وأيد هذا العمل من قبل المعهد الوطني للصحة منح # 1R01CA120825-01A1، والأبحاث التعاونية الطبية الحيوية (CBR) برنامج في جامعة ماساتشوستس في امهرست، والمنح الدراسية لIsenberg بوشان J. Toley. نحن نعترف بامتنان المساهمة القيمة من شافر جيمس، مصور فيديو، الراوي، ورئيس تحرير هذا الفيديو.

1. جهاز التصنيع واستند تكرار الميزات ميكروفلويديك في المواد المرنة على طريقة وصفها دافي وآخرون .. 1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستومر مزيج (polydimethylsiloxane؛ PDMS) وكيل علاج من سيليكون إلاستومر كيت (داو كورنينج وميدلاند، MI) في نسبة الوزن وأكثر من صب 09:01 الرئيسي لتشكيل طبقة سميكة 4 مم. ديغا لإزالة فقاعات الهواء وعلاج الخليط في C ° 60 لمدة 5 ساعات. قشر الشفاء من PDMS العفن للحصول على ختم من الميزات تدفق على المطاط الصناعي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شنت الثقوب لكمة لمداخل ومنافذ باستخدام 1.5 مم خزعة لكمة (Miltex، نيويورك، PA) على الصحافة الحفر. سحب أي حطام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إخضاع الجانب ملامح الطابع وشريحة زجاجية نظيفة لالأوكسجين البلازما لمدة 8 دقائق في الأكسجين مطبوع البلازما. جعل الأسطح المعالجة في الاتصال فورا لتشكيل رابطة بينهما. الحفاظ على الجمعية العامة في C ° 60 على الأكثر دفئا الشريحة لا يقل عن 5 ساعةق لتعزيز السندات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاتصال 0،032 &quot;أنابيب PTFE ID (كول Parmer، فيرنون هيلز، IL) إلى مداخل ومنافذ باستخدام واجهة من قفل الأنبوب ذكر الموصلات تعلق على الإناث الشائكة موصلات قفل الأنبوب (Qosina، إيدجوود، NY). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء الجمعية تدفق باستخدام صمامات اغلاق وموصل Y-(أبتشيرتش العلمية، اوك هاربور، WA، الشكل 1). تركيب جهاز إلى المجهر. إرفاق الحقن باستخدام أنابيب ل20G 1.5 &quot;الإبر (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD). </li></ol> 2. تشكيل الأجسام الشبه الكروية الموحدة وتم تشكيل الأجسام الشبه الكروية من خلال طريقة قطرة شنقا 2،3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين الخلايا تحت غطاء الخلية الثقافة العقيمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أجهزة الطرد المركزي الخلايا trypsinized في 2000 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق و resuspend في المتوسط ​​مل 6 الطازجة. تخفيف محلول المخزون إلى تركيز النهائي المطلوب (الجدول 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الغطاء من 48 لوحة جيدا ووضعه رأسا على عقب في الظريفrilized غطاء محرك السيارة. مناطق دائرية المقابلة لكل جيدا واضحة على الغلاف. ملء كل بئر من لوحة مع 1 مل من الماء المعقم للحفاظ على الرطوبة. وضع قطرة 20 ميكرولتر من الحل الخلية المخففة في كل منطقة دائرية باستخدام micropipette. عكس بعناية غطاء ووضعه على لوحة جيدا، وضمان أن لا تلمس قطرات حواف الآبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان لوحة جيدا في C ° 37 لعدد محدد من الأيام (الجدول 1). وسوف تشكل كروي في كل قطرة شنقا. </li></ol> 3. إدخال الأجسام الشبه الكروية في جهاز الرجوع إلى الشكل 1 والجدول 2 لهذا القسم. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم الجهاز عن طريق التنظيف مع الايثانول 70٪ من خلال عرض مدخل التدفق. وبعد ذلك، طرد مع PBS تليها HEPES مخزنة خلية ثقافة المتوسط. ترك الحقنة F S المتوسطة تعلق على الأنابيب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم 2-3 الأجسام الشبه الكروية في حقنة P S، اضغط حقنة لإزالة فقاعات الهواء، ونعلق على مدخل التعبئة للجهاز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح صمام مدخل V دبوس وإغلاق مؤشرات مالية V. فتح منفذ العبوس V صمام إغلاق وفوت V. عقد حقنة التعبئة الرأسية مع الإبرة نحو الانخفاض؛ مشاهدة الأجسام الشبه الكروية كما تترسب في القاع من المحقنة إلى الأنبوب الموصل للقفل الإبرة. دفع المكبس على حقنة التعبئة والأجسام الشبه الكروية ووتش إدخال الأنبوب وتصب في الجهاز. فقط لأن صمام مأخذ التعبئة مفتوحة، وسوف كروي دخول غرفة الجهاز ويتم الاحتفاظ من قبل المشاركات في الجزء الخلفي (الشكل 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إغلاق