وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعهد الوطني للأبحاث الأسنان والجمجمة (NIDCR) منحة F32 (DE021929) لJLF ومنحة DE016402 NIDCR R01 إلى RAS

1. إعداد الإبر التنغستن <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع قضيب التنغستن في نصف باستخدام قواطع للاسلاك بحيث قضيب لا ينحني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموضوع قضيب حتى نهاية مدبب من 5 3/4 في الزجاج البورسليكات باستور ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك حوالي 3/4 في قضيب الشائكة للخروج من الزجاج، والتمسك قضيب لغيض ماصة مع حبة صغيرة من &quot;لاصقة تذوب الساخنة&quot; (HMA)، وهو عصا الغراء يستخدم لمسدس الغراء. وHMA ينبغي ذاب سريعا في لهب الكحول، مع الحرص على عدم حرق الغراء وتوليد الدخان الاسود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من ملقط، ثني غيض من قضيب التنغستن (حوالي 1/4 في نهاية من أعلى) حتى يتم التوصل إلى زاوية 45 درجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عقد ماصة باستور، ووضع حوالي 1/8 في لغيض من قضيب التنغستن في لهب الشعلة البروبان. عقد غيض ثابت ومتعامدة تماما مع اللهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الإبرة من اللهب لحظة بقعة صغيرة من البرتقال tungsعشرة الذباب الخروج من إبرة. </li></ol> 2. إعداد سبيمان الماصات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام موقد بنسن، تسخين نهاية ضيقة من ماصة باستور الزجاج حتى ما بعد فترة وجيزة من تفتق يبدأ في الذوبان. إزالة من اللهب وسحب غيض حتى يصبح مختومة ماصة. تأكد أنه لا يزال هناك جزء من جزء مدبب يحتوي على ما يقرب من OD 0،7-1،0 مم. كسر نهاية أغلقت حوالي 4 سم من تفتق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نعلق حوالي 2 قدم (60 سم) من أنابيب مطاطية لواسعة (مفتوح) نهاية ماصة. ضربة على الطرف الآخر من الأنبوب المطاطي لضمان عدم وجود الهواء يمكن أن تمر من خلال جزء مدبب من ماصة باستور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام اسطوانة الوقود البروبان مع تعلق لهب الشعلة قلم رصاص، وتسخين مساحة البيضاوي على جانب واحد من ماصة أسفل بداية تفتق. ضربة الهواء بلطف شديد ومستمر من خلال أنابيب المطاط مع كمية ضئيلة من الضغط (حوالي كمية الضغط اللازم أن أقول بداية letteص &quot;P&quot; على مستوى محادثة). عندما يصبح الزجاج الناعمة على جانب واحد ويبدأ في مشبك الخارج، وإزالة بسرعة ماصة من اللهب وضربة الثابت والمطرد من خلال أنابيب المطاط. وسوف يسبب هذا الجزء ساخنة من الزجاج لتشكيل فقاعة على شكل النقانق التي قد البوب، التي على ما يرام. إذا كانت فقاعة صغيرة جدا، في محاولة ذوبان وتهب الزجاج مرة أخرى. ينبغي أن يكون نافذة مفتوحة النهائي في الزجاج نحو 0.25 في (6.35 ملم) واسعة بنسبة 0.5 في (12.7 ملم) لفترة طويلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشيرا نهاية مدبب صعودا، كشط فقاعة في حاوية النفايات الزجاجية في حين تهب بلطف من خلال أنابيب لمنع شظايا الزجاج من دخول ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام لهب البروبان وحرق الحواف المتبقية من فقاعة والنار البولندية الجانبين من نافذة مفتوحة. والحرص على عدم إذابة رمح ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قلم رصاص نقطة الماس، والنتيجة نهاية مدبب من ماصة حوالي 1.25 في (30 ملم) من النافذة وكسر قبالة الطرفمع ملقط بحيث يتم خفض افتتاح ماصة نظيفة (ماصات مع نصائح تجاهل مكسورة أو غير متساو). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط وحافة لهب الموقد من الكحول، وثني الجزء الضيق من ماصة 0.375 في (9.5 ملم) من طرف إلى زاوية من 60 درجة تقريبا بحيث الجزء عازمة هو في الطائرة العمودية عند فتح نافذة هو في موقف 1:00 للاستخدام اليد اليمنى والساعة 11:00 لاستخدام أعسر. تتم هذه الخطوة في أفضل خالية من مشروع ضميمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النار تلميع غيض باستخدام لهب الكحول تحت المجهر تشريح. تأكد من عدم إغلاق قبالة الطرف بل تبقي افتتاح الجولة وسلس دون أي انقباض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع 1 في (25 ملم) قطعة من أنابيب المطاط، رش قطعة من الأنابيب مع الايثانول 70٪، وحرك الأنبوب على رمح من ماصة حتى يتم تغطية افتتاح نافذة تماما. هذا يعمل باسم &quot;الحجاب الحاجز&quot; من ماصة سبيمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لمبة مل اللاتكس المطاط 2على الجزء السفلي المفتوحة للماصة. يحافظ على لمبة الضغط السلبي في ماصة سبيمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لممارسة باستخدام ماصة سبيمان، نقل حبات اللوني حوالي 100-200 ميكرون في القطر من بقعة ملحوظ في واحدة طبق بيتري إلى بقعة ملحوظ في آخر تحت المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتنظيف