MgSO 4، 0.1 مم CaCl 2، الأحماض الأمينية MEM]؛ تكرار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الخرز الذهب 1:10 مع الثقافة معلق. تطبيق نموذج لغرفة التصوير المعدة (راجع الخطوة 2.4). </li></ol> وقد تم تحسين البروتوكول الحث أعلاه (1،1-1،3 الخطوات) لنظام التعبير عن سلالة JB281: [1] ملاحظة. قد تختلف ظروف الحث مفصلة لأنظمة التعبير الأخرى أو البروتينات من الاهتمام. 2. جمعية التصوير الدائرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل الاغاروز 3٪ (W / V) في M9 -. تذوب الاغاروز في 70 ° C الحرارة في كتلة مقعد بين كبار ل40min. ذاب في متجر الاغاروز C ° 50 لمدة تصل إلى 5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع شريحة microaqueduct نظيفة في النصف العلوي من غرفة التصوير مع الأقطاب أسفل. محاذاة أقل طوقا على الشريحة microaqueduct وذلك لتغطية قنوات الارواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق ~ 50 ميكرولتر من الاغاروز ذوبان إلى مركز من الزجاجالشريحة. أفضل هلام الاغاروز فورا على قطيرة مع ساترة، نظيفة وجافة. السماح للهلام لترسيخ RT في لمدة 30 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنظيف coverslips: ترتيب coverslips في حامل السيراميك ويصوتن لمدة 20 دقيقة في الدورية حمامات من الإيثانول، الأسيتون و1M KOH في وعاء زجاجي. تكرار دورة ثلاث مرات، ليصبح المجموع من 9 sonications، تليها صوتنة درهم واحد في 2 O. تخزين coverslips تنظيف في 2 O. جديدة DH قبل الاستخدام، وتفجير coverslips الجافة مع الهواء تصفيتها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية ساترة، وترك سادة هلام على الشريحة microaqueduct. إضافة على الفور 1 ميكرولتر من العينة خلية ثقافة (راجع الخطوة 1.6) إلى الجزء العلوي من لوحة هلام. انتظر دقيقة 2 ~، مما يسمح لاستيعابها حل عن طريق لوحة هلام. أفضل منصة هلام مع ساترة ونظيفة جديدة جافة. تجميع غرفة التصوير كله وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. </li></ol> 3. الصورة اكتساب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكاميرا، والمجهر الليزر. فتح MetaMorph الناعمةوير (الأجهزة الجزيئية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان المناسب الإثارة / الانبعاثات مرشحات في مسار التصوير (الشكل 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين إعدادات الصلاحيات ليزر والاستحواذ وفقا لذلك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 488 نانومتر ليزر = 15 ميغاواط (انظر الملاحظة رقم 2) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نانومتر ليزر-561 = 75 ميغاواط </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 405 نانومتر ليزر = 2 ميغاواط ± محايدة مرشح الكثافة (انظر ملاحظة # 3) </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قفل غرفة التصوير في المرحلة عبر محول المرحلة التكميلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين منطقة التصوير المناسب (100x100 بكسل) التي يتم مضيئة متجانس من قبل جميع أجهزة الليزر الثلاثة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد منطقة العينة الذي يحتوي على كل الخلايا وعلامات إيمانية (الخرز الذهب) على مقربة ولكن لا تداخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على سطح الخلايا الأقرب إلى ساترة. الحصول على صورة واحدة مع 50 brightfield الوقت مللي التكامل ونقل التركيز 0.5 ميكرومتر في العينة (الشكل 3Ai). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة فرقة مضان أخضر مع الإثارة من N-488<html> م باستخدام الليزر التكامل مللي 50 دوام (الشكل 3Aii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على الفيديو في القناة الحمراء مع الإضاءة المستمر من نانومتر-405-561 والليزر نانومتر. لخلايا ثابتة، يتم استخدام إطار MS معدل 50 لقطة إجمالية قدرها 20،000 (~ مجموع دقيقة 17) مع قوة الليزر 405 نانومتر رفعت من قبل 10٪ ~ كل الأطر 1،000 (انظر الملاحظة رقم 4). لالخلايا الحية، ويستخدم إطار MS 10 معدل ولما مجموعه من 3،000 إطارات (المجموع 30 ثانية ~) في قوة ثابتة ليزر 405 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل التركيز مرة أخرى إلى السطح السفلي للخلايا والحصول على صورة أخرى brightfield كما في الخطوة 3.7. </li></ol> [2] ملاحظة: كثافة مضان المتكاملة للالأخضر من خلية يتناسب طرديا مع العدد الكلي للجزيئات mEos2 FtsZ أعرب في الخلية. يجب أن تبقى قوة الإثارة 488 نانومتر والإعدادات الفرقة اكتساب مضان المستمر لجميع الخلايا بحيث النسبية FtsZ-mEos2 يمكن مقارنة مستويات التعبير في خلايا مختلفة. ontent &quot;&gt; [3] ملاحظة: يتم تصوير الخلايا الثابتة مع الكثافة المحايدة (ND) تصفية (الشكل 1، المكون البصري # 5) في مكان من أجل تحقيق معدل التنشيط بطيئة بحيث يمكن لكل فرد جزيء تحديدها بدقة و تتم إزالة عامل التصفية عند التصوير ND تعيش الخلايا لزيادة معدل التنشيط، مع الحفاظ على احتمال ضعيف من جزيئين يتم تفعيلها في وقت واحد في منطقة حيود محدودة، وأسرع معدل للعيش تطبيق خلايا التصوير هناك حاجة إلى تقليل الوقت اكتساب المجموع، وبالتالي &quot;تجميد&quot; للZ الدائري في الوقت المناسب والحد من تأثير لل photodamage إلى الخلية. [4] ملاحظة: تم ضبط عدد من الأطر المكتسبة لنظامنا وتعتمد على هيكل الخلوية خاصة، ووضع العلامات الكثافة، ومعدل التنشيط وعما إذا كان استنفاد تجمع كامل من fluorophores المهم للتحليل. في الخلايا الحية، من المهم الحصول على عدد كاف من تعريب في فترة قصيرة وذلك اعتبارا من منظمة الشفافية الدوليةلي ممكن لتجنب عدم وضوح الصورة بسبب حركة الهيكل الخلوي. 4. PALM صورة البناء <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد موقف النقطه الوسطى من كل بقعة الكشف عنها. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الصورة إلى كومة ماتلاب (ماثووركس، المؤتمر الوطني العراقي). