This research was funded by the Canadian Regulatory System for Biotechnology (CRSB) and Chemicals Management Plan (CMP) initiatives.

<ol>
	<li>Ahmadi, A., Ng, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fertilizing+ability+of+DNA-damaged+spermatozoa.">Fertilizing ability of DNA-damaged spermatozoa.</a> J. Exp. Zool. 284 (6), 696-704 (1999).</li><li>Crow, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origins,+patterns+and+implications+of+human+spontaneous+mutation.">The origins, patterns and implications of human spontaneous mutation.</a> Nat. Rev. Genet. 1 (1), 40-47 (2000).</li><li>Nelson, K., Holmes, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Malformations+due+to+presumed+spontaneous+mutations+in+newborn+infants.">Malformations due to presumed spontaneous mutations in newborn infants.</a> N. Engl. J. Med. 320 (1), 19-23 (1989).</li><li>Kong, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rate+of+de+novo+mutations+and+the+importance+of+father's+age+to+disease+risk.">Rate of de novo mutations and the importance of father's age to disease risk.</a> Nature. 488 (7412), 471-475 (2012).</li><li>Michaelson, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-genome+sequencing+in+autism+identifies+hot+spots+for+de+novo+germline+mutation.">Whole-genome sequencing in autism identifies hot spots for de novo germline mutation.</a> Cell. 151 (7), 1431-1442 (2012).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+repair+decline+during+mouse+spermiogenesis+results+in+the+accumulation+of+heritable+DNA+damage.">DNA repair decline during mouse spermiogenesis results in the accumulation of heritable DNA damage.</a> DNA Repair (Amst). 7 (4), 572-581 (2008).</li><li>Marchetti, F., Wyrobek, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+consequences+of+paternally-transmitted+chromosomal+abnormalities.">Mechanisms and consequences of paternally-transmitted chromosomal abnormalities.</a> Birth Defects Res. C. Embryo. Today. 75 (2), 112-129 (2005).</li><li>Demarini, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Declaring+the+existence+of+human+germ-cell+mutagens.">Declaring the existence of human germ-cell mutagens.</a> Environ. Mol. Mutagen. 53 (3), 166-172 (2012).</li><li>Epstein, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+the+dominant-lethal+test+to+detect+genetic+activity+of+environmental+chemicals.">Use of the dominant-lethal test to detect genetic activity of environmental chemicals.</a> Environ. Health. Perspect. 6, 23-26 (1973).</li><li>Russell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray-induced+mutations+in+mice.">X-ray-induced mutations in mice.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 16, 327-336 (1951).</li><li>Singer, T. M., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ+cell+mutagens:+Risk+assessment+challenges+in+the+21st+century.">Germ cell mutagens: Risk assessment challenges in the 21st century.</a> Environ. Mol. Mutagen. 51 (8-9), 919-928 (2010).</li><li>Tareke, E., Rydberg, P., Karlsson, P., Eriksson, S., Tornqvist, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylamide:+A+cooking+carcinogen.">Acrylamide: A cooking carcinogen.</a> Chem. Res. Toxicol. 13 (6), 517-522 (2000).</li><li>Witt, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+bone+marrow+micronucleus+test+results+do+not+predict+the+germ+cell+mutagenicity+of+N-hydroxymethylacrylamide+in+the+mouse+dominant+lethal+assay.">Mouse bone marrow micronucleus test results do not predict the germ cell mutagenicity of N-hydroxymethylacrylamide in the mouse dominant lethal assay.</a> Environ. Mol. Mutagen. 41 (2), 111-120 (2003).</li><li>Marchetti, F., Rowan-Carroll, A., Williams, A., Polyzos, A., Berndt-Weis, M. L., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sidestream+tobacco+smoke+is+a+male+germ+cell+mutagen.">Sidestream tobacco smoke is a male germ cell mutagen.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (31), 12811-12814 (2011).</li><li>Yauk, C. L., Dubrova, Y. E., Grant, G. R., Jeffreys, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+single+molecule+analysis+of+spontaneous+and+radiation-induced+mutation+at+a+mouse+tandem+repeat+locus.">A novel single molecule analysis of spontaneous and radiation-induced mutation at a mouse tandem repeat locus.