مدخل صمام V دبوس ومنفذ العبوس V صمام. تحميل F S الحقنة على مضخة الحقنة. فتح صمام صمام V مؤشرات مالية وفوت V. تدفق المتوسطة في الجهاز في 3 ميكرولتر / دقيقة. </li></ol> 4. إدخال عامل موت الخلايا المبرمج الكشف عن (CaspGLOW) بعد التعبئة غرف مع الأجسام الشبه الكروية، والسماح للموازنة شف إلى 24 ساعة لإنشاء تدرجات المغذيات وmicroenvironments، قبل تقديم كشف الخلايا أو العوامل العلاجية. لأن الأنسجة في غرف على اتصال مع الجدران التي لا يمكن اختراقها من أعلى وأسفل، لا توجد التدرجات المغذيات على طول سمك (0.15mm) من الأنسجة. بعد 24 ساعة من الحضانة، وجميع طبقات الخلايا على طول سمك الأنسجة وبالتالي تعادل عدم التجانس الوحيد هو في اتجاه بعيدا عن قناة التدفق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اغلاق مؤشرات مالية V، ووقف ضخ حقنة، حقنة إزالة F S من المضخة واستبدالها حقنة وجود المتوسطة تحتوي على 0.25 ميكروليتر / مل من CaspGLOW الأحمر بالموقع كاسباس-3 علامة (الحمراء DEVD-FMK؛ Biovision، ماونتن فيو، CA). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مسح يدويا 0،7 مل من هذا الحل من خلال الجهاز لضمان تشريد أقدم المتوسط. تحميل الحقنة على مضخة، أعد تشغيل التدفق، ومؤشرات مالية مفتوحة V. على مدى فترة من 5-8 ساعات، وموت الخلايا المبرمج كشف وكيل ينشر في رانه نسيج وfluoresces أكثر إشراقا في مناطق أفكارك. ويحتفظ وكيل موت الخلايا المبرمج في الكشف عن هذا التركيز في كل الحلول تدفق اللاحقة في الجهاز. </li></ol> ملاحظة: <ol class="lroman" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن التأكد من عدم التجانس الأنسجة عن طريق الحصول على ملفات تعريف كثافة خطية من مضان كما هو موضح في القسم 6. يجب أن تظهر ملامح التدرجات المكانية في موت الخلايا المبرمج، مؤكدا أن الأنسجة غير المتجانسة فيما يتعلق بقاء الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> CaspGLOW الخضراء بالموقع كاسباس-3 علامة (فلوريسئين DEVD--FMK؛ Biovision) ويمكن أيضا أن تستخدم لكشف الخلايا. هذه العلامة يحتوي على فلوريسئين fluorophore الأخضر بدلا من الأحمر رودامين fluorophore. </li></ol> 5. إدخال عامل علاجي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اتبع الإجراء في الخطوات 4،1-4،2 لإنتاج 10 هيدروكلوريد دوكسوروبيسين ميكرومتر (دوكس؛ سيغما الدريخ، سانت لويس، MO) تحتوي على كشف وكيل موت الخلايا المبرمج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تواصل تدفق therapeUTIC حل كيلا لفترة محددة من الزمن. اغلاق صمام V مؤشرات مالية وإيقاف المضخة حقنة. استبدال المحاقن العلاج مع حقنة تحتوي على موت الخلايا المبرمج المتوسطة الطازجة كشف وكيل. تسمح تدفق المتوسطة الطازجة لمدة 24 -36 ساعة في حين رصد مستمر النسيج تحت المجهر. </li></ol> 6. الوقت الفاصل بين المجهري وتقدير معاملات انتشارية المخدرات للحصول على البيانات مضان أنظف، والحصول على جميع الصور من خلال التركيز المجهر على الطبقات السفلي من الأنسجة. لأنه لا توجد التدرجات المغذيات في الاتجاه العمودي (انظر القسم 4)، وطبقات السفلي من الخلايا ممثلي جيدة من جميع الطبقات الأخرى أعلاه. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعملية الاستحواذ الآلي كامل باستخدام برنامج نصي مخصص في IPLab (BD العلوم البيولوجية، روكفيل، MD). الحصول على الصور المنقولة الخفيفة ومضان من كروي معبأة على التكبير 10x كل 30 دقيقة (الشكل 3A). Acquirه صورة من مضان الخلفية قبل إدخال دوكس. لاستيعاب الحجم الكبير لللغرفة (1000 × 300 ميكرومتر ميكرومتر)، والحصول على صورتين المجاورة والبلاط معا 4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقدير معاملات رياضية انتشارية المخدرات، فإن الخطوة الأولى هي لتوليد متوسط ​​كثافة التشكيلات الخطية من مضان دوكس باستخدام يماغيج. تحديد منطقة مستطيلة ذات الاهتمام (ROI) تشمل الأنسجة في الغرفة. استخدم الأمر مؤامرة الشخصي لإنشاء ملف تعريف من شدة المتوسط ​​بوصفها وظيفة من المسافة من قناة التدفق. كرر لمدة تصل إلى 3 نقاط زمنية مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على صورة خلفية مضان قبل إدخال دوكس لقياس تألق ذاتي من الأنسجة. طرح مضان الخلفية متوسط ​​كثافة من كثافة التشكيلات