This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

<ol>
	<li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa.">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li><li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins,+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation.">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li><li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants.">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father's+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation.">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage.">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities.">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li><li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens.">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals.">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li><li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+mutations+in+mice.">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li><li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+mutagens:+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century.">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li><li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide:+A+cooking+carcinogen.">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li><li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay.">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li><li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen.">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li><li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus.">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li><li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci.">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li><li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population.">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li><li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species:+Cautious+optimism.">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li><li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene:+Evidence+for+in+vivo+rearrangements.">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li><li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays.">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).</li><li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice.">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li><li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency,+nature,+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse.">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice.">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).</li><li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids.">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li><li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+benzo[a]pyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations,+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse.">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li><li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice.">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li><li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia.">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li><li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system.">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li><li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+induced+male+germline+mutation:+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays,+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays.">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

بالمقارنة مع الأساليب التقليدية، يوفر TGR طفرة الخلية الجرثومية فحص وسيلة أسرع وأكثر اقتصادية، وأكثر حساسية لقياس يسببها في الجسم الحي الطفرات الخلية الجرثومية. من خلال تقييم التحوير MF مباشرة في الحيوانات المنوية، على عكس ذرية، وعدد من الحيوانات، يتم تقليل الوقت والموارد اللازمة لتقييم الطفرات الجرثومية في أي مجمع واحد كبير. من حيث الحساسية، تمكنا من الكشف عن زيادة كبيرة 2.6 أضعاف في الخلايا الجذعية أمهات المني MF بعد التعرض إلى 25 مغ / كغ ENU فقط باستخدام 5 حيوانات لكل مجموعة الجرعة. في المقابل، لم يتمكن من اكتشاف أي تغيير كبير في MF عند هذه الجرعة نفسها باستخدام&gt; 3،000 الفئران في المجموعة المكشوفة و&gt; 500،000 السيطرة على الفئران 28 فحص موضع معين. بالإضافة إلى ملاءمتها لكلا التحقيقات الميكانيكية والتنظيمية، وهذه الطريقة توفر فرصة لإجراء دراسات مقارنة بين جسدية والجرثومية خط mutatiعلى أسعار الفائدة. وتشير الأدلة الحديثة إلى أن بعض وكلاء قد يسببها الطفرات الخلية الجرثومية في أقل تركيز من المطلوب للطفرة الجسدية. على سبيل المثال، التعرض لفترات طويلة لN-hydroxymethylacrylamide، وهو المستقلب من الأكريلاميد مادة مسرطنة الغذاء 12، ويزيد من وتيرة المهيمنة قاتلة الطفرات الخلية الجرثومية في الفئران دون التأثير على تردد النواة الصغرى في خلايا الدم الحمراء، وهو مقياس تقليدي من خلية جسدية الضرر الوراثي الخلوي 13. بالإضافة