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اقتصاص صورة إلى كومة المنطقة المحيطة خلية واحدة أن يستبعد كل الخرز الإيمانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عتبة للكشف عن كثافة البقعة التي هي فوق مستوى الخلفية، ولكن دون كثافة بقعة المتوسط. نحن مراعاة هذا التباين في مستوى الخلفية في جميع أنحاء تجربة عن طريق حساب متوسط ​​الكثافة القصوى من تشغيل باستخدام إطار الإطار 150. ثم يتم عتبة شدة لكل إطار من القيم محرف المتوسط ​​على التوالي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح كل من عتبة كل إطار. ويتم تحديد المواقع المحتملين إلى ثلاثة المتاخمة بكسل مع شدة فوق العتبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب كثافة مضان من كل بقعة المحتملين لGaussia ثنائي الأبعادن وظيفة [المعادلة رقم 1] باستخدام خوارزمية المربعات الصغرى غير الخطية (الشكل 2). يتم حساب الدقة توطين كل بقعة باستخدام عدد من الفوتونات الكشف عن [المعادلة رقم 2]. أي بقعة سيئة مناسبا مع دقة الترجمة يتم تجاهل أكبر من 20 نانومتر (خلايا ثابتة) أو 45 نانومتر (الخلايا الحية) (انظر ملاحظة # 5). كما يتم تجاهل أي بقعة مع كثافة أكبر من شقين من شدة نفسه، وربما يعود ذلك إلى بواعث التداخل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخلايا الثابتة، وإزالة الملاحظات المتكررة للجزيء نفسه بتجاهل أي بقعة التي الموقف هو النقطة الوسطى في غضون 45 نانومتر من أي بقعة أخرى التي سبقتها بنسبة 6 إطارات أو أقل. لالخلايا الحية، يتم الاحتفاظ كافة المواقع. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> معايرة الانجراف العينة باستخدام علامة الإيمانية الحركة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المحاصيل منطقة بكسل 10x10 حول علامة الإيمانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> طرح كل عتبة المحددة في 4.1.3 من كل إطار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب الشخصي كثافة في كلالإطار عبر الأقل على مساحة خوارزمية المناسب افتراض شكل ثنائي الأبعاد جاوس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب تشريد النقطة الوسطى بين المواقف النسبية لإطار 1. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصحيح الموقف من النقطة الوسطى كل جزيء فريدة حددت في 4.1 مع انحراف العينة المناسبة في احتساب 4.2. مقارنة الصور brightfield المكتسبة في 3.7 و 3.10. إذا لاحظت خلايا لنقل نسبة إلى علامات إيمانية، يتم طرح البيانات بها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يطغى جميع المناصب تصحيح النقطة الوسطى على صورة واحدة تتألف من وحدات البكسل 15x15 نانومتر. رسم كل جزيء فريدة من نوعها في منطقة وحدة، لمحة جاوس ثنائي الأبعاد تركز على موقف النقطه الوسطى مع انحراف معياري يساوي الدقة التعريب [المعادلة رقم 2]. وهذا يؤدي إلى احتمال خريطة الكثافة، حيث كثافة بكسل ليتناسب مع احتمال العثور على جزيء في هذا بكسل (الشكل 3Aiv). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقارنة الصور إلى صور PALM الفرقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot وCENTROكما هو الحال في المناصب رقم 4.4، ولكن على متن طائرة مع بكسل نانومتر 150x150 وانحراف معياري يساوي 250 نيوتن متر. هذا يولد صورة PALM الذي يحاكي صورة حيود محدودة، والتي يمكن استخدامها لمقارنة لصورة حيود محدودة الفرقة، حصلت في 3.8 (الشكل 3Aiii). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للتأكد من أن الكشف عن جزيئات هي ممثلة للمجتمع كله، قارن الصورة فرقة مجددة (الشكل 3Aiii، خطوة 4.5.1) مع الصورة فرقة مضان التجريبية (الشكل 3Aii، الخطوة 3.8) للتأكد من أن كل الصور تظهر هياكل لهما نفس الشكل والتوجيه والكثافة النسبية. </li></ol></li></ol> [5] ملاحظة: تم تحديد الحد الأدنى المطلوب من الدقة توطين تجريبيا لكل أسلوب التصوير عن طريق التآمر على توضيحات من جميع الجزيئات لعينة معينة، واختيار قطع مناسبة. 5. PALM تحليل الصور <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس Z-خاتم Widtساعة والقطر. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدوير الصورة وذلك لPALM عموديا توجيه المحور طويلة من الخلية (الشكل 4A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من المحاصيل في المنطقة الخلوية التي تحتوي على Z-الحلبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب كثافة التراكمي من خلال إبراز ملف تعريف كثافة على طول محور الخلية الطويل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب كثافة الشخصي لتوزيع جاوس. ويعرف عرض الحلقة كما أقصى عرض الشوط الكامل (FWHM) من توزيع جاوس المجهزة (الشكل 4B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المشروع الشخصي كثافة التراكمي لل5.1.2 على طول محور الخلية قصيرة. ويعرف القطر الدائري وطول الملف الكامل للكثافة (الشكل 4C). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التآمر FtsZ الكثافة (انظر ملاحظة # 6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Replot المواقف كما في النقطة الوسطى (4.4)، ولكن من دون تمويه الملف بحيث يتم إعطاء كل جزيء فريدة من نوعها بقيمة 1 والمخصصة لبكسل واحد المقابلة لموقفها النقطة الوسطى. وبهذه الطريقة، فإن كثافة كلبكسل تمثل العدد الكلي من الجزيئات المكتشفة في أن بكسل. يمكن للصورة أن تكون الكثافة PALM أيضا تصور وجود مؤامرة كفاف (الشكل 5E). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد القرار المكانية. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نظريا، يمكن تحقيقه القرار المكانية: إنشاء PSF ممثل للعينة بأكملها باستخدام متوسط ​​الدقة تحديد توطين جميع الجزيئات التي اكتشفت وتم حساب FWHM (المعادلة رقم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القرار المكانية تجريبيا-المحققة: حساب متوسط ​​التشرد بين الملاحظات تكرار نفس الجزيء. </li></ol></li></ol> [6] ملاحظة: استخدمنا مجموع PALM التأمل الداخلي (TIR-PALM، الشكل 1 و 5) لتقييد تفعيل وإثارة لطبقة رقيقة (~ 200 نانومتر) أعلاه واجهة خلية / الزجاج. وسوف يتم الكشف عن ذلك إلا أن الجزيئات المرتبطة FtsZ الغشاء الأقرب إلى ساترة.