التي تم الحصول عليها وتطبيع كل من شدة الشخصي الحد الأقصى للحصول على المقابلة <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq0.jpg" alt="ج" /> (خ، ر) (الشكل 3B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الخطوة التالية هي تقييم فعالية معامل الانتشار D من دوكس داخل أنسجة الورم. يمكن أن تكون ممثلة من قبل دوكس نشر المعادلة 5 التالية <img src="/files/ftp_upload/2425/2425eq1.jpg" alt="المعادلة 1"/> حيث erfc هي وظيفة مكملة الخطأ، x هو المسافة في الأنسجة من القناة، وحان الوقت بعد ر إدخال دوكس (راجع الشكل رقم 3). استخدم ما يلي مخطط تكراري في كل نقطة تعتبر الوقت: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخمين قيمة لD </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب الجانب الأيمن من المعادلة في كل مكان X </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب مجموع الأخطاء مربع (المتبقية) بين الجانبين </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعديل D لتقليل المتبقية </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​القيم الأمثل للD تم الحصول عليها في كل نقطة من الوقت لتقدير متوسط ​​معامل الانتشار الفعال للدوكس في الأنسجة. </li></ol> 7. ممثل النتائج: &lt;ف الطبقة = &quot;jove_content&quot;&gt; الأجهزة ميكروفلويديك تقديم 1MM X 0.3mm 0.15mm X بصريا غرف ثقافة الوصول إليها لنمو أنسجة الورم ثلاثي الأبعاد. تم نقل الأجسام الشبه الكروية متعددة الخلايا السرطانية في هذه الدوائر وكانت تحتفظ بها وظيفتين مرشح في الخلف. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية من حجم ثابت وشكل من عدة خطوط الخلايا. كانت تزرع بنجاح الأجسام الشبه الكروية على الجهاز لمدة تصل إلى 3 أيام. ارتبط النمو في غرف مع تعديل استنساخه من microenvironments داخل الأجسام الشبه الكروية. حدث موت الخلايا المبرمج في الخلايا أقل على مقربة من القناة وتدفق أعلى أعمق في الأنسجة. تم استخدام جهاز لتقدير معامل انتشار دوكسوروبيسين في أنسجة الورم. القيمة التي تم الحصول عليها من 8.75 X 10 -7 -1 سم S 2 تتفق مع قيمة قدرها 9.1 X 10 -7 سم 2 ث -1 عنها سابقا 6 في سرطان الثدي البشرية. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> خلية الخط </td><td> مطلوب خلية تركيز </td><td> حضانة الزمن </td></tr><tr><td> LS174T </td><td> 300 خلية / ميكرولتر </td><td> 2-3 أيام </td></tr><tr><td> T47D </td><td> 750 خلية / ميكرولتر </td><td> 3-4 أيام </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> 150 خلية / ميكرولتر </td><td> 5-6 أيام </td></tr></tbody></table> الجدول 1. معلمات لإسقاط الأجسام الشبه الكروية المعلقة <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> جزء </td><td> وصف </td></tr><tr><td> S F </td><td> تدفق الحقنة </td></tr><tr><td> S P </td><td> التعبئة الحقنة </td></tr><tr><td> V مؤشرات مالية </td><td> تدفق مدخل صمام </td></tr><tr><td> V الدبوس </td><td> التعبئة صمام مدخل </td></tr><tr><td> V فوت </td><td> تدفق صمام المخرج </td></tr><tr><td> V العبوس </td><td> التعبئة صمام المخرج </td></tr></tbody></table> الجدول 2. صمامات الحقن وتدفق في الإعداد <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1 تخطيطي للمؤشرات مالية الإعداد V V وتدفق فوت: مدخل التدفق وصمامات منفذ؛ V V دبوس والعبوس: مدخل تغليف وصمامات منفذ؛ S F S وP: تدفق الحقن والتعبئة. وتستخدم الحقنة التعبئة والتغليف مدخل ومخرج الصمامات عند جوا كروي في الغرفة. وتستخدم الحقنة تدفق وتدفق وصمامات مدخل مخرج لتدفق المتوسطة في وقت لاحق. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig2.jpg" alt="الشكل 2" /> الشكل 2. التخطيطي لكروي المحاصرين في غرفة على الجهاز. وتدفقت A كروي في غرفة على الجهاز ويتم حظرها بواسطة نقاط البيع تصفية 2TS في الجزء الخلفي من الغرفة. <img src="/files/ftp_upload/2425/2425fig3.jpg" alt="الشكل 3" /> الشكل 3. دوكسوروبيسين نشرها في أنسجة الورم على الجهاز. مدموجة A. تنتقل الصورة الفلورية ضوء أحمر والنسيج، والتي تبين موقع وتركيز دوكسوروبيسين (باللون الأحمر). شريط النطاق يمثل 250 ميكرون. B. تطبيع الملف الشخصي كثافة مضان خطية من دوكسوروبيسين.