إلى ذلك، تعرض الفئران لكلا الترددات طفرة التيار الرئيسي والجانبي التبغ يسبب الدخان ترتفع في ترادف تكرار مواضع الحمض النووي في الحيوانات المنوية في الجرعات التي لا زيادة تردد النواة الصغرى الدم 14. هذه النتائج تتحدى الافتراض أن اختبار السمية الوراثية الجسدية هو دائما واقية من سلالة الجرثومية، وتعزز الطلب على وسيلة أكثر كفاءة وفعالية من حيث التكلفة لتحديد الجرثومة تردد طفرة الخلية. ومع ذلك، فإن الأدلة لتفضيلية المطفرة الخلية الجرثومية لا يزال ضعيفا، إلى حد كبير بسبب نقص البيانات المتوفرة لمقارنة معدلات طفرة في أنسجة الخلايا الجسدية والجرثومية. يسمح الطفرة فحص TGR اختبار مواز ومقارنة معدلات الطفرات المستحثة في أنسجة متعددة باستخدام نفس التحوير. وبالتالي، طفرة المقارنة اختبار باستخدام الفحص TGR من شأنه أن يساعد ملء الثغرات في البيانات المحيطة إمكانية آثار الخلية الجرثومية تفضيلية. ان تقييم المتزامن لطفرة الخلية الجسدية والجرثومية لاختبار التنظيمي أيضا تحسين الكفاءة من خلال تقليل عدد الحيوانات اللازمة. المبادئ التوجيهية لمنظمة التعاون والتنمية طفرة جسدية يوصي وقت الإدارة 28 يوما، تليها فترة أخذ العينات لمدة ثلاثة أيام (28 + 3). تحليل ذيل الحيوانات المنوية قد تقدم الفقيرة حساسية عند هذه النقطة الزمن، لأنه يستهدف الخلايا المعرضة معظمها خلال خلية نطفية وspermatid مراحل تكوين الحيوانات المنوية (الشكل 3). الخلايا في هذه المراحل لا توليف الحمض النووي وتفقد تدريجيا قدرتها على إصلاح الحمض النووي 6 &lt;/ سوب&gt;. وعلاوة على ذلك، فإن الحيوانات المنوية ذيل أخذ العينات عند هذه النقطة مرة تفشل في الكشف عن الطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية وأمهات المني. وهكذا، على الاندماج في تصميم 28 + 3، يوصي التوجيهي OECD جمع الخلايا الجرثومية من الأنابيب المنوية. يحتوي هذا يقطنها خليط سكاني الخلايا المشتقة من تخليق DNA وإصلاح يتقن أنواع الخلايا، بما فيها الخلايا الجذعية، وتتعرض في معظم مراحل المنوية. ولكن نظرا لطبيعة مختلطة من هذه الخلايا، الخلايا المنوية تحليل الأنابيب لا يقدم معلومات مرحلة محددة. وعلاوة على ذلك، هناك قلق من أن وجود خلايا غير المستهدفة يمكن أن تؤثر على MF احظ (مثل المكالمات إيجابية كاذبة المغير الخلية الجرثومية بسبب تلوث تحور الخلايا الجسدية، أو التخفيف من إشارة الخلية الجرثومية من تحور الخلايا الجرثومية إصلاح الحمض النووي التي تعاني من نقص) . هناك بيانات كافية لإبرام حاليا ما إذا كانت النتائج من خلايا الأنابيب المنوية عند 28 + 3 عرض نفس حساسية وخصوصية وق ذيل الحيوانات المنوية في نقاط زمنية لاحقة. لدينا مختبر ويقارن حاليا MFS يسببها في خلايا الأنابيب المنوية وذيل الحيوانات المنوية التي تم جمعها بعد أوقات لأخذ العينات المختلفة لمعالجة هذه النقطة. ونلاحظ أن المبدأ التوجيهي OECD يشير وقت أخذ العينات بديل من 28 يوما لتقسيم ببطء الأنسجة مثل الكبد التي قد تكون مناسبة أيضا لتحليل الخلية الجرثومية. ومع ذلك، فإن البيانات المتاحة لا يزال غير كاف ونحن غير قادرين حاليا على تصميم واحد يوصي تجريبي واحد في وقت واحد لتحليل الخلايا الجسدية والخلايا الجرثومية باستخدام فحص طفرة TGR للاختبار التنظيمي. واحدة من سمات هذا الاختبار الذي وتجدر الإشارة أن يتم تقييم الأحداث طفرية على التحوير غير الفئران. ومع ذلك، هناك أدلة كثيرة تشير إلى أن التحوير يستجيب لالمطفرة البيئية بطريقة مشابهة لجينات الذاتية 20. بالإضافة إلى ذلك، لأن أصول دقيقة من الأحداث طفرية مستقلة يصعبحل، يتم الإبلاغ عن النتائج بصفة عامة تردد متحولة (على النقيض من تردد طفرة). يمكن حل تردد طفرة الفعلي إذا كان يتم تصحيح النتائج للتوسع نسيلي (أي الانقسام والتكاثر من الخلايا المتحولة واحدة يمكن أن تسهم في وتيرة الملحوظ من المسوخ التحوير) من خلال تسلسل الحمض النووي. تسلسل الجينات المحورة متحولة يمكن أداؤها لتوصيف الطفرات lacZ، وتحديد المسوخ التي قد تكون مستمدة من الأحداث التوسع نسيلي، على الرغم من أن هذا يضيف إلى حد كبير في الوقت والتكلفة من التحليل. بالإضافة إلى الجين lacZ، theλgt10 ناقلات المعدلة وراثيا والمرافئ التي تعتمد على درجة حرارة بديل تحور الجين مراسل-: البديل من الجين λ اخي، وهو أقصر (294 نقطة أساس في مقابل 3021 نقطة أساس lacZ، الشكل 1) وأسهل للتسلسل 29. تسلسل يسمح أيضا تحليل الطيف الطفرات المستحثة، وتوفير نظرة ثاقبة على mutatioآلية نال من المجمع المذكور. مثالا صارخا على التوسع النسيلي هو حدوث &quot;بالجائزة الكبرى&quot; الطفرة (أي.، والطفرات التحوير في مرحلة مبكرة جدا من التطور جهازا أن تسهم في MF مرتفعة بشكل كبير، وأحيانا مئات الآلاف من المرات أكبر من الخلفية). يجب إزالة أنسجة الحيوانات أو مع &quot;بالجائزة الكبرى&quot; طفرة من التحليل. الفحص التي وصفناها ينطبق على نطاق واسع لنماذج TGR الأخرى مثل BigBlue الماوس والفئران، والبلازميد الماوس lacZ، والتي تؤوي مماثلة ناقلات مراسل طفرة (استعرضت في 20). الغالبية العظمى من الدراسات الخلية الجرثومية التي أجريت حتى الآن أن استخدام أساليب مماثلة ركزت المطفرة تتميز تقريبا حصرا على ما يرام مثل ENU والإشعاع (استعرضت في 30). ومن المتوقع أنه مع الإفراج مؤخرا عن اختبار OECD التوجيهي للمقايسة TGR، هذا الاختبار سيكونشعبية متزايدة للفحص الكيميائي والتقييم التنظيمي. سيتم إدراج TGR الخلية الجرثومية طفرة في فحص بطارية اختبار التنظيمية ملء الفجوة القائمة من خلال السماح تقييم كفاءة طفرة في تحريض الخلايا الجرثومية 11. وعلاوة على ذلك، هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لقياس MF في أي نسيج تقريبا، وتوفير وسيلة مناسبة لمقارنة الحساسيات النسبية للخلايا الجسمية والخلايا الجرثومية في استحثاث الطفرات التي كتبها العوامل البيئية في النهاية جينية متطابقة.