<ol>
	<li>Buddelmeijer, N., Beckwith, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+cell+division+proteins+at+the+E.+coli+cell+center.">Assembly of cell division proteins at the E. coli cell center.</a> Curr. Opin. Microbiol. 5, 553-557 (2002).</li><li>de Boer, P., Crossley, R., Rothfield, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+essential+bacterial+cell-division+protein+FtsZ+is+a+GTPase.">The essential bacterial cell-division protein FtsZ is a GTPase.</a> Nature. 359, 254-256 (1992).</li><li>Lutkenhaus, J. F., Wolf-Watz, H., Donachie, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+of+genes+in+the+ftsA-envA+region+of+the+Escherichia+coli+genetic+map+and+identification+of+a+new+fts+locus+(ftsZ).">Organization of genes in the ftsA-envA region of the Escherichia coli genetic map and identification of a new fts locus (ftsZ).</a> J. Bacteriol. 142, 615-620 (1980).</li><li>Bi, E. F., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FtsZ+ring+structure+associated+with+division+in+Escherichia+coli.">FtsZ ring structure associated with division in Escherichia coli.</a> Nature. 354, 161-164 (1991).</li><li>Erickson, H. P., Taylor, D. W., Taylor, K. A., Bramhill, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+cell+division+protein+FtsZ+assembles+into+protofilament+sheets+and+minirings,+structural+homologs+of+tubulin+polymers.">Bacterial cell division protein FtsZ assembles into protofilament sheets and minirings, structural homologs of tubulin polymers.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 519-523 (1996).</li><li>Osawa, M., Anderson, D. E., Erickson, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstitution+of+contractile+FtsZ+rings+in+liposomes.">Reconstitution of contractile FtsZ rings in liposomes.</a> Science. 320, 792-794 (2008).</li><li>Li, Z., Trimble, M. J., Brun, Y. V., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+FtsZ+filaments+in+vivo+suggests+a+force-generating+role+in+cell+division.">The structure of FtsZ filaments in vivo suggests a force-generating role in cell division.</a> Embo J. 26, 4694-4708 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat. Methods. 6, 131-133 (2009).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+FtsZ-ring+structure+revealed+by+Photoactivated+Localization+Microisocpy+(PALM).">In-vivo FtsZ-ring structure revealed by Photoactivated Localization Microisocpy (PALM).</a> Plos One. , (2010).</li><li>Huecas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+and+geometry+of+FtsZ+polymers:+nucleated+self-assembly+of+single+protofilaments.">Energetics and geometry of FtsZ polymers: nucleated self-assembly of single protofilaments.</a> Biophys. J. , (2007).</li><li>Ma, X., Ehrhardt, D. W., Margolin, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colocalization+of+cell+division+proteins+FtsZ+and+FtsA+to+cytoskeletal+structures+in+living+Escherichia+coli+cells+by+using+green+fluorescent+protein.">Colocalization of cell division proteins FtsZ and FtsA to cytoskeletal structures in living Escherichia coli cells by using green fluorescent protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93, 12998-13003 (1996).</li><li>Dai, K., Lutkenhaus, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+proper+ratio+of+FtsZ+to+FtsA+is+required+for+cell+division+to+occur+in+Escherichia+coli.">The proper ratio of FtsZ to FtsA is required for cell division to occur in Escherichia coli.</a> J. Bacteriol. 174, 6145-6151 (1992).</li><li>Annibale, P., Vanni, S., Scarselli, M., Rothlisberger, U., Radenovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+clustering+artifacts+in+photoactivated+localization+microscopy.">Identification of clustering artifacts in photoactivated localization microscopy.</a> Nat. Meth. 8, 527-528 (2011).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+super-resolution+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy.">Three-dimensional super-resolution imaging by stochastic optical reconstruction microscopy.</a> Science. 319, 810-813 (2008).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