<ol>
	<li>Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Prototyping+of+Microfluidic+Systems+in+Poly(dimethylsiloxane).">Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane).</a> Anal. Chem. 70, 4974-4984 (1998).</li><li>Kelm, J. M., Timmins, N. E., Brown, C. J., Fussenegger, M., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+generation+of+homogeneous+multicellular+tumor+spheroids+applicable+to+a+wide+variety+of+cell+types.">Method for generation of homogeneous multicellular tumor spheroids applicable to a wide variety of cell types.</a> Biotechnol. Bioeng. 83, 173-180 (2003).</li><li>Timmins, N. E., Nielsen, L. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+multicellular+tumor+spheroids+by+the+hanging-drop+method.">Generation of multicellular tumor spheroids by the hanging-drop method.</a> Methods. Mol. Med. 140, 141-151 (2007).</li><li>Kasinskas, R. W., Forbes, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhimurium+specifically+chemotax+and+proliferate+in+heterogeneous+tumor+tissue+in+vitro.">Salmonella typhimurium specifically chemotax and proliferate in heterogeneous tumor tissue in vitro.</a> Biotechnol. Bioeng. 94, 710-721 (2006).</li><li>Walsh, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multipurpose+microfluidic+device+designed+to+mimic+microenvironment+gradients+and+develop+targeted+cancer+therapeutics.">A multipurpose microfluidic device designed to mimic microenvironment gradients and develop targeted cancer therapeutics.</a> Lab. Chip. 9, 545-554 (2009).</li><li>Lankelma, J., Fernandez Luque, R., Dekker, H., Schinkel, W., Pinedo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mathematical+model+of+drug+transport+in+human+breast+cancer.">A mathematical model of drug transport in human breast cancer.</a> Microvasc. Res. 59, 149-161 (2000).</li><li>Less, J. R., Skalak, T. C., Sevick, E. M., Jain, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvascular+architecture+in+a+mammary+carcinoma:+branching+patterns+and+vessel+dimensions.">Microvascular architecture in a mammary carcinoma: branching patterns and vessel dimensions.</a> Cancer. Res. 51, 265-273 (1991).</li><li>Brown, J. M., Giaccia, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+unique+physiology+of+solid+tumors:+opportunities+(and+problems)+for+cancer+therapy.">The unique physiology of solid tumors: opportunities (and problems) for cancer therapy.</a> Cancer. Res. 58, 1408-1416 (1998).</li><li>Thomlinson, R. H., Gray, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+histological+structure+of+some+human+lung+cancers+and+the+possible+implications+for+radiotherapy.">The histological structure of some human lung cancers and the possible implications for radiotherapy.</a> Br. J. Cancer. 9, 539-549 (1955).</li><li>Minchinton, A. I., Tannock, I. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+penetration+in+solid+tumours.">Drug penetration in solid tumours.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 583-592 (2006).</li></ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