الطفرات الحمض النووي متفرقة في سلالة الجرثومية يمكن أن يؤدي إلى انخفاض النجاح التناسلي، وإذا ورثت، قد تسبب مرض وراثي أو استعداد لتزايد سرطان في النسل 1-3. يوضح أدلة قوية على أن نسبة كبيرة من دي نوفو طفرات موروثة من سلالة الجرثومية الأب 4، وأن عدد من الطفرات في النسل يرتبط ارتباطا إيجابيا مع سن الأب في وقت الحمل 5. ويعتقد أن نسبة أعلى من الذكور الطفرات أن تكون نتيجة للفارق في السن أثناء عملية تكوين الأمشاج بين الجنسين، وعدد أكبر من انقسامات الخلية المنوية بالمقارنة مع عدد من انقسامات الخلية oogenic في سلالة الجرثومية الإناث 2، والانخفاض التدريجي في DNA إصلاح الكفاءة مع التقدم في السن عند الذكور. كل هذه العوامل تساهم في زيادة احتمال من أخطاء النسخ المتماثل في سلالة الجرثومية الذكور 6. ومع ذلك، فإن تأثير التعرض الأب إلى بيئىالعوامل nmental على وتيرة دي نوفو الطفرات لا تزال غير مؤكدة. ومع ذلك، ومن المعروف أن عددا كبيرا من العوامل البيئية للحث على الطفرات الخلية الجرثومية في 7 القوارض، وهناك أدلة متزايدة على أن بعض هذه العوامل يمكن أن تؤثر أيضا على سلالة الجرثومية الإنسان 8. على الرغم من هذه المخاوف، ويتم اختبار المواد الكيميائية بشكل روتيني لقدرتها على إحداث الطفرات في الخلايا الجسمية لأغراض تنظيمية ويفترض عموما أن اختبارات جسدية كافية لحماية سلالة الجرثومية. لذا، نادرا ما يتم فقط بتقييم المواد الكيميائية لقدرتها على إحداث الطفرات الخلية الجرثومية. وقد سبب واحد اختبار طفرات الخلية الجرثومية أغفل إلى حد كبير من عملية صنع القرار التنظيمية هو عدم وجود منهجيات عملية. الأساليب التقليدية القائمة على القوارض، مثل المهيمنة قاتلة 9 و 10 محددة موضع الاختبارات، وتقدر معدلات طفرة الخلية الجرثومية بتسجيله الظواهر متحولة في الأجنة أو ذريةالآباء المكشوفة. هذه المقايسات تتطلب استخدام عدد كبير جدا من الحيوانات والوقت والموارد للحصول على نتائج ذات مغزى إحصائيا. على الرغم من أن العديد من الطرق الحديثة لقياس طفرة الخلية الجرثومية ظهرت مؤخرا، ويعاني العديد القصور من حيث التطبيق العملي، والكفاءة، وأهميتها البيولوجية. على سبيل المثال، تكرار الطفرات في توسيع طول تكرار جنبا إلى جنب بسيط (ESTR) مواضع يمكن قياسها كميا في الخلايا التناسلية الذكرية باستخدام جزيء واحد PCR النهج 15. ومع ذلك، يمكن تنفيذ هذه الطريقة أن يكون تحديا فنيا وشاقة، وعلى عكس الطفرات نقطة، والأهمية البيولوجية والصحية للتغيرات في طول تكرار ESTR مواضع غير مستقر للغاية لا تزال غير واضحة 16. يمكن للتكنولوجيات الحديثة تسلسل الجينوم كله توفر ثروة من البيانات ذات مغزى من الناحية البيولوجية عند تطبيقها على مشكلة الطفرات الوراثية 4،17، ولكن التكلفة عالية، ومعدلات خطأ عالية، والمصادقة المرتبطة مطلوبةلتأكيد الطفرات، والمعلوماتية الحيوية التحديات لا تزال تحد من التطبيق الروتيني لهذا الخيار في اختبار القدرات التنظيمية 18. هنا، نحن تصف طريقة عملية لقياس الطفرات المستحثة مباشرة في الخلايا التناسلية للذكور الفئران المعدلة وراثيا. يوصف هذا البروتوكول لنموذج MutaMouse المعدلة وراثيا، التي لديها نسخ متسلسلة متعددة من المؤتلف ناقلات λgt10 فج تحتوي على الجين مراسل القولونية lacZ دمجها في كلا نسخ من كروموسوم 19 3 (الشكل 1). هذا البروتوكول وثيقة الصلة أيضا القوارض المعدلة وراثيا (TGR) نماذج أخرى تقوم على نفس المبادئ (BigBlue الفأر والجرذ، أو lacZ بلازميد الماوس، الخ) أو الجينات مراسل مختلفة قليلا (GPT الماوس الدلتا والفئران، ونماذج TGR في تاريخ لامبرت وآخرون ال 20). ويستند هذا الأسلوب على الفحص طفرة TGR صفها في صدر مؤخراوالمنقحة OECD اختبار التوجيهي 21 ونحن على وضع الاعتبارات الخاصة المطلوبة