ماصة سبيمان، وإزالة لمبة المطاط ومكان ماصة، تلميح إلى أسفل، في كوب طويل القامة اصطف مع القطن أو الشاش على الجزء السفلي ومملوءة بالماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية. </li></ol> 3. تعقيم واحتضان البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح البيض مع الايثانول 70٪ ووضع البيض على أطباق البيض من البلاستيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين البيض في حاضنة ساخنة في 37.5 درجة مئوية و 85-87٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان البيض حتى تصل HH9.5، ما يقرب من 26 ساعة لالسمان والبط 48 ساعة ل. </li></ol> 4. نافذة بيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قطعة صغيرة من الغلاف الخارجي من الجزء العلوي من البيض مع ملقط، مع الحرص على عدم ثقب قذيفة الداخلية مembrane. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام حقنة مع 18 G بمقدار 1 بوصة إبرة، كزة حفرة في أضيق غيض من البيض وسحب ما يقرب من 1-2 مل من الزلال. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشريط الشفاف خلال ثقب وثقب علامة في وعاء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع &quot;نافذة&quot; على طول السطح العلوي للبويضة (من خلال الشريط الشفاف) باستخدام مقص المنحني. </li></ol> 5. تصور الأجنة والتحضير للجراحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام قضيب الزجاج، وفرشاة بلطف كمية صغيرة من الأحمر محايد (0.02 جم / مل في BSS هانك) على الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع الغشاء المحي وتسحبه على الجنين باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة ختم البيض عن طريق وضع شريط شفاف على النافذة. </li></ol> 6. فصل الأنسجة المانحة من الأجنة المانحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشريط من نافذة على بيضة الجنين المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لخفض أضعاف العصبية من الأديم الظاهر المتاخمة للجنين المانحة، وجعل الشقوق على حد سواء SIDوفاق في الأنبوب العصبي، وذلك باستخدام إبرة التنغستن شحذ-اللهب (المصنعة كما هو موضح أعلاه). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، وقطع عبر الأنبوب العصبي على المستويين الأمامي والخلفي المطلوب من الكسب غير المشروع وفصل الكسب غير المشروع عن بقية الأنبوب العصبي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة أضعاف العصبية من الجنين المانحة باستخدام ماصة سبيمان أو أي نوع آخر من micropipette. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، قم بإزالة الشريط من نافذة على البيض المضيفة واستخدام ماصة سبيمان لوضع العصبية أضعاف المانحة إلى جانب الجنين المضيف المتاخمة لمنطقة الأنبوب العصبي الذي سيتلقى عملية الزرع. </li></ol> 7. فصل الأنسجة المضيف وزرع الأنسجة المانحة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل أضعاف العصبية من الأنبوب العصبي للجنين المضيف، كما فعلت مع الجهة المانحة. الحرص على إزالة الكسب غير المشروع متساوية في الحجم مثل الأنسجة المانحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دفع برفق هذا النسيج المضيف بعيدا عن الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ثم، مع إبرة التنغستن حادة أو مدورة غيض من ميلcropipette، حرك بلطف العصبية المانحة أضعاف في الأنبوب العصبي المضيفة، والحفاظ على التوجهات انتيرو الخلفي وظهراني بطني المناسبة. تأكد من هو مدسوس الكسب غير المشروع في طول الجانبين ولكن تأكد من عدم لكزة أو الأضرار التي لحقت الأنسجة الكامنة. للمساعدة على ابقاء المسار من المذكرة التوجه الأصلي أي التفاوت في الأنسجة المانحة أو تلطيخ التفاضلية من الأحمر لاشئ. نحن أيضا الصور ثيقة الجنين المانحة مع الأنسجة رفعه المصاحبة لها، فضلا عن الوهم على الفور بعد الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وينبغي أن يضاف ملحي معقم إلى البويضة إذا تبين الجنين المضيف علامات الجفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الآن، بعناية إعادة الختم وتسمية البيض، وبلطف إعادته إلى حاضنة الرطوبة العالية (70-80٪) حيث يمكن للجنين خيالية تطوير إلى المرحلة المطلوبة للتحليل. </li></ol> 8. مجموعة من الوهم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تأكد من جمع الأجنة خيالية في تقدم طازجة تثبيتي الباردة سيرا ووضعها فورا على ريال عمانيCKER في 4 درجات مئوية لO / N التثبيت. وهذا سوف يسمح لمزيد من الكشف عن الخلايا الحساسة السمان مع الأجسام المضادة لمكافحة السمان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليحلل التعبير الجيني عن طريق RT-QPCR، وتجميد الأجنة مباشرة في النيتروجين السائل قبل استخراج الحمض النووي الريبي. </li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