الأوعية الدموية في الأورام متناثر وضعت سوء 7،8. هناك مناطق تقع على مسافة بعيدة (&gt; 100 ميكرون) من الأوعية الدموية التي لا يمكن الوصول إليها لتوفير المواد الغذائية والأدوية على الرغم من ال 9 الأوعية الدموية. والمكروية غير متجانسة مما أدى يسهم في فعالية محدودة ...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> اسم كاشف </th><th> شركة </th><th> كتالوج رقم </th><th> تعليقات </th></tr><tr><td> سيليكون المطاط الصناعي عدة </td><td> لاصقات ألسويرث </td><td> 184 سيل المرانة كيت </td><td></td></tr><tr><td> Miltex خزعة لكمة </td><td> MedexSupply </td><td> MTX-33-31AA </td><td> 1.5 مم </td></tr><tr><td> PTFE أنابيب </td><td> كول Parmer </td><td> EW-06417-31 </td><td> 0،032 &quot;ID </td></tr><tr><td> ذكر الأنبوب الموصل قفل </td><td> Qosina </td><td> 65111 </td><td></td></tr><tr><td> الشائكة الإناث موصل قفل الأنبوب </td><td> Qosina </td><td> 11556 </td><td></td></tr><tr><td> للإيقاف صمام </td><td> آيدكس الصحة والعلوم </td><td> P-721 </td><td></td></tr><tr><td> Y-موصل </td><td> آيدكس الصحة والعلوم </td><td> P-513 </td><td></td></tr><tr><td> 20G 1.5 &quot;الإبر </td><td> BD Biosciencه </td><td> 305176 </td><td></td></tr><tr><td> التربسين EDTA- </td><td> إينفيتروجن </td><td> 25300-054 </td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> سيجما </td><td> H-4034 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW فلوريسئين </td><td> Biovision </td><td> K183-25 </td><td></td></tr><tr><td> CaspGLOW الأحمر </td><td> Biovision </td><td> K193-25 </td><td></td></tr><tr><td> دوكسوروبيسين هيدروكلوريد </td><td> سيجما </td><td> 44583 </td><td></td></tr><tr><td> LS174T </td><td> ATCC </td><td> CCL-188 </td><td> سرطانة الخلايا البشرية القولون خط </td></tr><tr><td> T47D </td><td> ATCC </td><td> HTB-133 </td><td> الإنسان خلية سرطان الأقنية خط </td></tr><tr><td> MDA-MB-231 </td><td> ATCC </td><td> HTB-26 </td><td> خلية غدية الإنسان الثديية خط </td></tr></tbody></table>