</a> Mutat. Res. 500 (1-2), 147-156 (2002).</li><li>Niwa, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indirect+mechanisms+of+genomic+instability+and+the+biological+significance+of+mutations+at+tandem+repeat+loci.">Indirect mechanisms of genomic instability and the biological significance of mutations at tandem repeat loci.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 61-72 (2006).</li><li>Campbell, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+the+human+mutation+rate+using+autozygosity+in+a+founder+population.">Estimating the human mutation rate using autozygosity in a founder population.</a> Nat. Genet. 44 (11), 1277-1281 (2012).</li><li>Beal, M. A., Glenn, T. C., Somers, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+genome+sequencing+for+quantifying+germline+mutation+frequency+in+humans+and+model+species:+Cautious+optimism.">Whole genome sequencing for quantifying germline mutation frequency in humans and model species: Cautious optimism.</a> Mutat. Res. 750 (2), 96-106 (2012).</li><li>Shwed, P. S., Crosthwait, J., Douglas, G. R., Seligy, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+MutaMouse+lambdagt10-lacZ+transgene:+Evidence+for+in+vivo+rearrangements.">Characterisation of MutaMouse lambdagt10-lacZ transgene: Evidence for in vivo rearrangements.</a> Mutagenesis. 25 (6), 609-616 (2010).</li><li>Lambert, I. B., Singer, T. M., Boucher, S. E., Douglas, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detailed+review+of+transgenic+rodent+mutation+assays.">Detailed review of transgenic rodent mutation assays.</a> Mutat. Res. 590 (1-3), 1-280 (2005).</li><li>OECD. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> OECD Guideline for the testing of chemicals: Transgenic rodent somatic and germ cell gene mutation assays. , (2011).</li><li>Rodriguez, M., Panda, B. B., Ficsor, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Testes+weight+reflect+ethylnitrosourea+induced+histopathology+in+mice.">Testes weight reflect ethylnitrosourea induced histopathology in mice.</a> Toxicol. Lett. 17 (1-2), 77-80 (1983).</li><li>Russell, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+male+germ-cell+stage+on+the+frequency,+nature,+and+spectrum+of+induced+specific-locus+mutations+in+the+mouse.">Effects of male germ-cell stage on the frequency, nature, and spectrum of induced specific-locus mutations in the mouse.</a> Genetica. 122 (1), 25-36 (2004).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Harvesting+sperm+and+artificial+insemination+of+mice.">Harvesting sperm and artificial insemination of mice.</a> J. Vis. Exp. (3), 184 (2007).</li><li>Gossen, J. A., Molijn, A. C., Douglas, G. R., Vijg, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+galactose-sensitive+E.+coli+strains+as+selective+hosts+for+LacZ-+plasmids.">Application of galactose-sensitive E. coli strains as selective hosts for LacZ- plasmids.</a> Nucleic Acids Res. 20 (12), 3254 (1992).</li><li>Lemieux, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+measurement+of+benzo[a]pyrene-induced+pig-a+and+lacZ+mutations,+micronuclei+and+DNA+adducts+in+muta+mouse.">Simultaneous measurement of benzo[a]pyrene-induced pig-a and lacZ mutations, micronuclei and DNA adducts in muta mouse.</a> Environ. Mol. Mutagen. 52 (9), 756-765 (2011).</li><li>Douglas, G. R., Jiao, J., Gingerich, J. D., Gossen, J. A., Soper, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporal+and+molecular+characteristics+of+mutations+induced+by+ethylnitrosourea+in+germ+cells+isolated+from+seminiferous+tubules+and+in+spermatozoa+of+lacZ+transgenic+mice.">Temporal and molecular characteristics of mutations induced by ethylnitrosourea in germ cells isolated from seminiferous tubules and in spermatozoa of lacZ transgenic mice.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (16), 7485-7489 (1995).</li><li>Russell, W. L., Hunsicker, P. R., Raymer, G. D., Steele, M. H., Stelzner, K. F., Thompson, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dose--response+curve+for+ethylnitrosourea-induced+specific-locus+mutations+in+mouse+spermatogonia.">Dose--response curve for ethylnitrosourea-induced specific-locus mutations in mouse spermatogonia.