PALM الصور تحتوي على معلومات حول التهم جزيء والمواقف داخل الخلية، مما يسمح تحليل مفصل لتوزيع وترتيب جزيئات البروتين الهدف الذي من الصعب تحقيقه من خلال وسائل أخرى. أدناه الخطوط العريضة ونحن الاحتياطات التي ينبغي اتخاذها لاستخراج معلومات كمية دقيقة مع المحافظة على أهم?...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> اسم الكاشف / المواد </td><td> شركة </td><td> كتالوج رقم </td><td> تعليقات </td></tr><tr><td> 50 × MEM الأحماض الأمينية </td><td> سيجما </td><td> M5550 </td><td></td></tr><tr><td> 100 × MEM الفيتامينات </td><td> سيجما </td><td> M6895 </td><td></td></tr><tr><td> IPTG </td><td> Mediatech </td><td> 46-102-RF </td><td></td></tr><tr><td> 16٪ لامتصاص العرق </td><td> الإلكترون العلوم Micrsocopy </td><td> 15710-S </td><td></td></tr><tr><td> SeaPlaque GTG الاغاروز </td><td> Lonzo </td><td> 50111 </td><td></td></tr><tr><td> 50 نانومتر الذهب الخرز </td><td> المجهرية-Nanospheres </td><td> 790113-010 &lt;/ TD&gt; <td></td></tr><tr><td> FCS2 التصوير غرفة </td><td> Bioptechs </td><td></td><td></td></tr><tr><td> المرحلة محول </td><td> ASI </td><td> I-3017 </td><td></td></tr><tr><td> مقلوب المجهر </td><td> OLYMPUS </td><td> IX71 </td><td></td></tr><tr><td> 1،45 NA، 60X الهدف </td><td> OLYMPUS </td><td></td><td></td></tr><tr><td> IXON EMCCD الكاميرا </td><td> ANDOR التكنولوجيا </td><td> DU897E </td><td></td></tr><tr><td> 488 نانومتر ليزر الياقوت </td><td> متماسك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> -561 نانومتر ليزر الياقوت </td><td> متماسك </td><td></td><td></td></tr><tr><td> 405 نانومتر ليزر CUBE </td><td> متماسك </td><td></td><td></td>
 </tr>
 </tbody>
 </table>