لاستيعاب تقييم طفرات في سلالة الجرثومية الذكور بسبب الخصائص الفريدة من الحيوانات المنوية. لفترة وجيزة، وفحص يشمل تعريض الفئران الذكور المعدلة وراثيا إلى مادة مطفرة، تليها وقت أخذ العينات حيث يتم إصلاحها الآفات ما قبل طفرية في الطفرات مستقرة. في ذلك الوقت أخذ العينات المختارة، يصرح باستخدامها الفئران وتجمع الخلايا الجرثومية من أي ذيل البربخ أو الأنابيب المنوية. كما هو مبين أدناه، والآثار المطفرة في مراحل مختلفة من الحيوانات المنوية يمكن تحديدها عن طريق تحديد الوقت بين التعرض وجمع العينات. إدراج المعدلة وراثيا، التي تضم نسخ متعددة من جينوم λ فج لكل خلية، يتم عزل الحمض النووي الجيني من الخلايا الجرثومية وتعبئتها في فارغة capsids فج λ λ المعدية خلق جزيئات الفيروس التي تستخدم بعد ذلك لتصيب E. المضيف القولونية. وتزرع البكتيريا المصابة على SELECوسائل الإعلام TIVE يمكن أن تميز الخلايا التي تحتوي على ناقل بنسخة من lacZ تحور من خلايا إيواء البرية من نوع lacZ. يتم تحديد تأثير طفرات التعرض على الذكور سلالة الجرثومية بمقارنة تواتر الجينات المحورة متحولة بين السيطرة والفئران التي عولجت (الشكل 2، استعرض في لامبرت وآخرون 20). يمكن أن يعاير عدد كبير من الخلايا الجرثومية من ماوس واحدة، وإعطاء هذه الحساسية الفائقة الفحص على الطرق التقليدية، مع تقليل عدد الحيوانات اللازمة. ولأن مطلوب أي معدات متخصصة أو التدريب، ويوفر هذا الاختبار خيارا عمليا وكفاءة الخلية الجرثومية لاختبار تحور في معظم مختبرات البيولوجيا الجزيئية وعلم السموم / الحديثة. أحد المتطلبات الأساسية لتطبيق الفعال للTGR طفرة الخلية الجرثومية الاختبار هو فهم دورة المنوية (الشكل 3). الوقت للخلايا الجرثومية الماوس على التقدم من شارعم في خلايا الأنابيب المنوية لأمهات المني، الخلايا المنوية، spermatids، وأخيرا إلى أن تنضج الحيوانات المنوية في البربخ (أي الحيوانات المنوية) ما يقرب من 49 يوما. يمكن أن تحدث طفرة في مختلف مراحل هذه الدورة وغالبا ما تكون محددة مركب. اثنين من السمات الرئيسية التي هي ذات أهمية خاصة لالطفرات في الخلايا التناسلية الذكرية هي وقف توليف الحمض النووي خلال الانقسام المنصف في وقت مبكر، والفقدان التدريجي للقدرة إصلاح الحمض النووي 6 في أواخر مرحلة ما بعد الانقسام المنصف، واثنين من العمليات التي مطلوبة من أجل تحريض وتثبيت لل معظم الطفرات. بسبب هذه الخصائص الفريدة من الحيوانات المنوية، وهناك ثلاثة متغيرات تجريبية حاسمة لسير TGR طفرة الخلية الجرثومية الفحص: (1) إدارة الوقت مركب الاختبار؛ (2) وقت أخذ العينات. و (3) اختيار من السكان الخلية الجرثومية لجمع لتحليل (الشكل 3 والجدول 1). إدارة الوقت هو experimeمتغير ntal التي تحدد كيفية تتعرض الخلايا المستهدفة طويلة لمركبات الاختبار. ويمكن أيضا طول الوقت إدارة أن تستخدم لاستهداف التعرض لأنواع معينة من الخلايا أو مراحل تكوين الحيوانات المنوية. على سبيل المثال، يمكن أن تستخدم إدارة يوم واحد لتحديد الآثار المترتبة على التعرض الحاد على واحد نوع من الخلايا معين. وبالمثل، يمكن أن تركز التعرض لمرحلة المنوية بأكملها، على سبيل المثال من خلال استهداف الخلايا المنوية فقط تقسيم meiotically، أو تقسيم ميتوتيكلي أمهات المني باستخدام إدارة الوقت 2 الاسبوع والوقت المناسب لأخذ العينات. وتستخدم مرة الادارة المزمنة وشبه المزمنة لتقييم آثار التعرض على المدى الطويل، لضمان التوزيع الدوائية كاف من مجمع الاختبار، أو السماح تراكم كاف من الطفرات من المطفرة ضعيفة (على سبيل المثال إدارة الوقت 28 يوم أوصى في اختبار OECD التوجيهي). وقت أخذ العينات هو المتغير الحاسم لتحديد الذيكانت مرحلة من مراحل تكوين الحيوانات المنوية الخلايا المستهدفة في وقت التعرض. الوقت