قمة العصبية هي الخلايا الجنينية السكان عابرة أن يهاجر على نطاق واسع في جميع أنحاء الجنين ويفرق في أنواع الخلايا المتنوعة، بما في ذلك غضروفية وبانيات، التي تسهم في الهيكل العظمي القحفي. وقد ساهم زرع قمة العصبية في النظام خيالية السمان البطة إلى حد كبير في فهمنا للتفاعلات الأنسجة ومسارات الإشارات التي تنظم تطوير الهيكل العظمي القحفي. ومع ذلك، وبالنظر إلى الإمكانات الهائلة للقمة العصبية لتوليد خلايا العضلات الملساء أيضا، الخلايا الشحمية، الخلايا الصباغية، وخلايا شوان، والخلايا العصبية، ونظام الوهم السمان بطة لديها امكانات هائلة لتطبيقات المستقبل، لا سيما بالتزامن مع التقدم السريع في بيولوجيا الخلايا الجذعية والطب التجديدي. منذ السمان والبط وكلاهما الأنواع المرباة تجاريا، وإمدادات جاهزة من البويضات المخصبة غير مكلفة نسبيا هو متاح من مجموعة متنوعة من المزارع. وبالتالي، ينبغي أن تكون هذه التقنية في متناول الأبحاث وراتبها العاملة ضمن مجموعة واسعة من الميزانيات ومساحة المنشأة. على الرغم من أن هذه التقنية هي قوية جدا، لا تزال هناك العديد من القيود. مثل تقنيات جراحية أخرى، ونوعية وجدوى الوهم السمان بطة الاعتماد على المهارات الجراحية للباحث، وبالتالي، لن يكون هناك اختلاف بين أكثر وداخل الفرد بين التجارب بالمقارنة مع نماذج أخرى، مثل تلك التي تستخدم الماوس علم الوراثة. وعلاوة على ذلك، هناك أيضا تباين في معدلات التنمية ومراحل الأجنة الفردية التي تسهم في استنساخ ونجاح كل زرع. أجنة الطيور هي أيضا عرضة للجفاف وبالتالي تشمل الخطوات الحاسمة أثناء الجراحة الحفاظ على مستويات الضوء المنخفضة، وهي المرة تحت المجهر إلى أدنى حد ممكن، والبيض مختومة بالشمع قدر الإمكان، وارتفاع نسبة الرطوبة في الحاضنة بعد الجراحة ل تجنب الجفاف. من حيث الجدوى من الوهم، شيو sually بين 50-75٪ البقاء على قيد الحياة، على الرغم من هذه النسب يمكن أن تقلل من كبار السن في مرحلة جمع. في جلسة 4-6 ساعة نموذجية من الجراحة، يمكن للجراح من ذوي الخبرة تولد 10-15 الوهم. نجاح زرع يعتمد أيضا إلى حد كبير على نوعية الأدوات. أدوات جيدة تؤدي إلى أكثر اتساقا، والنتائج استنساخه. باستخدام الشعلة البروبان لجعل الإبر التنغستن يسمح الإبر الحادة للغاية في هذا الشأن. نوع الشعلة تستخدم لإحداث فرق كبير لأنه يتحكم في حجم اللهب. ويمكن أيضا أن تستخدم شحذ كهربائيا، ولكن هذا النهج لا يقترب حتى من إنتاج الإبر الحادة كما. استخدام قضبان التنغستن بدلا من الأسلاك المخزنة مؤقتا بحيث الإبر ويمكن إجراء على التوالي. وmicropipette سبيمان، في حين تستغرق وقتا طويلا وصعبا لجعل، هو أداة مثالية لنقل الأنسجة. يمكن تخصيص ماصة مع فتحات مختلفة الحجم، ويمكن استخدامها مرارا وتكرارا. وثمة عامل حاسم لالنقيبالجا سبيمان micropipette هو أن يكون بعض السوائل في ماصة قبل لمس طرف على سطح الجنين. وبعض من السائل تتدفق دائما عندما يتم الاتصال مع الغضروف المفصلي على الجنين. الضغط على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة السوائل والكسب غير المشروع يمكن إخراجه بدقة متناهية، في حين أن السماح بارتفاع طفيف على الحجاب الحاجز تمتص بلطف الكسب غير المشروع الأنسجة المانحة في ماصة. الحفاظ على القليل من الضغط الايجابي على الحجاب الحاجز تحافظ على الأنسجة الكسب غير المشروع المانحة في غيض من ماصة أثناء النقل، وضغط إضافية قليلة على الحجاب الحاجز يسمح الأنسجة المانحة الكسب غير المشروع لتوضع عمدا في البلد المضيف. لحماية ماصة سبيمان أثناء التخزين والتعقيم، وإزالة لمبة من نهاية واسعة وبعناية إدراج غيض مدبب إلى لمبة. وضع ماصة سبيمان في أنبوب اختبار زجاجي، وتغطي الجزء العلوي مع رقائق الألومنيوم، والأوتوكلاف قبل الجراحة. بعد ماصات متعددة هي إعادةعدي المراد تعقيمها مرة أخرى لإجراء عملية جراحية، عكس الماصات، تسخين منهم تقريبا ليغلي في نفس الحل من الماء المقطر والمنظفات والأواني الزجاجية، ثم شطف مرارا مع الماء المقطر. ماصات الأوتوكلاف في أنابيب الفردية. يجب أن يتم استبدال أنابيب المطاط الذي يشكل الحجاب الحاجز وبعد عدة لمبة المطاط التعقيم أو عندما تصبح مظلمة وقاسية. العديد من مكونات هذا البروتوكول تنطوي المعدات الخطرة. على سبيل المثال، فإن الإجراء لصنع سبيمان Micropipette ينطوي على ثلاثة أنواع من النيران وكذلك التدفئة، وسحب، وتهب، والانحناء، وقطع، وتلميع الزجاج. وبالتالي، وارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (PPE) أن يزيد من السلامة مثل نظارات واقية ومعطف المختبر أمر بالغ الأهمية. بالإضافة إلى ذلك، لأن الكثير من الناس يعانون من، أو لديها القدرة على تطوير والحساسية البيض، ودائما استخدام قفازات عند التعامل مع البيض. مع هذه الاحتياطات في الاعتبار، ونظام خيالية السمان بطة طسا طريقة آمنة وفعالة، ويمكن الوصول إليها نسبيا والتي لديها العديد من التطبيقات المستقبلية.