super-resolution imaging of the bacterial division machinery

انقسام الخلايا البكتيرية تتطلب الجمعية المنسق لأكثر من عشر البروتينات الأساسية في midcell 1،2. المركزية في هذه العملية هو تشكيل suprastructure الدائري مثل (Z الدائري) من البروتين FtsZ في خطة تقسيم 3،4. و-Z حلقة تتكون من عدة protofilaments FtsZ واحد الذين تقطعت بهم السبل، وفهم ترتيب protofilaments داخل الدائري Z سوف تقدم نظرة ثاقبة آلية Z الدائري التجمع وظيفتها كما مولد قوة 5،6. ظلت هذه المعلومات بعيد المنال بسبب القيود الحالية في مضان المجهري التقليدية والمجهر الإلكتروني. المجهر مضان التقليدية غير قادرة على توفير صورة عالية الدقة للZ الدائري بسبب الحد حيود الضوء (~ 200 نانومتر). كشف الإلكترون cryotomographic التصوير المنتشرة في protofilaments FtsZ C. الصغيرة الخلايا crescentus 7، ولكن من الصعب تطبيقها على خلايا أكبر مثلكولاي أو B. الرقيقة. نحن هنا وصف تطبيق طريقة فائقة القرار المجهري مضان، Photoactivated المجهر الأقلمة (PALM)، لوصف كميا التنظيم الهيكلي للE. القولونية Z الدائري 8. PALM التصوير يقدم كل وارتفاع القرار المكانية (~ 35 نانومتر) ووضع العلامات المحددة لتمكين تحديد لا لبس فيها من البروتينات المستهدفة. وصفت ونحن FtsZ مع mEos2 بروتين فلوري photoactivatable، التي تتحول من الأخضر مضان (الإثارة = 488 نانومتر) لمضان أحمر (561 نانومتر الإثارة =) عند تفعيل في 405 نانومتر 9. خلال التجربة PALM، يتم تنشيط عشوائيا واحد FtsZ-mEos2 الجزيئات ويتم تحديد المواقف المقابلة النقطة الوسطى للجزيئات واحدة مع الدقة &lt;20 نانومتر. وأعيد بناؤها ثم صورة القرار فائقة للZ الدائري قبل التركيب المواقف النقطة الوسطى من جميع الجزيئات الكشف-mEos2 FtsZ. &lt;ف الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; استخدام هذا الأسلوب، وجدنا أن لديه Z الدائري عرض ثابت من 100 نانومتر ~ ويتكون من حزمة فضفاضة من protofilaments FtsZ التي تتداخل مع بعضها البعض في ثلاثة أبعاد. هذه البيانات توفر نقطة انطلاق لمزيد من التحقيقات من التغييرات دورة الخلية تعتمد على ال 10 Z الدائري ويمكن تطبيقها على البروتينات الأخرى ذات الاهتمام.

هو موضح في الشكل 3Aiv هو ثنائي الأبعاد، مما يجعل القرار فائقة للZ الدائري ولدت من أسلوب التصوير PALM المذكورة أعلاه. أدناه، ونحن تلخيص المعلومات النوعية والكمية التي يمكن الحصول عليها منها. نوعيا، لاحظنا أن Z-الدائري هو بنية ...

Watch this Scientific Journal Video about Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery at JoVE.com

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

وصفنا قرار فائقة التصوير طريقة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للالدائري FtsZ البكتيرية، جهاز ضروري لانقسام الخلية. ويستند هذا الأسلوب على التحليل الكمي للصور توطين photoactivated (PALM) والمجهر يمكن تطبيقها على هيكل الخلية البكتيرية البروتينات الأخرى.