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 79 (11), 3589-3591 (1982).</li><li>Swiger, R. R., Cosentino, L., Shima, N., Bielas, J. H., Cruz-Munoz, W., Heddle, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cII+locus+in+the+MutaMouse+system.">The cII locus in the MutaMouse system.</a> Environ. Mol. Mutagen. 34 (2-3), 201-207 (1999).</li><li>Singer, T. M., Lambert, I. B., Williams, A., Douglas, G. R., Yauk, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+induced+male+germline+mutation:+Correlations+and+comparisons+between+traditional+germline+mutation+assays,+transgenic+rodent+assays+and+expanded+simple+tandem+repeat+instability+assays.">Detection of induced male germline mutation: Correlations and comparisons between traditional germline mutation assays, transgenic rodent assays and expanded simple tandem repeat instability assays.</a> Mutat. Res. 598 (1-2), 164-193 (2006).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

בהשוואה לשיטות מסורתיות, assay המוטציה של תא הנבט TGR מספק אמצעי מהיר יותר, חסכוני יותר, ורגיש יותר לכימות מושרה במוטציות תאי נבט vivo. על ידי הערכת transgene MF ישירות בזרע, בניגוד לצאצאים, מספר בעלי החיים, זמן ומשאבים הדרושים להערכת המוטגניות בתאי המין של כל תרכובת אחת מצטמצמים באופן משמעותי. במונחים של רגישות, שהיינו מסוגלים לזהות גידול משמעותי 2.6 לקפל בתאי גזע spermatogonia MF בעקבות חשיפה לENU / קילוגרם 25 מ&quot;ג רק באמצעות 5 חיות לכל קבוצת מינון. בניגוד לכך, assay המוקד הספציפי לא היה מסוגל לזהות כל שינוי משמעותי בMF באותו מינון זה באמצעות&gt; 3,000 עכברים בקבוצה החשופה ו&gt; 500,000 עכברי שליטה 28. בנוסף להתאמתה לשתי חקירות מכניסטית ורגולציה, שיטה זו מספקת הזדמנות למחקרים השוואתיים בין גופני וmutati שורת הנבטעל שיעורים. הראיות אחרונות עולה כי לכמה סוכני מוטציות תאי נבט יכולות להיגרם בריכוז נמוך מהנדרש למוטציה סומטיים. לדוגמא, חשיפה ממושכת לN-hydroxymethylacrylamide, מטבוליט של acrylamide קרצינוגן מזון 12, מגבירה את תדירות מוטציות תאי נבט קטלניות דומיננטיות בעכברים מבלי להשפיע על תדירות הגרעינון בתאי דם אדומים, מידה מסורתית של תא סומטי נזק ציטוגנטית 13. בנוסף, חשיפה של עכברים לשני תדרי המוטציה גורם עשן טבק הזרם המרכזי והעקיף גבוהים בלוקוסי DNA חוזרים טנדם בזרע במינונים שלא להגדיל את תדירות הגרעינון דם 14. ממצאים אלה קוראים תיגר על ההנחה שבדיקות genotoxicity סומטי היא תמיד הגנה של תאי המין, ולחזק את הביקוש לאמצעים יותר יעיל וחסכוניים לכמת תדירות מוטציה של תא נבט. עם זאת, הראיות לגורמי מוטציות תאי נבט מועדפים היא עדיין חלשות, בעיקר בשל המחסור בנתונים זמינים להשוואת שיעורי מוטציה ברקמות תא סומטי וניבטו. Assay המוטציה TGR מאפשר בדיקה והשוואה של שיעורי מוטציה מושרה ברקמות מרובות משתמשים באותו transgene מקבילים. לפיכך, מוטציה השוואתית בדיקה באמצעות assay TGR יעזור למלא פערי נתונים המקיפים את האפשרות של תופעות תא חיידק מועדפים. הערכה בו זמנית של מוטציה תא סומטי וניבט לבדיקת רגולציה תהיה גם לשפר את היעילות על ידי הקטנת מספר בעלי החיים הדרושים. הקו המנחה OECD למוטציה סומטיים ממליץ זמן ממשל 28 יום, ואחריו זמן של שלושה ימים דגימה (28 + 3). ניתוח של זרע cauda עשוי להציע רגישות עניים בנקודה זו בזמן, שכן הוא מתמקד בתאים שנחשפו בעיקר בשלבי spermatocyte וspermatid יצירת תאי הזרע (איור 3). תאים בשלבים אלה אינם לסנתז DNA ובהדרגה לאבד את היכולת שלהם לתיקון DNA 6 &lt;/ Sup&gt;. יתר על כן, זרע cauda הדגימה בנקודה זו בזמן לא יצליח לזהות מוטציות המתרחשות בתאי spermatogonia וגזע. לפיכך, להשתלבות בעיצוב 28 + 3, הקו המנחה OECD ממליץ איסוף תאי נבט מאבוביות הזרע. אוכלוסייה מעורבת זה מכילה תאים שמקורם בסינתזה של DNA וסוגי תאי תיקון מיומן, הכוללים תאי גזע, ונחשפות על פני רוב שלבי זרע ראשוניים. עם זאת, בשל האופי המעורב של תאים אלה, ניתוח תא אבוביות זרע אינו מספק מידע שלב ספציפי. יתר על כן, קיים חשש שנוכחותם של תאים שאינם יעד יכולה להשפיע על MF נצפה (למשל שיחות mutagen תא חיידק חיוביות כוזבות עקב זיהום של תאים סומטיים שעברו מוטציה, או דילול של אות תא חיידק שעבר מוטציה מתאי נבט DNA תיקון לקוי) . כרגע יש מספיק נתונים ללהסיק האם תוצאות מתאי אבוביות זרע ב28 + 3 הצעה אותה רגישות וסגוליותזרע cauda של בנקודות זמן מאוחר יותר. המעבדה שלנו היא משווה כיום MFS המושרה בתאי seminiferous tubules וזרע cauda נאספו לאחר פעמים דגימה שונות כדי לטפל בנקודה זו. נציין כי הקו המנחה OECD מצביע על זמן דגימה חלופי של 28 ימים לרקמות החלוקה לאט כגון הכבד, שעשויה גם להיות מתאים לניתוח תא חיידק. עם זאת, הנתונים