أخذ العينات يملي كيف الكثير من الوقت، وبالتالي مدى أبعد على طول دورة المنوية، والخلايا تمر بعد التعرض. على سبيل المثال، للتحقيق في الآثار أمهات المني الخلايا الجذعية، وهو وقت أخذ العينات&gt; 49 يوما مطلوب إذا جمع الحيوانات المنوية نضجت تماما، أو&gt; 42 يوما إذا جمع الخلايا الجرثومية غير ناضجة من الأنابيب المنوية، لضمان أن جميع الخلايا التي تم جمعها وكان الوقت كافيا ل تطوير يتعرض ينبع من الخلايا. من المهم أن نلاحظ أن وقت أخذ العينات من 70 يوما على الأقل يكون من الأفضل لكى يبرهن على وجود تأثير الخلايا الجذعية وفيا لتوفير الوقت الكافي لتوزيعها الدوائية من السموم، للقضاء على الخلايا المعرضة في مراحل لاحقة من الحيوانات المنوية، وتمثل فترة العقم المؤقت التي قد تحدث ~ 6 أسابيع بعد التعرض للمركبات مطفرة غاية 22. وبالمثل، فإن وقت أخذ العينات من 21 يوما ضمان كولي الحيوانات المنويةأن المديرية التنفيذية من ذيل البربخ قد أكملت للتو الانقسام المنصف في اليوم الأخير من التعرض. الخلايا الجرثومية يمكن جمعها لتصبح حيوانات منوية ناضجة من ذيل البربخ، أو على شكل مزيج من مختلف أنواع الخلايا المنوية من الأنابيب المنوية. تبقى الحيوانات المنوية الناضجة في ذيل ل~ 3 أيام، مما يجعل من الممكن لتحديد بدقة نسبية نوع من الخلايا أو مرحلة من مراحل تكوين الحيوانات المنوية من الحيوانات المنوية التي نشأت عن أي تصميم تجريبي معين. وهكذا، وتحليل تصاريح الحيوانات المنوية ذيل استهدفت غاية التحقيقات في مرحلة معينة آثار طفرية. من ناحية أخرى، تعليق خلية تم جمعها من الأنابيب المنوية تحتوي على مزيج من مختلف أنواع الخلايا الجرثومية في مراحل مختلفة من التنمية، وبالتالي توفر قرار فقرا المرحلة المنوية التي نشأت الطفرات. بالإضافة إلى ذلك، تعليق خلية تعافى من الأنابيب المنوية تميل لاحتواء التمثيل على من spermatids، تليها الخلايا المنوية، والاصدارذ القليلة أمهات المني والخلايا الجذعية (يتم تمثيل هذه النسب عن طريق أشرطة بيضاء تخرج في الشكل 3). وعلاوة على ذلك، تعليق أعدت من الأنابيب المنوية قد تحتوي أيضا على خلايا جسدية مختلفة. وهكذا، وذلك لأن العديد من أنواع الخلايا موجودة، آثار طفرية يمكن أن تتأثر مجموعة متنوعة من الخلايا غير المستهدفة. ومع ذلك، وجمع عينات من الأنابيب المنوية يوفر خيارا اقتصاديا لفحص في وقت واحد أنواع الخلايا الجرثومية متعددة، والتكامل السهل تحليل الخلية الجرثومية في معيار OECD بروتوكول اختبار للطفرة الجسدية. أن أكرر، اعتمادا على احتياجات المحقق، إدارة الوقت، والوقت أخذ العينات والسكان الخلية التي تم جمعها يمكن تعديلها لاستجواب آثار التعرض في مختلف أنواع الخلايا، وفي مختلف مراحل تكوين الحيوانات المنوية. عن طريق اختيار بعناية هذه المتغيرات، ويمكن تصميم التجارب للدراسات الآلية المستهدفة، أو لاختبار تنظيمي أكثر المعممأغراض جي. لتحقيق الكفاءة في الفحص، من المستحسن استخدام لتناوله عن طريق الفم الحادة من 100 ملغ / كغ N-إيثيل-N-نتروزويوريا (ENU)، تليها 70 يوما وقت أخذ العينات ومراقبة إيجابية. تحليل ذيل الحيوانات المنوية وبالتالي يستهدف الخلايا الجذعية النطفة (الشكل 3)، والتي تظهر عادة 4-5 أضعاف الزيادة في وتيرة متحولة (MF) أكثر من الضوابط التالية هذه الجرعة العالية من ENU المطفرة. تجدر الإشارة إلى أن هذه الجرعة هو معروف للحث على العقم 6 أسابيع بعد التعرض، وبالتالي قد لا يكون جرعة تحكم مناسبة لأخذ العينات أقصر الأوقات. هذه الجرعة سوف تنتج أيضا زيادة في كشف MF في معظم الأنسجة الجسدية 20. تم إنشاء نتائج ممثلة الواردة أدناه بعد التعرض الحاد +70 باستخدام نظام ثلاث جرعات من ENU وبما يصل إلى 100 ملغ / كغ.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