الهيكل العظمي الوجه يتطور من النمو واندماج العمليات الوجه المتعددة التي تتكون من قمة العصبية وأرومية متوسطة اللحمة المتوسطة محاطة الأدمة والطبقات الظهارية الأديم الباطن 1-11. تخضع الأحداث التخلق في كل عملية من قبل التفاعلات إشارات متميزة بين اللحمة المتوسطة وظهائر المحيطة 12-16. تعديلات على هذه التفاعلات إشارة و / أو المستجيبات المصب على المساهمة في الظواهر والأمراض قد تكون ذات صلة أيضا تطور الهيكل العظمي القحفي 17، 18. لذلك، توضيح توقيت وطبيعة التفاعلات الأنسجة لديها امكانات كبيرة لزيادة فهمنا للبيولوجيا التطورية والتنموية من الهيكل العظمي في الوجه. استخدام الأجنة خيالية للتحقيق في التفاعلات الأنسجة لديها تاريخ طويل في البيولوجيا التطورية. كان رائدا هذا النهج هانز سبيمان ومختبرهالذي اكتشف الجنينية &quot;المنظمين&quot; عن طريق زرع أنسجة الأجنة بين الأنواع البرمائية مختلفة. كان سبيمان على درجة الماجستير من التقنيات الجراحية الدقيقة التي تم استكمالها تطوره من الأدوات المتخصصة، ولا سيما ماصة سبيمان مهارات اليد. وكان فيكتور همبرغر وهو طالب دراسات عليا في مختبر هانز سبيمان في فرايبورغ خلال 1920s، وهو عندما أجريت التجارب زرع الأصلية التي أدت إلى جائزة نوبل سبيمان. عندما انتقلت همبرغر لجامعة واشنطن في سانت لويس في عام 1935، وقال انه مفصل عملية صنع micropipette سبيمان في دليل له من علم الأجنة التجريبية 19. كان درو Noden وهو طالب دراسات عليا في مختبر همبرغر في جامعة واشنطن حتى عام 1972، وبعد انتقاله إلى جامعة ماساشوستس، أمهرست ثم إلى جامعة كورنيل، واصلت Noden افتعال وباستخدام بال micropipettes سبيمان لزرع الجراحية التي تنطوي الوهم السمان-الفرخ. و# 160؛ في حين طالب دراسات عليا، واحدة من الكتاب (ريتش شنايدر) تدرب مع درو Noden في جامعة كورنيل 1995-1998 ويستند البروتوكول التالي لصنع micropipette سبيمان على أوصاف مكتوبة من قبل همبرغر وNoden، وتشمل التعديلات اللاحقة التي بواسطة شنايدر. كان رائدا في استخدام الوهم السمان-الفرخ لدراسة تطوير القحفي وخصوصا لفهم المساهمات من الخلايا العصبية التي كتبها قمة Noden ولو Douarin في أوائل 1970s، استعرض في لو Douarin وآخرون 20. وقد اعتمد هذا النهج على نطاق واسع في العديد من الدراسات والعديد من المحققين الآخرين 1، 4، 5، 21-38. معدلات يعادل النمو والتشكل من السمان وفرخ جعل زرع داخل يجعلها مثالية لدراسة مصير الخلايا وتتبع النسب. ومع ذلك، ونظرا للتشابه بين السمان وفرخ، والتغيرات المورفولوجية دائرة الهجرة والجنسيةuced بواسطة الخلايا المانحة يصعب فك. في المقابل، وشملت غيرها من نظم خيالية الطيور البط المحلية باعتبارها وسيلة لدراسة الآليات التي تجعل الأجنة متميزة تشريحيا 39-50. وبشكل أكثر تحديدا، فإن النظام خيالية السمان بطة يقدم فوائد متعددة لالمميزين آثار المانحة على المضيف، والعكس بالعكس. الأولى، والسمان والبط الأجنة تختلف في حجم الجسم والشكل، والذي يوفر وسيلة مباشرة لاستكشاف أو المانحين آليات المضيف محددة من تشكيل نمط من قبل يعاير للنطاقات الفرق في التعبير الجيني (الشكلان 1 A و B). الثانية، والسمان والبط الأجنة لديهم معدلات مختلفة إلى حد كبير من النضج، مع السمان تفقيس في 17 يوما والبط تفقيس في 28 يوما. يحافظ على قمة العصبية المزروعة معدل نضوج الجوهرية في إطار البيئة المضيفة، وبالتالي، تحديد التغيرات الزمانية في التعبير الجيني، والتفاعلات الأنسجة، وتكون الأنسجة، والتشكل من الممكن51-57. وأخيرا، فإن الأجسام المضادة النووية المضادة للالسمان (س ¢ PN) يسمح المانحة والمضيفة المساهمات الخلوية لتكون متميزة عن بعضها البعض بشكل دائم من خلال الاعتراف البروتين الذي يتم التعبير بتواجد مطلق في خلايا السمان ولكن غاب عن خلايا بطة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">1x PBS</td>
			<td style="width:180px;">TEK</td>
			<td style="width:145px;">TEKZR114</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Hank&#8217;s BSS w/o Phenol Red</td>
			<td style="width:180px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:145px;">14025-092</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Neutral Red</td>
			<td style="width:180px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:145px;">N4638-5G</td>
			<td style="width:252px;">.22&#181;m filter-sterilized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">18G Needles</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">305195</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">5 ml syringe</td>
			<td style="width:180px;">BD</td>
			<td style="width:145px;">309646</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">No. 5 Dumont forceps</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">11252-20</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Straight Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14028-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Curved Scissors</td>
			<td style="width:180px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:145px;">14029-10</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Spemann Pipet</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Hand-made in lab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Egg holder</td>
			<td style="width:180px;"></td>
			<td style="width:145px;"></td>
			<td style="width:252px;">Glass ashtray and modeling clay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Alcohol burner</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">04-245-1</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:169px;">Transparent tape</td>
			<td style="width:180px;">3M Scotch</td>
			<td style="width:145px;">600</td>
			<td style="width:252px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Glass Stirring Rod</td>
			<td style="width:180px;">Fisher</td>
			<td style="width:145px;">11-380C</td>
			<td style="width:252px;">Tip is narrowed and rounded using a flame</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:169px;">Tungston wire (.004 x 3 inches)</td>
			<td style="width:180px;">A-M Systems</td>
			<td style="width:145px;">7190</td>
			<td style="width:252px;">Tip is flame-sharpened in a propane torch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bunsun burner</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;S49117</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Pasteur pipette</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>&#160;22-183-632</td>
			<td>9-inch (229 mm)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:169px;">rubber tubing</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>14-178C</td>
			<td style="width:252px;">amber, thin wall natural rubber; wall thickness: 0.0625 inches/1.6 mm; O.D.: 0.375 inches/9.5 mm; I.D.: 0.25 inches/6.4mm</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">&#160;Propane fuel cylinder</td>
			<td>BernzOmatic</td>
			<td>UL2317</td>
			<td style="width:252px;">&#160;TX-9 with torch style &#34;A&#34; with a screw-on brass &#34;pencil flame&#34; torch&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Diamond point pencil</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>&#160;22-268912</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Rubber bulbs</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>S32325</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing species-specific contributions to craniofacial development using quail-duck chimeras