זמינים הוא עדיין לא מספיק ואין באפשרותנו כיום להמליץ ​​תכנון ניסוי אחד ואחד לניתוח סימולטני של תאים סומטיים ותאי נבט באמצעות assay המוטציה TGR לבדיקת רגולציה. אחד מאפיינים של assay זה שיש לציין הוא שאירועי מוטאציות מוערכים על transgene שאינו עכברי. עם זאת, יש עדויות רבות לכך שtransgene מגיב לחומרי גורמי מוטציות סביבתיות באופן דומה לגנים אנדוגני 20. בנוסף, מכיוון שמקורותיה המדויקים של אירועי מוטאציות עצמאיים קשיםלפתור, תוצאות הן בדרך כלל כפי שדווחו בתדירות מוטציה (בניגוד לתדירות מוטציה). תדירות המוטציה בפועל יכולה להיפתר אם תוצאות מתוקנות להרחבה משובט (כלומר. החלוקה והכפלה של תא מוטציה יחיד שיכול לתרום לתדירות הנצפית של מוטציות transgene) על ידי רצפי DNA. רצף של transgenes המוטציה ניתן לבצע כדי לאפיין את מוטציות lacZ, ולזהות מוטציות שעשויות לנבוע מאירועי הרחבה משובטים, למרות שזה מוסיף באופן משמעותי לזמן והעלות של הניתוח. בנוסף לגן lacZ, theλgt10 וקטור מהונדס מטפח גן חלופי טמפרטורה תלויה מוטציה-כתב: גרסה של הגן כת&quot;ש λ, שהוא (294 נ&quot;ב לעומת 3021 נ&quot;ב lacZ, איור 1) קצר יותר וקלים יותר לרצף 29. רצף גם מאפשר הניתוח של ספקטרום המוטציה המושרה, מתן תובנה mutatioמנגנון סופי של המתחם בשאלה. דוגמא קיצונית להרחבה משובט היא ההתרחשות של מוטציה &quot;קופה&quot; (כלומר., מוטציות transgene בשלב מאוד מוקדם של הפיתוח של איבר שתורמות לMF באופן דרמטי גבוה, לעתים מאות עד אלפי פעמים יותר מאשר ברקע). בעלי חיים או רקמות עם מוטציה &quot;קופה&quot; יש להסיר מהניתוח. Assay שתארנו הוא רחב החלים על מודלים TGR אחרים כגון עכבר BigBlue וחולדה, ועכבר פלסמיד lacZ, אשר כולם נמל וקטורים דומים כתב מוטציה (שנסקרו ב20). רובם המכריע של מחקרי תאי נבט שנערכו עד כה, כי שימוש בשיטות דומות התמקדו גורמי מוטציות מאופיינות כמעט באופן בלעדי על גם כמו ENU וקרינה (שנסקרה ב30). צפוי כי עם שחרורו האחרון של הקו המנחה מבחן OECD לassay TGR, assay זה יהיהפופולרי יותר ויותר להקרנה כימית והערכת רגולציה. התאגדות של assay המוטציה של התא הנבט TGR לסוללת בדיקת רגולציה תהיה למלא את הפער הקיים על ידי התרת הערכה יעילה של אינדוקציה מוטציה בתאי נבט 11. יתר על כן, assay זה יכול לשמש כדי למדוד MF כמעט בכל רקמות, מתן אמצעים מתאימים להשוואת הרגישויות היחסית של תאים סומטיים ותאי נבט לאינדוקציה של מוטציות על ידי סוכנים סביבתיים בנקודתי קצה גנטיות זהות.

מוטציות בדנ&quot;א סדירות בתאי המין יכולים להוביל להצלחה ברבייה מופחתת, ואם ירשו, עלול לגרום למחלה גנטית או נטייה מוגברת לסרטן אצל צאצאיהם 1-3. ראיות משמעותיות מוכיחות כי חלק גדול ממוטציות דה נובו בירושה מתאי המין מצד אבי 4, וכי מספר המוטציות בצאצאים מתואם חיובי עם גיל אב בעת ההפריה 5. השיעור גבוה יותר של מוטציות זכר הוא האמין להיות תוצאה של ההבדל בגיל בgametogenesis בין המינים, בהגדלת מספר חלוקות תא זרע ראשוניות בהשוואה למספר חלוקות תא oogenic בנקבה בתאי המין 2, וירידה הדרגתית בדנ&quot;א לתקן יעילות עם גיל אצל גברים. כל הגורמים הללו תורמים להסתברות מוגברת של טעויות שכפול בתאי המין הזכריים 6. עם זאת, ההשפעה של חשיפה אבהית לEnviroגורמי nmental בתדירות של מוטציות דה נובו נשאר לא ברורים. עם זאת, מספר גדול של גורמים סביבתיים ידוע כדי לגרום למוטציות תאי נבט במכרסמים 7, ויש ראיות גוברים שחלק מהסוכנים אלה יכול להשפיע גם על תאי המין האנושיים 8. למרות חששות אלה, כימיקלים נבדקים באופן שיגרתי ביכולתם לגרום למוטציות בתאים סומטיים למטרות תקינות והמקובל להניח שבדיקות סומטי יש בם כדי להגן על תאי המין. לכן, כימיקלים רק לעתים רחוקות העריכו ביכולתם לגרום למוטציות תאי נבט. בדיקות המוטגניות תאי נבט אחת סיבות הושמטו במידה רבה מתהליך קבלת החלטות רגולטוריות הוא חוסר מתודולוגיות מעשיות. שיטות מסורתיות המבוסס על מכרסמים, כגון קטלני 9 וספציפיות לוקוס 10 בדיקות הדומיננטיות, להעריך שיעורי מוטציה תא חיידק על ידי הבקיע פנוטיפים מוטציה בעוברים או צאצאים שלהורים נחשפו. מבחני אלו דורשים שימוש במספר גדול מאוד של בעלי חיים, זמן ומשאבים כדי לרכוש תוצאות משמעותיות מבחינה סטטיסטית. למרות מספר שיטות המודרניות לכימות מוטציה תא החיידק צמחו לאחרונה, רבים סובלים חסרונות במונחים של פרקטיות שלהם, יעילות, ואת הרלוונטיות ביולוגיות. לדוגמא, לחזור על מוטציות אורך בחוזרים בד בבד פשוט לוקוסים מורחבים (Estr) ניתן לכמת בתאי נבט גבריים תוך שימוש בגישה PCR מולקולה בודדת 15. עם זאת, ביצוע של שיטה זו יכול להיות מאתגר מבחינה טכנית ומייגע, ושלא כמו מוטציות נקודה, המשמעות הביולוגית ובריאותם של שינויים באורך חוזר של לוקוסי Estr מאוד לא יציבים תישאר 16 לא ברורים. טכנולוגיות רצף הגנום כולו מודרניות יכולות לספק שפע של נתונים משמעותיים מבחינה ביולוגית כאשר חלים על הבעיה של מוטציות תורשתיות 4,17, אבל העלות