مع عدد متوسط ​​من 200،000 وحة ويحات لكل حيوان، نلاحظ عادة يعني خلفية MF حوالي 2.8 × 10 -5 في الخلايا التناسلية الذكرية مع انحراف معياري 1.7 × 10 -5 في مجموعات سيطرتنا (استنادا إلى بيانات من ثمانية مستقلة تجارب). مع هذا العدد لوحة، الخلفية ومستوى التباين والجماعات مع جرعة ن = 5 الحيوانات كل تكفي للكشف عن زيادة بنسبة 2 أضعاف في MF مع السلطة&gt; 0.8. عادة يتم الإبلاغ عن النتائج في جداول أو رسوم بيانية الأشكال. الجدول 2 والشكل 6 تظهر نتائج ممثلة من ذيل الحيوانات المنوية من الذكور MutaMouse (ن = 5 لكل مجموعة) يتعرض لجرعة واحدة عن طريق الفم الحادة من 0، 25، 50، و 100 ملغم / كغم N-إيثيل-N-نتروزويوريا (ENU)، يليه وقت أخذ العينات 70 يوم. هذه الفترة 70 يوما تسمح بقياس طفرية الأحداث التي وقعت في الحيوانات المنوية التي كانت الخلايا الجذعية النطفة في وقت التعرض (الشكل 3). وتظهر كثافة وحة نموذجية على لوحات متحولة وعيار في الشكل 7. كما هو مبين في الجدول 2 والشكل (6)، والتعرض ENU الحادة يسببها زيادة كبيرة تعتمد على الجرعة في MF الخلايا الجذعية النطفة. جرعة منخفضة بفعل بنسبة كبيرة 2.6 أضعاف أكثر من الضوابط، التي كان لها خط الأساس MF 2.6 × 10 -5. وقع أقصى التعريفي في الجرعة العالية، والتي أثارت زيادة 4.4 أضعاف أكثر من الضوابط. مثال على هذا الاختبار تجرى على الخلايا الجرثومية النبيبات المنوية يمكن العثور عليها في دوغلاس وآخرون 27، حيث تم تحديد MF في الخلايا الجرثومية أنبوب صغير على فترات زمنية مختلفة بعد 5 أيام تكرار الحقن داخل الصفاق من 50 ملغ / كغ ENU. في تلك الدراسة، زادت الترددات الطافرة في الخلايا المنوية تصل إلى 15 أيام بعد العلاج وظلت ثابتة بعد ذلك. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr tr=""><td> المعرضمتأكد نظام </td><td> الأنسجة التي تم جمعها </td><td> نوع من الخلايا التي تم جمعها (الخلية المستهدفة) </td><td> مرحلة الخلية المستهدفة في بداية التعرض </td><td> مراحل مرت خلال التعرض </td></tr><tr><td> الحادة + 70 </td><td> ذيل </td><td> الحيوانات المنوية الناضجة </td><td> الخلايا الجذعية </td><td> الخلايا الجذعية </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> ذيل </td><td> الحيوانات المنوية الناضجة </td><td> أمهات المني </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> ذيل </td><td> الحيوانات المنوية الناضجة </td><td> الخلايا الجذعية </td><td> خلية نطفية </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> ذيل </td><td> الحيوانات المنوية الناضجة </td><td> خلية نطفية </td><td> خلية نطفية Spermatid الحيوانات المنوية الناضجة </td></tr><tr><td></td><td> الأنابيب </td><td> الخلايا الجذعية </td><td> الخلايا الجذعية </td><td> الخلايا الجذعية </td></tr><tr><td></td><td></td><td> أمهات المني </td><td> سermatogonia </td><td> أمهات المني </td></tr><tr><td></td><td></td><td> خلية نطفية </td><td></td><td> خلية نطفية </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> ذيل </td><td> الحيوانات المنوية الناضجة </td><td> سل الجذعية </td><td> الخلايا الجذعية </td></tr><tr><td></td><td> الأنابيب </td><td> الخلايا الجذعية أمهات المني خلية نطفية Spermatid </td><td> الخلايا الجذعية </td><td> الخلايا الجذعية </td></tr></tbody></table> الجدول 1. أنواع الخليوي ومراحل تكوين