توليد أجنة خيالية هو نهج واسع النطاق وقوية لدراسة مصير الخلايا والتفاعلات الأنسجة، والمساهمات أنواع محددة إلى النسيجي والتنمية المورفولوجية للأجنة الفقاريات. على وجه الخصوص، وقد أنشأت استخدام الأجنة خيالية على أهمية قمة العصبية في توجيه التشكل أنواع محددة من مجمع القحفي. الطريقة الموصوفة هنا يستخدم اثنين من أنواع الطيور والبط والسمان، مع مختلف بشكل ملحوظ التشكل القحفي. هذا الأسلوب يسهل كثيرا من التحقيق في تنظيم الجزيئية والخلوية من نمط أنواع محددة في مجمع القحفي. تجارب في السمان والبط الأجنة خيالية وقد كشفت بالفعل العصبية التفاعلات الأنسجة بوساطة قمة والسلوكيات خلية مستقلة التي تنظم نمط أنواع محددة في الهيكل العظمي القحفي، الجهاز العضلي، وإهاب. التنوع الكبير في المشتقات قمة العصبية تقترح إمكانية كبيرةللتطبيقات المستقبلية لنظام خيالية السمان بطة لفهم تطور الفقاريات، والمرض، والتطور.

قبل إجراء مزيد من التحليل، وكفاءة عملية الزرع يحتاج إلى أن يعاير. لالنسيجي وتحليل الصرفي، أو التعبير الجيني على عينات الأنسجة، ويجب أن يتم الكشف عن الخلايا المناعية باستخدام السمان التي كتبها س ¢ PN الضد كما هو موضح 36. لتحليلات الحمض النووي الريبي، والمساهمات أنواع محددة لأنسجة الفائدة يمكن حسابها باستخدام إستراتيجية تعتمد PCR-58. بعد أن تم التحقق من صحة فعالية عملية الزرع، يمكن تقييم نتائج المزيد من التدابير الشكلية أو الجزيئية في الوهم. التفاعلات بين الخلايا العصبية قمة المانحة والأنسجة المحيطة المستمدة من المضيفة التي تكمن وراء تكون الأنسجة السليمة والتشكل من مجمع القحفي سبق دراستها على نطاق واسع. على وجه الخصوص، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يوجه التشكل أنواع محددة من الوجه 7، 13، 51، 59، 52 نمط الريش، ونمط العضلات 56 </s<html> تصل&gt;، والغضاريف 53 و 57 من خلال تنظيم التعبير الجيني المضيف. على سبيل المثال، العصبية قمة اللحمة المتوسطة يملي عندما أشكال العظام في الفك السفلي من خلال تنظيم زمنيا BMP4 التعبير 55. في الآونة الأخيرة، وتركزت التحقيقات على التفاعلات التي تحدث في الأنسجة تطوير القحفي في وقت مبكر جدا. في هذا الصدد، وقد أظهرت التجارب باستخدام الوهم السمان بطة الأجنة المضيفة تؤثر الهجرة قمة العصبية من خلال تحديد الحدود المورفولوجية. وهذا هو، في الأجنة quck خيالية السمان المانحة الخلايا العصبية قمة تهاجر إلى المضيف بطة قوس الفك السفلي في نمط مثل بطة (1D الشكل). على الرغم من هذه المساهمة المضيف لحجم السكان قمة العصبية، لا تزال قمة العصبية المانحة لإنشاء هيكل عظمي الفك السفلي الذي هو في حجم وشكل (الشكل 1E) مثل السمان. ه 1 &quot;لل: محتوى العرض =&quot; 6in &quot;FO: SRC =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1highres.jpg &quot;سرك =&quot; / files/ftp_upload/51534/51534fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1. السمن بطة نظام همي. (A) السمان و (B) عرض جماجم بطة اختلافات كبيرة في الحجم والشكل، وبالتالي، هي مناسبة بشكل مثالي لاستخدام نظام خيالية لدراسة تطوير القحفي (معدلة من تقية وآخرون 56). (C) تصميم التجريبية لتوليد من جانب واحد الأجنة quck خيالية من مطابقة المرحلة HH9.5 السمان والبط الأجنة. تتم إزالة حظيرة العصبية من جانب واحد من الأجنة السمان وزرعها في أجنة البط بعد قطعة يعادل أضعاف العصبية تمت إزالة (D) الخلايا المانحة السمان (الأخضر) يمكن اتباعها في الوهم باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة السمان (Q ¢ PN) كما هو مبين في عرض بطني من HH12 الجنين خيالية. (F) في الفك السفلي quck في HH38، والسمان المانحة المستمدة ميكل7، ق الغضروف هو أقصر وأكثر استقامة من تلك التي لوحظت لبطة المستمدة من المضيفة غضروف ميكل المقابل، الذي هو أكبر والمنحنية. طبع Tokita آخرون، ديف. الحيوي. 306، 377 (2007) بإذن من السيفير.