הגבוהה, שיעורי שגיאה גבוהים, האימות הקשורים נדרשותכדי לאשר את המוטציות, ואתגרים ביואינפורמטיקה עדיין להגביל את היישום השגרתי של אפשרות זו ביכולת בדיקת רגולציה 18. בזאת, אנו מתארים שיטה מעשית לכימות מוטציות הנגרמות באופן ישיר בתאי הנבט של עכברי זכרים מהונדסים. פרוטוקול זה מתואר למודל MutaMouse המהונדס, שבו יש עותקים בשרשור מרובים של וקטור הפאג λgt10 רקומביננטי המכיל גן כתב Escherichia coli lacZ שולב שני העותקים של כרומוזום 3 19 (איור 1). פרוטוקול זה הוא רלוונטי גם למכרסמים מהונדסים דגמים אחרים (TGR) המבוססים על אותם העקרונות (BigBlue עכבר וחולדה, או עכבר פלסמיד lacZ, וכו &#39;.) או גני כתב מעט שונים (עכבר דלתא GPT ועכברוש, מודלים TGR נסקרו בet למברט אל. 20). שיטה זו מבוססת על assay המוטציה TGR המתואר שבפורסם לאחרונהומתוקן קו מנחה מבחן OECD 21 ואנו לפרט על השיקולים המיוחדים הנדרשים כדי להתאים הערכה של מוטציות בתאי המין הגבריים בגלל המאפיינים הייחודיים של יצירת תאי זרע. בקצרה, assay כרוך בחשיפת עכברים הטרנסגניים זכר לחומר mutagenic, ואחריו זמן דגימה שבו נגעים טרום מוטאציות קבועות למוטציות יציבים. בזמן הדגימה נבחר, עכברים מורדמים ותאי נבט נאספים משתי יותרת האשך cauda או אבוביות זרע. כפי שנראה להלן, השפעות mutagenic בשלבים שונים של יצירת תאי זרע ניתן לקבוע על ידי בחירת הזמן בין החשיפה ואיסוף דגימה. מוסיף מהונדס, הכוללים מספר עותקים של הגנום הפאג λ לכל תא, מבודדים מהדנ&quot;א הגנומי תא חיידק וארוז לתוך capsids הריק λ הפאג יצירת חלקיקי הפאג λ זיהומיות המשמשים לאחר מכן להדביק E. מארח coli. החיידקים הנגועים גדלים על אין תמיכה בבחירהתקשורת מופרזת שיכול להבחין בין תאים המכילים וקטור עם העתק שעבר מוטציה של lacZ מתאי מחסה lacZ wild-type. השפעת mutagenic של חשיפה בתאי המין הזכרי נקבעת על ידי השוואת התדירות של transgenes מוטציה בין שליטה ועכברים שטופלו (איור 2, שנסקר בלמברט et al. 20). מספר גדול של תאי נבט יכול להיות assayed מעכבר אחת, נותן רגישות מעולה assay זה על פני שיטות מסורתיות, תוך צמצום מספר בעלי החיים הדרושים. ובגלל שאין ציוד או הכשרה מיוחד נדרש, assay זה מספק אפשרות מעשית ויעילה לבדיקת המוטציה של תא הנבט ברוב מעבדות ביולוגיה המודרניות טוקסיקולוגיה / מולקולריות. דרישה הכרחית אחת ליישום האפקטיבי של assay המוטציה של תא הנבט TGR היא הבנה של מחזור הזרע הראשוני (איור 3). הזמן לתאי נבט עכבר כדי להתקדם מstתאים אותם באבוביות הזרע לspermatogonia, spermatocytes, spermatids, ולבסוף להתבגר זרע ביותרת האשך (כלומר. יצירת תאי זרע) היא כ 49 ימים. מוטציה יכולה להתרחש בשלבים שונים של המחזור הזה והוא לעתים קרובות ספציפי מתחם. שתי תכונות עיקריות שהם רלוונטיים במיוחד לmutagenesis בתאי נבט גבריים הן הפסקת סינתזת DNA במהלך מיוזה המוקדמת, והאובדן ההדרגתי של יכולת תיקון DNA 6 בהודעה מיוזה-המאוחרת, שני תהליכים הנדרשים לאינדוקציה והקיבוע של רוב המוטציות. בגלל המאפיינים הייחודיים אלה של יצירת תאי זרע, יש שלושה משתנים ניסיוניים קריטיים להתנהלות של assay המוטציה של תא הנבט TGR: (1) זמן ממשל מתחם בדיקה; זמן הדגימה (2); ו (3) הבחירה של אוכלוסיית תאי נבט לאסוף לניתוח (איור 3 ולוח 1). זמן מנהל הוא experimeמשתנה פתיחות opening סגירות closures שקובעת כמה תאי יעד ארוכים נחשפים לתרכובות הבדיקה. גם אורכו של זמן הממשל יכול לשמש יעד חשיפות לסוגי תאים ספציפיים או שלבים של יצירת תאי זרע. לדוגמא, ממשל יום אחד יכול לשמש כדי לקבוע את ההשפעות של חשיפה אקוטית לסוג תא מסוים אחד. בדומה לכך, חשיפה יכולה להיות ממוקדת לשלב זרע ראשוני כל, למשל על ידי פגיעת spermatocytes רק חלוקת meiotically, או mitotically חלוקת spermatogonia באמצעות זמן ממשל 2 בשבוע וזמן דגימה מתאים. פעמים כרוניות ותת כרוניות ממשל משמשות כדי להעריך את ההשפעות של חשיפה לטווח ארוכה, על מנת להבטיח הפצה הפרמקוקינטי מספקת של מתחם הבדיקה, או לאפשר להצטברות מספקת של מוטציות מחומרי גורמי מוטציות חלשות (לדוגמא זמן ממשל 28 יום מומלץ במבחן OECD קו מנחה). זמן דגימה הוא משתנה הקריטי לקביעה שבשלב של יצירת תאי זרע תאי המטרה היו בעת החשיפה. זמן הדגימה מכתיב כמה זמן, ולכן איך התקדם הרבה יותר במחזור הזרע הראשוני, תאים עוברים דרך לאחר החשיפה. לדוגמא, כדי לחקור תופעות בspermatogonia תאי גזע, זמן דגימה&gt; 49 ימים נדרשים אם איסוף זרע הבשיל באופן מלא, או&gt; 42 ימים אם איסוף תאי נבט לא בוגרים מאבוביות הזרע, על מנת להבטיח כי יש לו את כל התאים שנאספו מספיק זמן כדי לפתח מנחשף נובע תאים. חשוב לציין כי זמן דגימה של לפחות 70 ימים יהיה עדיף להפגין השפעת תאי גזע אמיתית כדי לספק מספיק זמן להפצה הפרמקוקינטי של toxicant, לחיסול התאים שנחשפו בשלבים מאוחר יותר של יצירת תאי זרע, ולתת דין וחשבון ל תקופה של עקרות זמניות שעלולים להתרחש ~ 6 שבועות לאחר חשיפה לתרכובות mutagenic