microfluidic device for recreating a tumor microenvironment in vitro

قمنا بتطوير الجهاز ميكروفلويديك الذي يحاكي التسليم وإزالة النظامية من الأدوية إلى الأنسجة ثلاثي الأبعاد غير متجانسة السرطانية في المختبر. العناصر الغذائية التي تقدمها الأوعية الدموية تفشل في الوصول إلى جميع أجزاء من الأورام، مما أدى إلى microenvironments غير متجانسة تتكون من أنواع الخلايا قابلة للحياة، هادئة ونخرية. عقاقير مضادة للسرطان كثيرة لا تخترق بشكل فعال وعلاج جميع أنواع الخلايا وبسبب هذا التباين. Monolayers الخلايا السرطانية لا تقليد هذا التباين، مما يجعل من الصعب لاختبار عقاقير مضادة للسرطان مع نموذج مناسب في المختبر. ملفقة أجهزتنا ميكروفلويديك من PDMS باستخدام الطباعة الحجرية الناعمة. أدرجت الأجسام الشبه الكروية الورم متعددة الخلايا، والتي شكلتها طريقة قطرة شنقا، ومقيدة إلى غرف مستطيلة على الجهاز والحفاظ على التروية المتوسطة مع المستمر على جانب واحد. إنشاء شكل مستطيل الغرف على الجهاز التدرجات الخطية داخل الأنسجة. واستخدمت البقع الفلورية لتحديد التقلب ه في موت الخلايا المبرمج داخل الأنسجة. تم علاج الأورام على الجهاز مع الفلورسنت تم استخدام العلاج الكيميائي المخدرات دوكسوروبيسين، الوقت الفاصل بين المجهري لرصد انتشارها في الأنسجة، وقدر معامل الانتشار الفعال. يسمح أسلوب قطرة شنقا سرعة تشكيل الأجسام الشبه الكروية موحدة من عدة خطوط الخلايا السرطانية. تمكين الجهاز نمو الأجسام الشبه الكروية لمدة تصل إلى 3 أيام. وكانت الخلايا التي تتدفق على مقربة من الحد الأدنى والمتوسط ​​أفكارك بعيدا عن تلك القناة كانت أكثر أفكارك، وبالتالي محاكاة بدقة المناطق المتاخمة للأورام في الأوعية الدموية. وافق القيمة المقدرة للدوكسوروبيسين معامل انتشار بقيمة عنها سابقا في سرطان الثدي البشرية. لأن الاختراق والاحتفاظ المخدرات في الأورام الصلبة يؤثر فعاليتها، ونحن نعتقد أن هذا الجهاز هو أداة هامة في فهم سلوك المخدرات، وتطوير علاجات جديدة للسرطان.

Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro at JoVE.com

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

نقدم الإجراء لتصنيع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك الذي يجسد microenvironments ورم غير متجانسة<em&gt; في المختبر</em&gt;. وكميا التباين في موت الخلايا المبرمج داخل أنسجة الورم باستخدام البقع الفلورية ومعامل الانتشار الفعال لدوكسوروبيسين العلاج الكيميائي المخدرات في أنسجة الورم وتقييمها.

ميكروفلويديك الأجهزة لإعادة تأسيس المكروية ورم<em&gt; في المختبر</em

We have developed a microfluidic device that mimics the delivery and systemic clearance of drugs to heterogeneous three-dimensional tumor tissues in ...

microfluidic-device-for-recreating-a-tumor-microenvironment-in-vitro

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

11.5K Views.  University Of Massachusetts Amherst. نقدم الإجراء لتصنيع وتشغيل جهاز ميكروفلويديك الذي يجسد microenvironments ورم غير متجانسة في المختبر. وكميا التباين في موت الخلايا المبرمج داخل أنسجة الورم باستخدام البقع الفلورية ومعامل الانتشار الفعال لدوكسوروبيسين العلاج الكيميائي المخدرات في أنسجة الورم ?...

Video: Microfluidic Device for Recreating a Tumor Microenvironment in Vitro

A Microfluidic Device for Studying Multiple Distinct Strains

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a comparative manner. Multiwell plates are routinely used to compare many different strains or cell lines, but allow limited control over the environment dynamics. Microfluidic devices, on the other hand, allow exquisite dynamic control over the surrounding conditions, but it is challenging to image and distinguish more than a few strains in them. Here we describe a method to easily and rapidly manufacture a microfluidic device capable of applying dynamically changing conditions to multiple distinct yeast strains in one channel. The device is designed and manufactured by simple means without the need for soft lithography. It is composed of a Y-shaped flow channel attached to a second layer harboring microwells. The strains are placed in separate microwells, and imaged under the exact same dynamic conditions. We demonstrate the use of the device for measuring protein localization responses to pulses of nutrient changes in different yeast strains.

We present a simple method to produce microfluidic devices capable of applying similar dynamic conditions to multiple distinct strains, without the need for a clean room or soft lithography.

جهاز ميكروفلويديك لدراسة سلالات متميزة متعددة

The study of cell responses to environmental changes poses many experimental challenges: cells need to be imaged under changing conditions, often in a ...