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras at JoVE.com

Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

توضح هذه المقالة طريقة لتوليد أجنة خيالية التي تم تصميمها لاختبار المساهمات أنواع محددة من قمة العصبية و / أو الأنسجة الأخرى في التنمية القحفي.

تقييم مساهمات أنواع محددة لتنمية الجمجمة عن طريق الوهم السمان بطة

The generation of chimeric embryos is a widespread and powerful approach to study cell fates, tissue interactions, and species-specific contributions to ...

assessing-species-specific-contributions-to-craniofacial-development

Research

JoVE Journal

Biology

10.8K Views.  University of California at San Francisco.  توضح هذه المقالة طريقة لتوليد أجنة خيالية التي تم تصميمها لاختبار المساهمات أنواع محددة من قمة العصبية و / أو الأنسجة الأخرى في التنمية القحفي. 

Video: Assessing Species-specific Contributions To Craniofacial Development Using Quail-duck Chimeras

Development of New Therapeutic Applications Using Microfluidics

تطوير تطبيقات علاجية جديدة باستخدام على microfluidics

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system is valuable for the pre-clinical in vivo evaluation of putative antitumor compounds.
The 4T1 cell line has been engineered to constitutively express the firefly luciferase gene (luc2). When mice carrying 4T1-luc2 tumors are injected with Luciferin the tumors emit a visual light signal that can be monitored using a sensitive optical imaging system like the IVIS Spectrum. The photon flux from the tumor is proportional to the number of light emitting cells and the signal can be measured to monitor tumor growth and development. IVIS is calibrated to enable absolute quantitation of the bioluminescent signal and longitudinal studies can be performed over many months and over several orders of signal magnitude without compromising the quantitative result.
Tumor growth can be monitored for several days by bioluminescence before the tumor size becomes palpable or measurable by traditional physical means. This rapid monitoring can provide insight into early events in tumor development or lead to shorter experimental procedures.
Tumor cell death and necrosis due to hypoxia or drug treatment is indicated early by a reduction in the bioluminescent signal. This cell death might not be accompanied by a reduction in tumor size as measured by physical means. The ability to see early events in tumor necrosis has significant impact on the selection and development of therapeutic agents.
Quantitative imaging of tumor growth using IVIS provides precise quantitation and accelerates the experimental process to generate results.

In vivo Bioluminescent Imaging of Mammary Tumors Using IVIS Spectrum

Mammary tumor cells expressing luciferase are implanted subcutaneously in mice and visualized using optical imaging to monitor tumor growth and development non-invasively in a longitudinal study.

في التصوير Bioluminescent المجراة من أورام الثدي باستخدام IVIS الطيف

4T1 mouse mammary tumor cells can be implanted sub-cutaneously in nu/nu mice to form palpable tumors in 15 to 20 days. This xenograft tumor model system ...

Tissue Targeted Embryonic Chimeras: Zebrafish Gastrula Cell Transplantation

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups of cells in a larger context are altered.  Watching how one cell interacts with and behaves in a unique environment is essential to characterizing cell functions.  Determining how the localized misexpression of a specific protein influences surrounding cells provides insightful information on the roles that protein plays in a variety of developmental processes.  Our lab uses the zebrafish model system to uniquely combine genetic approaches with classical transplantation techniques to generate genotypic or phenotypic chimeras.  We study neuron-glial cell interactions during the formation of forebrain commissures in zebrafish. This video describes a method that allows our lab to investigate the role of astroglial populations in the diencephalon and the roles of specific guidance cues that influence projecting axons as they cross the midline. Due to their transparency zebrafish embryos are ideal models for this type of ectopic cell placement or localized gene misexpression. Tracking transplanted cells can be accomplished using a vital dye or a transgenic fish line expressing a fluorescent protein. We demonstrate here how to prepare donor embryos with a vital dye tracer for transplantation, as well as how to extract and transplant cells from one gastrula staged embryo to another.  We present data showing ectopic GFP+ transgenic cells within the forebrain of zebrafish embryos and characterize the location of these cells with respect to forebrain commissures.  In addition, we show laser scanning confocal timelapse microscopy of Alexa 594 labeled cells transplanted into a GFP+ transgenic host embryo.  These data provide evidence that gastrula staged transplantation enables the targeted positioning of ectopic cells to address a variety of questions in Developmental Biology.

Zebrafish cell transplantation enables the combination of genetics and embryology to generate tissue specific chimeras. This video demonstrates gastrula staged cell transplantations that have allowed our lab to investigate the roles of astroglial populations and specific guidance cues during commissure formation in the forebrain.

الأنسجة الجنينية الوهم المستهدفة : اسماك الزرد المعيدة زرع الخلايا

Certain fundamental questions in the field of developmental biology can only be answered when cells are placed in novel environments or when small groups ...

Dechorionation of Medaka Embryos and Cell Transplantation for the Generation of Chimeras

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of the vertebrate genome functions. Manipulation of medaka embryos, such as dechorionation, mounting embryos for imaging and cell transplantation, are key procedures to work on both medaka and zebrafish in a laboratory. Cell transplantation examines cell autonomy of medaka mutations. Chimeras are generated by transplanting labeled cells from donor embryos into unlabeled recipient embryos. Donor cells can be transplanted to specific areas of the recipient embryos based on the fate maps 3 so that clones from transplanted cells can be integrated in the tissue of interest during development. Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. In this video, we show detailed procedures to manipulate medaka embryos.