מאוד 22. באופן דומה, זמן דגימה של 21 ימים יבטיח כי Colle הזרעcted מיותרת אשך cauda היה רק ​​השלים מיוזה ביום האחרון של חשיפה. ניתן לאסוף תאי נבט כזרע בוגר מיותרת אשך cauda, ​​או כתערובת של סוגי תאי זרע ראשוניים שונים מאבוביות הזרע. זרע למבוגרים להישאר בcauda ל~ 3 ימים, כך שניתן לקבוע ברמת דיוק יחסי סוג התא או שלב של יצירת תאי זרע שממנו הזרע מקורו לכל עיצוב ניסיוני נתון. לפיכך, ניתוח של היתרי זרע cauda ממוקד חקירות של השפעות מוטציה בשלב מסוים. מצד השני, השעיות תא שנאספו מאבוביות הזרע מכילות תערובת של סוגי תאי נבט שונים בשלבים שונים של פיתוח, ובכך להציע רזולוציה עניות יותר של שלב הזרע הראשוני שבמוטציות מקורו. בנוסף, השעיות תא התאוששו מאבוביות הזרע נוטות להכיל ייצוג יתר של spermatids, ואחריו spermatocytes, וverכמה spermatogonia y ותאי גזע (פרופורציות אלה מיוצגות על ידי פסים לבנים סיימו באיור 3). יתר על כן, השעיות הוכנו מאבוביות הזרע עשויות להכיל גם תאים סומטיים שונים. כך, משום שסוגי תאים רבים כל כך נמצאים, יכולות להיות מושפעות השפעות מוטאציות על ידי מגוון רחב של תאים שאינם יעד. עם זאת, איסוף דגימות מאבוביות זרע מציע אפשרות חסכונית לבו זמנית הקרנת סוגים שונים של תא הנבט, ושילוב קל של ניתוח תא חיידק לפרוטוקול בדיקת OECD הסטנדרטי למוטציה סומטיים. לחזור ולהדגיש, בהתאם לצרכים של החוקר, זמן ממשל, זמן דגימה ואוכלוסיית תאים שנאספו יכול להיות מותאם לחקור את ההשפעות של חשיפה בסוגי תאים שונים ובשלבים שונים של תהליך יצור תאי זרע. על ידי הבחירה בזהירות משתנה אלה, יכולים להיות מתוכננים ניסויים למחקרים מכניסטית ממוקדים, או לבדיקת רגולציה כללית יותרing מטרות. כדי להשיג בקיאות בassay, אנו ממליצים על השימוש בנטילה דרך פה חריף של 100 מ&quot;ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU), ואחריו 70 יום זמן דגימת בקרה חיובית כ. ניתוח של זרע cauda כך מטרות תאי גזע spermatogonial (איור 3), אשר בדרך כלל מציגים עלייה של פי 4-5 בתדירות מוטציה (MF) על הפקדים הבאים מינון mutagenic הזה מאוד של ENU. יש לציין כי מינון זה ידוע לגרום 6 שבועות עקרות לפרסם חשיפה, ובכך זה לא יכול להיות מנת שליטה מתאימה לזמני דגימה קצרים יותר. מינון זה יהיה גם לייצר גידול לזיהוי בMF ברוב הרקמות סומטיות 20. תוצאות הנציג המובאות להלן נוצרו בעקבות משטר חשיפה אקוטי +70 באמצעות שלוש מנות של ENU עד וכולל 100 מ&quot;ג / קילוגרם.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1326">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:380px;">Name of Reagent/Material</td>
			<td style="width:145px;">Company</td>
			<td style="width:137px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:664px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MutaMouse</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">E.coli (lacZ-/galE-)</td>
			<td>Covance</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;">See reference 25 in manuscript</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Chloroform</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>3001-2-40</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s phosphate-buffered saline (D-PBS)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-250</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), 0.5M, pH 8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>03690 FLUKA</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isoamyl alcohol</td>
			<td>Caledon</td>
			<td>2/10/7900</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lennon LB broth base</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12780-029</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Stainless steel mesh filter</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S3770</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Transpack packaging extract</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200220</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M3148</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl alcohol, anhydrous (EtOH)</td>
			<td>Commercial Alcohols</td>
			<td>-</td>
			<td style="width:664px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Ampicilin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11593-027</td>
			<td style="width:664px;">prepare 20 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Kanamycin</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11815-024</td>
			<td style="width:664px;">prepare 5 mg/ml in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenol</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15509-097</td>