الحيوانات المنوية التي يستهدفها المعدلة وراثيا فحص طفرة القوارض بواسطة تصاميم تجريبية مختلفة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مجموعة الجرعة </td><td> # الحيوان </td><td> متحولة PFU </td><td> إجمالي PFU </td><td> MF (خ10 -5) </td><td> متوسط ​​MF (× 10 -5) </td><td> تغيير أضعاف </td><td> ف القيمة </td></tr><tr><td> السيطرة </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 مغ / كغ </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 مغ / كغ </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133859 &lt;/ td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 ملغ / كغ </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> الجدول 2. تردد متحولة lacZ في ذيل الحيوانات المنوية من الذكور المعدلة وراثيا مكريم يتعرض تماما لENU عندما كانت خلايا النطفة الجذعية (إدارة الوقت = 1 يوم، وقت أخذ العينات = 70 يوما). PFU = البلاك تشكيل وحدة، MF = التردد متحولة. <img alt="الشكل 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> الشكل 1. التمثيل التخطيطي لبناء λgt10 فج. <img alt="الشكل 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> الشكل 2. مخطط من القوارض المعدلة وراثيا طفرة الخلية الجرثومية الفحص. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> الرقم 3. رسم تخطيطي لتكوين الحيوانات المنوية في الماوس وأنواع الخلايا وphas<html> العناوين التي استهدفتها المعدلة وراثيا فحص طفرة القوارض بواسطة تصاميم تجريبية مختلفة ملاحظة: أشرطة بيضاء تخرج وتمثل الحصة النسبية من أنواع الخلايا الموجودة في تعليق خلية أعدت من الأنابيب المنوية (أي spermatids&gt; المنوية&gt; أمهات المني&gt; الخلايا الجذعية). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> الرقم 4. مجموعة من البربخ ذيل الماوس. أ) إجراء شق في البطن نحو كيس الصفن. B) تحديد بربخي الدهون سادة. C) برفق لوحة الدهون لاستخلاص الخصيتين والبربخ. D) موقع واستئصال البربخ ذيل. ق ق = &quot;jove_content&quot; FO: المحافظة على together.within الصفحات = &quot;دائما&quot;&gt; <img alt="الرقم 5" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig5highres.jpg" /> الرقم 5. إعداد تعليق الخلايا الجرثومية من الأنابيب المنوية. A) يتم إجراء شق في كبسولة الظهارية من الخصية، وتعريض الأنابيب المنوية. B) وتقلص الأنابيب المنوية للخروج من الكبسولة. C) يتم تمرير بكرة الأنسجة برفق فوق الأنابيب في زاوية 5-10 درجة ل الافراج عن الخلايا الجرثومية الواردة في. D) يتم جمع الخلايا الجرثومية تعليق لمزيد من المعالجة. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> الرقم 6. التمثيل البياني للlacZ تردد متحولة في MutaMouse الحيوانات المنوية يتعرض تماما كما خلايا الجذعية لENU (ن = 5). كليمثل مثلث MF من حيوان واحد. * P &lt;0.05 على النحو الذي يحدده بواسون الانحدار. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> الرقم 7. لوحات أجار التمثيلية من القوارض المعدلة وراثيا مع تحور فحص ويحات شكلت على العشب من E. البكتيريا القولونية المضيف. أ) لوحات &quot;متحولة&quot; سيكون لها عدد قليل جدا من لويحات (يتسم مع سهم)، وخاصة في مجموعات جرعة السيطرة، والتي سيكون لها أحيانا الصفر لويحات على بعض لوحات. B) يمكن للوحات &quot;عيار&quot; لديها المئات من اللوحات.