Due to the hard chorion and soft embryos, manipulation of medaka embryos is more involved than in zebrafish. This video shows step-by-step procedures for how to manipulate medaka embryos, including dechorionation, mounting in agarose for imaging and cell transplantation for the production of chimeras. These procedures are essential to use medaka and zebrafish in a laboratory to take full advantage of their complementary features for the genetic dissection of vertebrate genome functions.

Dechorionation الجنين الميداكا وزرع الخلايا لتوليد الوهم

Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the three vertebrate model organisms in ...

Closed System Cell Culture Protocol Using HYPERStack Vessels with Gas Permeable Material Technology

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice. HYPERStack vessels allow closed system scale up from the current stacked plate products and delivers >2.5X more cells in the same volumetric footprint. The HYPERStack vessels function via gas permeable material which allows gas exchange to occur, therefore eliminating the need for internal headspace within a vessel. The elimination of headspace allows the compartment where cell growth occurs to be minimized to reduce space, allowing more layers of cell growth surface area within the same volumetric footprint.
For many applications such as cell therapy or vaccine production, a closed system is required for cell growth and harvesting. The HYPERStack vessel allows cell and reagent addition and removal via tubing from media bags or other methods.
This protocol will explain the technology behind the gas permeable material used in the HYPERStack vessels, gas diffusion results to meet the metabolic needs of cells, closed system cell growth protocols, and various harvesting methods.

An Introduction into the technology, protocol and handling of the Corning HYPERStack Vessels and accessories used for high yield adherent cell culture. The protocol will show how to use the closed system vessels for increasing cell harvesting over current stacked plate products.

مغلق الثقافة خلية بروتوكول النظام باستخدام السفن HYPERStack مع تقنية الغاز مادة نافذ

Large volume adherent cell culture is currently standardized on stacked plate cell growth products when microcarrier beads are not an optimal choice.   ...

Assessing Signaling Properties of Ectodermal Epithelia During Craniofacial Development

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue interactions that regulate patterning and morphogenesis of vertebrates (e.g., 1, 2, 3, 4). Here, we illustrate a method that exploits this accessibility to test the signaling and patterning properties of ectodermal tissues during facial development. In these experiments, we create quail-chick 5 or mouse-chick 6 chimeras by transplanting the surface cephalic ectoderm that covers the upper jaw from quail or mouse onto either the same region or an ectopic region of chick embryos. The use of quail as donor tissue for transplantation into chicks was developed to take advantage of a nucleolar marker present in quail but not chick cells, thus allowing investigators to distinguish host and donor tissues 7. Similarly, a repetitive element is present in the mouse genome and is expressed ubiquitously, which allows us to distinguish host and donor tissues in mouse-chick chimeras 8. The use of mouse ectoderm as donor tissue will greatly extend our understanding of these tissue interactions, because this will allow us to test the signaling properties of ectoderm derived from various mutant embryos.

This article describes a tissue transplantation technique that was designed to test the signaling and patterning properties of surface cephalic ectoderm during craniofacial development.

تقييم خصائص اشارة من الظهارة الأدمة خلال التنمية الجمجمة

The accessibility of avian embryos has helped experimental embryologists understand the fates of cells during development and the role of tissue ...

Electroporation of Craniofacial Mesenchyme

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. For example, electroporation has been used with great success to study neural and retinal development in Xenopus, chicken and mouse 1-10. However, it is important to note that in all of these studies, investigators were not targeting soft tissues. Because we are interested in craniofacial development, we adapted a method to target facial mesenchyme.
When we searched the literature, we found, to our surprise, very few reports of successful gene transfer into cartilaginous tissue. The majority of these studies were gene therapy studies, such as siRNA or protein delivery into chondrogenic cell lines, or, animal models of arthritis 11-13. In other systems, such as chicken or mouse, electroporation of facial mesenchyme has been challenging (personal communications, Dept of Craniofacial Development, KCL). We hypothesized that electroporation into procartilaginous and cartilaginous tissues in Xenopus might work better. In our studies, we show that gene transfer into the facial cartilages occurs efficiently at early stages (28), when the facial primordium is still comprised of soft tissue prior to cartilage differentiation.
Xenopus is a very accessible vertebrate system for analysis of craniofacial development. Craniofacial structures are more readily visible in Xenopus than in any other vertebrate model, primarily because Xenopus embryos are fertilized externally, allowing analyses of the earliest stages, and facilitating live imaging at single cell resolution, as well as reuse of the mothers 14. Among vertebrate models developing externally, Xenopus is more useful for craniofacial analysis than zebrafish, as Xenopus larvae are larger and easier to dissect, and the developing facial region is more accessible to imaging than the equivalent region in fish. In addition, Xenopus is evolutionarily closer to humans than zebrafish (&tilde;100 million years closer) 15. Finally, at these stages, Xenopus tadpoles are transparent, and concurrent expression of fluorescent proteins or molecules will allow easy visualization of the developing cartilages. We anticipate that this approach will allow us to rapidly and efficiently test candidate molecules in an in vivo model system.

Craniofacial cartilages develop in close contact with other tissues and are difficult to manipulate in live animals. We are using electroporation to deliver molecular tools during growth of the craniofacial skeleton while bypassing early embryonic effects. This approach will allow us to efficiently test candidate molecules in vivo.

Electroporation من اللحمة المتوسطة الجمجمة

Electroporation is an efficient method of delivering DNA and other charged macromolecules into tissues at precise time points and in precise locations. ...