فائقة التصوير القرار من ماكينات شعبة الجرثومي

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

super-resolution-imaging-of-the-bacterial-division-machinery

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  The Johns Hopkins University School of Medicine. وصفنا قرار فائقة التصوير طريقة للتحقيق في التنظيم الهيكلي للالدائري FtsZ البكتيرية، جهاز ضروري لانقسام الخلية. ويستند هذا الأسلوب على التحليل الكمي للصور توطين photoactivated (PALM) والمجهر يمكن تطبيقها على هيكل الخلية البكتيرية البروتينات الأخرى.

Video: Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Electron Cryotomography of Bacterial Cells

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for instance how they generate and maintain specific cell shapes, establish polarity, segregate their genomes, and divide. In order to understand these phenomena, imaging technologies are needed that bridge the resolution gap between fluorescence light microscopy and higher-resolution methods such as X-ray crystallography and NMR spectroscopy.
Electron cryotomography (ECT) is an emerging technology that does just this, allowing the ultrastructure of cells to be visualized in a near-native state, in three dimensions (3D), with "macromolecular" resolution (~4nm).1, 2 In ECT, cells are imaged in a vitreous, "frozen-hydrated" state in a cryo transmission electron microscope (cryoTEM) at low temperature (&lt; -180&deg;C). For slender cells (up to ~500 nm in thickness3), intact cells are plunge-frozen within media across EM grids in cryogens such as ethane or ethane/propane mixtures. Thicker cells and biofilms can also be imaged in a vitreous state by first "high-pressure freezing" and then, "cryo-sectioning" them. A series of two-dimensional projection images are then collected through the sample as it is incrementally tilted along one or two axes. A three-dimensional reconstruction, or "tomogram" can then be calculated from the images. While ECT requires expensive instrumentation, in recent years, it has been used in a few labs to reveal the structures of various external appendages, the structures of different cell envelopes, the positions and structures of cytoskeletal filaments, and the locations and architectures of large macromolecular assemblies such as flagellar motors, internal compartments and chemoreceptor arrays.1, 2
In this video article we illustrate how to image cells with ECT, including the processes of sample preparation, data collection, tomogram reconstruction, and interpretation of the results through segmentation and in some cases correlation with light microscopy.

We illustrate here how to use electron cryotomography (ECT) to study the ultrastructure of bacterial cells in near-native states, to "macromolecular" (~4 nm) resolution.

الإلكترون Cryotomography من الخلايا البكتيرية

While much is already known about the basic metabolism of bacterial cells, many fundamental questions are still surprisingly unanswered, including for ...

Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy techniques. However, as the image is acquired in a very different way than normal, by building up an image molecule-by-molecule, there are some significant challenges for users in trying to optimize their image acquisition. In order to aid this process and gain more insight into how STORM works we present the preparation of 3 test samples and the methodology of acquiring and processing STORM super-resolution images with typical resolutions of between 30-50 nm. By combining the test samples with the use of the freely available rainSTORM processing software it is possible to obtain a great deal of information about image quality and resolution. Using these metrics it is then possible to optimize the imaging procedure from the optics, to sample preparation, dye choice, buffer conditions, and image acquisition settings. We also show examples of some common problems that result in poor image quality, such as lateral drift, where the sample moves during image acquisition and density related problems resulting in the 'mislocalization' phenomenon.

We describe the preparation of three test samples and how they can be used to optimize and assess the performance of STORM microscopes. Using these examples we show how to acquire raw data and then process it to acquire super-resolution images in cells of approximately 30-50 nm resolution.

عينات الاختبار لتحسين STORM فائقة الدقة المجهر

STORM is a recently developed super-resolution microscopy technique with up to 10 times better resolution than standard fluorescence microscopy ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

إعداد عينة للفحص المجهري للقوة الذرية Virion واحد والتصوير الفلوري فائقة الدقة

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy (f3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the diffraction of light allowing super-resolution of live samples. There are currently three main types of super-resolution techniques &#8211; stimulated emission depletion (STED), single-molecule localization microscopy (including techniques such as PALM, STORM, and GDSIM), and structured illumination microscopy (SIM). While STED and single-molecule localization techniques show the largest increases in resolution, they have been slower to offer increased speeds of image acquisition. Three-dimensional SIM (3D-SIM) is a wide-field fluorescence microscopy technique that offers a number of advantages over both single-molecule localization and STED. Resolution is improved, with typical lateral and axial resolutions of 110 and 280 nm, respectively and depth of sampling of up to 30 &#181;m from the coverslip, allowing for imaging of whole cells. Recent advancements (fast 3D-SIM) in the technology increasing the capture rate of raw images allows for fast capture of biological processes occurring in seconds, while significantly reducing photo-toxicity and photobleaching. Here we describe the use of one such method to image bacterial cells harboring the fluorescently-labelled cytokinetic FtsZ protein to show how cells are analyzed and the type of unique information that this technique can provide.