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

هندسة الأنسجة اللحمية من الورم المكروية مع التطبيق على غزو الخلية السرطانية

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in porous media are relevant to several industrial and environmental processes such as wastewater treatment and CO2 sequestration. We used Pseudomonas fluorescens, a Gram-negative aerobic bacterium, to investigate biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media. The microfluidic device consists of an array of micro-posts, which were fabricated using soft-lithography. Subsequently, biofilm formation in these devices with flow was investigated and we demonstrate the formation of filamentous biofilms known as streamers in our device. The detailed protocols for fabrication and assembly of microfluidic device are provided here along with the bacterial culture protocols. Detailed procedures for experimentation with the microfluidic device are also presented along with representative results.

Protocols for the study of biofilm formation in a microfluidic device that mimics porous media are discussed. The microfluidic device consists of an array of micro-pillars and biofilm formation by Pseudomonas fluorescens in this device is investigated.

بروتوكول لتشكيل بيوفيلم الملون في جهاز ميكروفلويديك مع مايكرو الأركان

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Analyzing Mixing Inhomogeneity in a Microfluidic Device by Microscale Schlieren Technique

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren system is constructed from a Hoffman modulation contrast microscope, which provides easy access to the rear focal plane of the objective lens, by removing the slit plate and replacing the modulator with a knife-edge. The working principle of microscale schlieren technique relies on detecting light deflection caused by variation of refractive index1-3. The deflected light either escapes or is obstructed by the knife-edge to produce a bright or a dark band, respectively. If the refractive index of the mixture varies linearly with its composition, the local change in light intensity in the image plane is proportional to the concentration gradient normal to the optical axis. The micro-schlieren image gives a two-dimensional projection of the disturbed light produced by three-dimensional inhomogeneity.
To accomplish quantitative analysis, we describe a calibration procedure that mixes two fluids in a T-microchannel. We carry out a numerical simulation to obtain the concentration gradient in the T-microchannel that correlates closely with the corresponding micro-schlieren image. By comparison, a relationship between the grayscale readouts of the micro-schlieren image and the concentration gradients presented in a microfluidic device is established. Using this relationship, we are able to analyze the mixing inhomogeneity from associate micro-schlieren image and demonstrate the capability of microscale schlieren technique with measurements in a microfluidic oscillator4. For optically transparent fluids, microscale schlieren technique is an attractive diagnostic tool to provide instantaneous full-field information that retains the three-dimensional features of the mixing process.

Herein, we describe a procedure that employs microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. Through calibration, distribution of concentration gradient can be derived from the micro-schlieren image.

تحليل خلط التجانس في جهاز ميكروفلويديك التي كتبها الميكروسكيل انعراجي تقنية

In this paper, we introduce the use of microscale schlieren technique to measure mixing inhomogeneity in a microfluidic device. The microscale schlieren ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

العين تهيج اختبار (EIT) لتحديد مخاطر العين مهيج للمواد الكيميائية باستخدام يعيد الإنسان القرنية مثل الظهارية (RHCE) الأنسجة نموذج

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

Co-culture of Living Microbiome with Microengineered Human Intestinal Villi in a Gut-on-a-Chip Microfluidic Device

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human gut-on-a-chip microphysiological device. We recapitulate the intestinal lumen-capillary tissue interface in a microfluidic device, where physiological mechanical deformations and fluid shear flow are constantly applied to mimic peristalsis. In the lumen microchannel, human intestinal epithelial Caco-2 cells are cultured to form a &#39;germ-free&#39; villus epithelium and regenerate small intestinal villi. Pre-cultured microbial cells are inoculated into the lumen side to establish a host-microbe ecosystem. After microbial cells adhere to the apical surface of the villi, fluid flow and mechanical deformations are resumed to produce a steady-state microenvironment in which fresh culture medium is constantly supplied and unbound bacteria (as well as bacterial wastes) are continuously removed. After extended co-culture from days to weeks, multiple microcolonies are found to be randomly located between the villi, and both microbial and epithelial cells remain viable and functional for at least one week in culture. Our co-culture protocol can be adapted to provide a versatile platform for other host-microbiome ecosystems that can be found in various human organs, which may facilitate in vitro study of the role of human microbiome in orchestrating health and disease.