A Semi-quantitative Approach to Assess Biofilm Formation Using Wrinkled Colony Development

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a biofilm, bacterial cells often exhibit altered physiology, including enhanced resistance to antibiotics and other environmental stresses 1. Additionally, biofilms can play important roles in host-microbe interactions. Biofilms develop when bacteria transition from individual, planktonic cells to form complex, multi-cellular communities 2. In the laboratory, biofilms are studied by assessing the development of specific biofilm phenotypes. A common biofilm phenotype involves the formation of wrinkled or rugose bacterial colonies on solid agar media 3. Wrinkled colony formation provides a particularly simple and useful means to identify and characterize bacterial strains exhibiting altered biofilm phenotypes, and to investigate environmental conditions that impact biofilm formation. Wrinkled colony formation serves as an indicator of biofilm formation in a variety of bacteria, including both Gram-positive bacteria, such as Bacillus subtilis 4, and Gram-negative bacteria, such as Vibrio cholerae 5, Vibrio parahaemolyticus 6, Pseudomonas aeruginosa 7, and Vibrio fischeri 8.
The marine bacterium V. fischeri has become a model for biofilm formation due to the critical role of biofilms during host colonization: biofilms produced by V. fischeri promote its colonization of the Hawaiian bobtail squid Euprymna scolopes 8-10. Importantly, biofilm phenotypes observed in vitro correlate with the ability of V. fischeri cells to effectively colonize host animals: strains impaired for biofilm formation in vitro possess a colonization defect 9,11, while strains exhibiting increased biofilm phenotypes are enhanced for colonization 8,12. V. fischeri therefore provides a simple model system to assess the mechanisms by which bacteria regulate biofilm formation and how biofilms impact host colonization.
In this report, we describe a semi-quantitative method to assess biofilm formation using V. fischeri as a model system. This method involves the careful spotting of bacterial cultures at defined concentrations and volumes onto solid agar media; a spotted culture is synonymous to a single bacterial colony. This 'spotted culture' technique can be utilized to compare gross biofilm phenotypes at single, specified time-points (end-point assays), or to identify and characterize subtle biofilm phenotypes through time-course assays of biofilm development and measurements of the colony diameter, which is influenced by biofilm formation. Thus, this technique provides a semi-quantitative analysis of biofilm formation, permitting evaluation of the timing and patterning of wrinkled colony development and the relative size of the developing structure, characteristics that extend beyond the simple overall morphology.

We provide a simple, semi-quantitative method to investigate biofilm formation in vitro. This method takes advantage of the Zeiss stemi 2000-C Dissecting Microscope (with camera attachment) to monitor both the timing and pattern of biofilm formation, as assessed by the development of wrinkled colonies.

مقاربة شبه كمي لتقدير تشكيل بيوفيلم طريق تجعد التنمية مستعمرة

Biofilms, or surface-attached communities of cells encapsulated in an extracellular matrix, represent a common lifestyle for many bacteria. Within a ...

Conversion of a Capture ELISA to a Luminex xMAP Assay using a Multiplex Antibody Screening Method

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life science research and clinical diagnostics. However, ELISA has limitations. It is typically performed in a 96-well microplate, and the wells are coated with capture antibody, requiring a relatively large amount of sample to capture an antigen of interest . The large surface area of the wells and the hydrophobic binding of capture antibody can also lead to non-specific binding and increased background. Additionally, most ELISAs rely upon enzyme-mediated amplification of signal in order to achieve reasonable sensitivity. Such amplification is not always linear and can thus skew results.
In the past 15 years, a new technology has emerged that offers the benefits of the ELISA, but also enables higher throughput, increased flexibility, reduced sample volume, and lower cost, with a similar workflow 1, 2. Luminex xMAP Technology is a microsphere (bead) array platform enabling both monoplex and multiplex assays that can be applied to both protein and nucleic acid applications 3-5. The beads have the capture antibody covalently immobilized on a smaller surface area, requiring less capture antibody and smaller sample volumes, compared to ELISA, and non-specific binding is significantly reduced. Smaller sample volumes are important when working with limiting samples such as cerebrospinal fluid, synovial fluid, etc. 6. Multiplexing the assay further reduces sample volume requirements, enabling multiple results from a single sample.
Recent improvements by Luminex include: the new MAGPIX system, a smaller, less expensive, easier-to-use analyzer; Low-Concentration Magnetic MagPlex Microspheres which eliminate the need for expensive filter plates and come in a working concentration better suited for assay development and low-throughput applications; and the xMAP Antibody Coupling (AbC) Kit, which includes a protocol, reagents, and consumables necessary for coupling beads to the capture antibody of interest. (See Materials section for a detailed list of kit contents.)
In this experiment, we convert a pre-optimized ELISA assay for TNF-alpha cytokine to the xMAP platform and compare the performance of the two methods 7-11. TNF-alpha is a biomarker used in the measurement of inflammatory responses in patients with autoimmune disorders.
We begin by coupling four candidate capture antibodies to four different microsphere sets or regions. When mixed together, these four sets allow for the simultaneous testing of all four candidates with four separate detection antibodies to determine the best antibody pair, saving reagents, sample and time. Two xMAP assays are then constructed with the two most optimal antibody pairs and their performance is compared to that of the original ELISA assay in regards to signal strength, dynamic range, and sensitivity.

An ELISA can be easily converted to a Luminex xMAP assay and, through the benefits of multiplexing, several antibodies can be screened simultaneously to identify an optimum antibody pair, resulting in increased sensitivity and dynamic range, while reducing assay cost.

تحويل لالتقاط ELISA لفحص xMAP Luminex باستخدام فحص الجسم المضاد الطريقة ملتيبليكس

The enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) has long been the primary tool for detection of analytes of interest in biological samples for both life ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

تقييم الشريان المقاومة الفئران وظيفة عن طريق الضغط تخطيط العضل

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...