Super-resolution Imaging of the Cytokinetic Z Ring in Live Bacteria Using Fast 3D-Structured Illumination Microscopy f3D-SIM

Spatiotemporal information about dynamic proteins inside live cells is crucial for understanding biology. A type of super-resolution microscopy called fast 3D-structured illumination microscopy (f3D-SIM) reveals unique information about the cytokinetic Z ring in bacteria: both its bead-like appearance and the rapid dynamics of FtsZ within the ring.

فائقة الدقة التصوير من Cytokinetic Z الدائري في البكتيريا تعيش طريق سريع منظم 3D الإضاءة المجهري (F3D-SIM)

Imaging of biological samples using fluorescence microscopy has advanced substantially with new technologies to overcome the resolution barrier of the ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar and sometimes inclusion of specific nutrients in the growth medium. The preparation of such explicit media and surface growth conditions serves to provide the favorable conditions that allow not just bacterial growth but coordinated motility of bacteria over these surfaces within thin liquid films. Reproducibility of swarm plate and other surface motility plate assays can be a major challenge. Especially for more &#8220;temperate swarmers&#8221; that exhibit motility only within agar ranges of 0.4%-0.8% (wt/vol), minor changes in protocol or laboratory environment can greatly influence swarm assay results. &#8220;Wettability&#8221;, or water content at the liquid-solid-air interface of these plate assays, is often a key variable to be controlled. An additional challenge in assessing swarming is how to quantify observed differences between any two (or more) experiments. Here we detail a versatile two-phase protocol to prepare and image swarm assays. We include guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay media preparation and quantification of data from these assays. We specifically demonstrate our method using bacteria that express fluorescent or bioluminescent genetic reporters like green fluorescent protein (GFP), luciferase (lux operon), or cellular stains to enable time-lapse optical imaging. We further demonstrate the ability of our method to track competing swarming species in the same experiment.

Swarming motility is influenced by physical and environmental factors. We describe a two-phase protocol and guidelines to circumvent the challenges commonly associated with swarm assay preparation and data collection. A macroscopic imaging technique is employed to obtain detailed information on swarm behavior that is not provided by current analysis techniques.

التحضير والتصوير، والكمي لالسطحية الجرثومي على الحركة فحوصات

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial resolution is restricted by diffraction to ~ 200 nm within the image plane and &#62; 500 nm along the optical axis. As a result, fluorescence microscopy has long been severely limited in the observation of ultrastructural features within cells. The recent development of super resolution microscopy methods has overcome this limitation. In particular, the advent of photoswitchable fluorophores enables localization-based super resolution microscopy, which provides resolving power approaching the molecular-length scale. Here, we describe the application of a three-dimensional super resolution microscopy method based on single-molecule localization microscopy and multiphase interferometry, called interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM). This method provides nearly isotropic resolution on the order of 20 nm in all three dimensions. Protocols for visualizing the filamentous actin cytoskeleton, including specimen preparation and operation of the iPALM instrument, are described here. These protocols are also readily adaptable and instructive for the study of other ultrastructural features in cells.

Three-dimensional Super Resolution Microscopy of F-actin Filaments by Interferometric PhotoActivated Localization Microscopy iPALM

We present a protocol for the application of interferometric PhotoActivated Localization Microscopy (iPALM), a 3-dimensional single-molecule localization super resolution microscopy method, to the imaging of the actin cytoskeleton in adherent mammalian cells. This approach allows light-based visualization of nanoscale structural features that would otherwise remain unresolved by conventional diffraction-limited optical microscopy.

ثلاثي الأبعاد فائقة الدقة المجهر من الشعيرات F-أكتين من التداخل PhotoActivated التعريب المجهري (iPALM)

Fluorescence microscopy enables direct visualization of specific biomolecules within cells. However, for conventional fluorescence microscopy, the spatial ...

Open-source Single-particle Analysis for Super-resolution Microscopy with VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm allows for the routine imaging of nanoscale biological complexes and processes. This increase in resolution also means that methods popular in electron microscopy, such as single-particle analysis, can readily be applied to super-resolution fluorescence microscopy. By combining this analytical approach with super-resolution optical imaging, it becomes possible to take advantage of the molecule-specific labeling capacity of fluorescence microscopy to generate structural maps of molecular elements within a metastable structure. To this end, we have developed a novel algorithm &#8212; VirusMapper &#8212; packaged as an easy-to-use, high-performance, and high-throughput ImageJ plugin. This article presents an in-depth guide to this software, showcasing its ability to uncover novel structural features in biological molecular complexes. Here, we present how to assemble compatible data and provide a step-by-step protocol on how to use this algorithm to apply single-particle analysis to super-resolution images.