			<td style="width:664px;">Saturate in 0.1 M Tris-HCl as per manufacturers direction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phenyl-&#946;-D-galactopyranoside (P-Gal)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6501</td>
			<td style="width:664px;">dissolve 3 g per 10 ml of dimethylformamide</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Proteinase K</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>25530-031</td>
			<td style="width:664px;">prepare 60 mg/ml solution dH2O just before use, 20 &#181;l per sample</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium acetate (NaAc)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP333-500</td>
			<td style="width:664px;">prepare 3M solutution, pH 5.2</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L4390</td>
			<td style="width:664px;">prepare 10% solution in dH2O</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">1 M MgSO4</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">24.6 g MgSO4&#183;7H2O per 100 ml dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">20% maltose solution</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">20.0 g maltose, 24.6 g MgSO4&#183;7H2O, per 100 ml dH2O, filter sterilize, sore at 4&#7506;C up to 6 months</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Bottom agar</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 64 ml per sample (8 pitri plates per sample X&#160; 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C before pouring into Petri plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">LB Broth</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.0 g LB base, 6.4 g NaCl per 1L dH2O. Autoclave and cool</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline sodium citrate (SSC)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">150 mM NaCl, 15 mM trisodium citrate, pH 7.0&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="50">
			<td height="50" style="height:50px;">SM Buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">5.8 g NaCl, 2.0 g MgSO4&#183;7H2O, 50 ml 1 M Tris-HCl (pH 7.5), 5.0 ml of gelatin (2% w/v), per 1L dH2O, autoclave, store at room temperature up to 1 year</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TE buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, mutant plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L dH2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;">Top agar, titre plates</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td style="width:664px;">Prepare 32 ml per sample (4 mutant plates per sample X 8 ml per plate): 5.0 g LB base, 6.4 g NaCl, 7.5 g agar, per 1L H2O. Autoclave and cool to 50&#7506;C. Add MgSO4 to 10 mM and P-Gal to 3 g/L</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

transgenic rodent assay for quantifying male germ cell mutant frequency

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for assessing the induction of germ cell mutations require the use of large numbers of animals, making them impractical. As such, germ cell mutagenicity is rarely assessed during chemical testing and risk assessment. Herein, we describe an in vivo male germ cell mutation assay using a transgenic rodent model that is based on a recently approved Organisation for Economic Co-operation and Development (OECD) test guideline. This method uses an in vitro positive selection assay to measure in vivo mutations induced in a transgenic &#955;gt10 vector bearing a reporter gene directly in the germ cells of exposed males. We further describe how the detection of mutations in the transgene recovered from germ cells can be used to characterize the stage-specific sensitivity of the various spermatogenic cell types to mutagen exposure by controlling three experimental parameters: the duration of exposure (administration time), the time between exposure and sample collection (sampling time), and the cell population collected for analysis. Because a large number of germ cells can be assayed from a single male, this method has superior sensitivity compared with traditional methods, requires fewer animals and therefore much less time and resources.