We describe an in vitro protocol to co-culture gut microbiome and intestinal villi for an extended period using a human gut-on-a-chip microphysiological system.

شارك في ثقافة المعيشة Microbiome مع المعوية الزوائد Microengineered الإنسان في الوتر على واحد في رقاقة ميكروفلويديك الأجهزة

Here, we describe a protocol to perform long-term co-culture of multi-species human gut microbiome with microengineered intestinal villi in a human ...

Perfusable Vascular Network with a Tissue Model in a Microfluidic Device

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the spheroid cultures, a perfusable vascular network in the spheroids remains a critical challenge for long-term culture required to maintain and develop their functions, such as protein expressions and morphogenesis. The protocol presents a novel method to integrate a perfusable vascular network within the spheroid in a microfluidic device. To induce a perfusable vascular network in the spheroid, angiogenic sprouts connected to microchannels were guided to the spheroid by utilizing angiogenic factors from human lung fibroblasts cultured in the spheroid. The angiogenic sprouts reached the spheroid, merged with the endothelial cells co-cultured in the spheroid, and formed a continuous vascular network. The vascular network could perfuse the interior of the spheroid without any leakage. The constructed vascular network may be further used as a route for supply of nutrients and removal of waste products, mimicking blood circulation in vivo. The method provides a new platform in spheroid culture toward better recapitulation of living tissues.

The protocol describes how to engineer a perfusable vascular network in a spheroid. The spheroid's surrounding microenvironment is devised to induce angiogenesis and connect the spheroid to the microchannels in a microfluidic device. The method allows the perfusion of the spheroid, which is a long-awaited technique in three-dimensional cultures.

بيرفوسابل شبكة الأوعية الدموية مع نموذج أنسجة في جهاز موائع جزيئية

A spheroid (a multicellular aggregate) is regarded as a good model of living tissues in the human body. Despite the significant advancement in the ...

Advanced 3D Liver Models for In vitro Genotoxicity Testing Following Long-Term Nanomaterial Exposure

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of robust, predictive in vitro test systems is essential. Hepatic toxicology is key when considering ENM exposure, as the liver serves a vital role in metabolic homeostasis and detoxification as well as being a major site of ENM accumulation post exposure. Based upon this and the accepted understanding that 2D hepatocyte models do not accurately mimic the complexities of intricate multi-cellular interactions and metabolic activity observed in vivo, there is a greater focus on the development of physiologically relevant 3D liver models tailored for ENM hazard assessment purposes in vitro. In line with the principles of the 3Rs to replace, reduce and refine animal experimentation, a 3D HepG2 cell-line based liver model has been developed, which is a user friendly, cost effective system that can support both extended and repeated ENM exposure regimes (&#8804;14 days). These spheroid models (&#8805;500 &#181;m in diameter) retain their proliferative capacity (i.e., dividing cell models) allowing them to be coupled with the &#8216;gold standard&#8217; micronucleus assay to effectively assess genotoxicity in vitro. Their ability to report on a range of toxicological endpoints (e.g., liver function, (pro-)inflammatory response, cytotoxicity and genotoxicity) has been characterized using several ENMs across both acute (24 h) and long-term (120 h) exposure regimes. This 3D in vitro hepatic model has the capacity to be utilized for evaluating more realistic ENM exposures, thereby providing a future in vitro approach to better support ENM hazard assessment in a routine and easily accessible manner.

This procedure was established to be used for developing advanced 3D hepatic cultures in vitro, which can provide a more physiologically relevant assessment of the genotoxic hazards associated with nanomaterial exposures over both an acute or long-term, repeated dose regimes.

نماذج متقدمة الكبد 3D لاختبار السمية الجينية في المختبر بعد التعرض للمواد النانوية على المدى الطويل

Due to the rapid development and implementation of a diverse array of engineered nanomaterials (ENM), exposure to ENM is inevitable and the development of ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

توليد الظروف البيئية الديناميكية باستخدام جهاز Microfluidic عالي الإنتاجية

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

إعداد جهاز الموائع الدقيقة لإنتاج المكونات التوافقية

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

تسليط الضوء على المؤلف: دمج الأساليب الحسابية والتجريبية في علم الأورام الدقيق

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

جهاز الموائع الدقيقة ثنائي الطبقة لإنتاج المكونات التوافقية

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...