This manuscript uses the Fiji-based open-source software package VirusMapper to apply single-particle analysis to super-resolution microscopy images in order to generate precise models of nanoscale structure.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

Super-resolution fluorescence microscopy is currently revolutionizing cell biology research. Its capacity to break the resolution limit of around 300 nm ...

Ground State Depletion Super-resolution Imaging in Mammalian Cells

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to dramatic leaps in our understanding of how cells function. The development and availability of super-resolution microscopy has considerably extended the limits of optical resolution from ~250-20 nm. Biologists are no longer limited to describing molecular interactions in terms of colocalization within a diffraction limited area, rather it is now possible to visualize the dynamic interactions of individual molecules. Here, we outline a protocol for the visualization and quantification of cellular proteins by ground-state depletion microscopy&#160;for fixed cell imaging. We provide examples from two different membrane proteins, an element of the endoplasmic reticulum translocon, sec61&#946;, and a plasma membrane-localized voltage-gated L-type Ca2+ channel (CaV1.2). Discussed are the specific microscope parameters, fixation methods, photo-switching buffer formulation, and pitfalls and challenges of image processing.

This article outlines a protocol for the detection of one or more plasma and/or intracellular membrane proteins using Ground State Depletion (GSD) super-resolution microscopy in mammalian cells. Here, we discuss the benefits and considerations of using such approaches for the visualization and quantification of cellular proteins.

الدولة الأرض استنفاد القرار فائقة التصوير في خلايا الثدييات

Advances in fluorescent microscopy and cell biology are intimately correlated, with the enhanced ability to visualize cellular events often leading to ...

Application of High-speed Super-resolution SPEED Microscopy in Live Primary Cilium

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function critically in cell motility and signaling. Since cilia are incapable of synthesizing their own protein, nearly 200 unique ciliary proteins need to be trafficked between the cytosol and primary cilia. However, it is still a technical challenge to map three-dimensional (3D) locations of transport pathways for these proteins in live primary cilia due to the limitations of currently existing techniques. To conquer the challenge, recently we have developed and employed a high-speed virtual 3D super-resolution microscopy, termed single-point edge-excitation sub-diffraction (SPEED) microscopy, to determine the 3D spatial location of transport pathways for both cytosolic and membrane proteins in primary cilia of live cells. In this article, we will demonstrate the detailed setup of SPEED microscopy, the preparation of cells expressing fluorescence-protein-labeled ciliary proteins, the real-time single-molecule tracking of individual proteins in live cilium and the achievement of 3D spatial probability density maps of transport routes for ciliary proteins.

Recently we mapped the three-dimensional (3D) spatial locations of transport routes for various proteins translocating inside primary cilia in live cells. Here this paper details the experimental setup, the process of biological samples and the data analyses for the 3D super-resolution fluorescence imaging approach newly applied in live primary cilia.

تطبيق القرار فائقة السرعة سرعة الفحص المجهري في هدب الأولية الحية

The primary cilium is a microtubule-based protrusion on the surface of many eukaryotic cells and contains a unique complement of proteins that function ...

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Quantitative multicolor fluorescence microscopy relies on the careful spatial matching of color channels acquired at different wavelengths. Due to chromatic aberration and the imperfect alignment of cameras, images acquired in each channel may be shifted, and magnified, as well as rotated relative to each other in any of the three dimensions. With the classical calibration method, chromatic shifts are measured by multicolor beads attached to the surface of a coverslip, and a number of software are available to measure the chromatic shifts from such calibration samples. However, chromatic aberration can vary with depth, change with observation conditions and be induced by the biological sample itself, thus hindering determination of the true amount of chromatic shift in the sample of interest and across the volume. Correcting chromatic shifts at higher accuracy is particularly relevant for super-resolution microscopy where only slight chromatic shifts may affect quantitative analyses and alter the interpretation of multicolor images. We have developed an open-source software Chromagnon and accompanying methods to measure and correct 3D chromatic shifts in biological samples. Here we provide a detailed application protocol that includes special requirements for sample preparation, data acquisition, and software processing to measure chromatic shifts in biological samples of interest.

High-Accuracy Correction of 3D Chromatic Shifts in the Age of Super-Resolution Biological Imaging Using Chromagnon

Correction of chromatic shifts in three-dimensional (3D) multicolor fluorescence microscopy images is crucial for quantitative data analyses. This protocol is developed to measure and correct chromatic shifts in biological samples through acquisition of suitable reference images and processing with the open-source software, Chromagnon.