Watch this Scientific Journal Video about Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency at JoVE.com

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

المعدلة وراثيا القوارض الفحص لقياس ذكر جرثومة خلية متحولة التردد

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Research

JoVE Journal

Biology

16.1K Views.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Video: Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

الدماغ المتوسط ​​الدوبامين الابتدائي الثقافات خلية ينفصل عن الولدان القوارض

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

تعديل الجذعية الجنينية الماوس الفحص خلية مقرها لقياس كفاءة قلبية التعريفي

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

قياس التردد من ورم الخلايا باستخدام الحد من نشر زرع الخلايا في التخفيف اسماك الزرد مسانج

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

جرثومة زرع الخلايا والأنسجة الخصية Xenografting في الفئران

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

تقارب الأمطار من GEFs-رو بالموقع باستخدام ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتين رو المسخ (GST-RhoA (G17A)) من Lysates الخلايا الظهارية

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

الفصل بين أنواع الخلايا المنوية عن طريق STA-PUT سرعة الترسيب

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

فيفو السابقين الثقافة من ذبابة الفاكهة العذراء خصية واحدة ذكر الخراجات جرثومة خط: تشريح، التصوير، والمعالجة الدوائية

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

جيل المعدلة وراثيا<em&gt; حيدرة</em&gt; من جانب الأجنة حقن مكروي

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

A للمسح<em&gt; في فيفو</em&gt; الفحص للالميتوكوندريا المغيرون في الموجة الكهرومغناطيسية عن طريق المعدلة وراثيا للإضاءة الحيوية<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

الإنتاجية المتوسطة فحص فحوصات لتقييم الآثار على Ca2 +-إشارات ورد فعل أكروسومي في الحيوانات المنوية البشرية

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...