עם ספירת פלאק ממוצעת של 200,000 לוחות לכל בעל חיים, אנו בדרך כלל לצפות MF רקע ממוצע של כ 2.8 x 10 -5 בתאי נבט גבריים עם סטיית תקן של 1.7 x 10 -5 בקבוצות הביקורת שלנו (המבוסס על נתונים משמונה עצמאיים ניסויים). עם ספירה זו פלאק, רמת רקע ושונות, קבוצות מינון עם n = 5 חיות כל יש בם כדי לזהות עלייה של 2 קיפול בMF עם כוח&gt; 0.8. תוצאות מדווחות בדרך כלל בפורמטים טבלאיים או גרפיים. לוח 2 ואיור 6 מראים תוצאות נציג מזרע cauda של זכרים MutaMouse (n = 5 לכל קבוצה) שנחשף למנה אחת חריפה אוראלית של 0, 25, 50, ו100 מ&quot;ג / קילוגרם N-אתיל-N-nitrosourea (ENU) ואחריו זמן דגימה 70 יום. תקופת 70 יום זה מאפשרת המדידה של אירועי מוטאציות שהתרחשו בזרע שהיו בתאי גזע spermatogonial בעת החשיפה (איור 3). צפיפויות לוחית טיפוסיות על צלחות מוטציה וכיילו מוצגות באיור 7. כפי שמתוארות בטבלה 2 ואיור 6, חשיפת ENU חריפה הנגרמת עלייה תלוית מינון משמעותית בMF של תאי גזע spermatogonial. המינון הנמוך מושרה עלייה משמעותית 2.6 לקפל מעל פקדים, שהייתה לי MF בסיסי של 2.6 x 10 -5. אינדוקציה המרבית התרחשה במינון הגבוה, שהושר על גידול של פי 4.4 על פקדים. ניתן למצוא דוגמא של assay זה מבוצע על תאי נבט אבובית seminiferous בדאגלס et al. 27, שבו MF נקבע בתאי נבט אבובית במרווחי זמן שונים הבאים זריקת intraperitoneal חוזרת 5 יום 50 מ&quot;ג / קילוגרם ENU. במחקר ש, תדרי מוטציה בתאי seminiferous גדלו עד 15 ימים לאחר טיפול ונשארו קבוע לאחר מכן. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr tr=""><td> אקספומשטר בטוח </td><td> רקמה שנאספה </td><td> סוג תא שנאסף (תא מטרה) </td><td> שלב של תא המטרה בתחילת החשיפה </td><td> שלבים עברו במהלך חשיפה </td></tr><tr><td> חריף + 70 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td> 14 + 21 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 14 + 35 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> תאי גזע </td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td> 28 + 3 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> Spermatocyte </td><td> Spermatocyte Spermatid זרע למבוגרים </td></tr><tr><td></td><td> קשיות </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td><td> Spermatogonia </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatocyte </td><td></td><td> Spermatocyte </td></tr><tr><td></td><td></td><td> Spermatid </td><td></td><td> Spermatid </td></tr><tr><td> 28 + 49 </td><td> Cauda </td><td> זרע למבוגרים </td><td> cel גזע </td><td> תאי גזע </td></tr><tr><td></td><td> קשיות </td><td> תאי גזע Spermatogonia Spermatocyte Spermatid </td><td> תאי גזע </td><td> תאי גזע </td></tr></tbody></table> טבלת 1 סוגים סלולריים ושלבים של יצירת תאי זרע שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> קבוצת המינון </td><td> # בעלי חיים </td><td> המוטציה PFU </td><td> סה&quot;כ PFU </td><td> MF (x10 -5) </td><td> ממוצע MF (x 10 -5) </td><td> שינוי של פי </td><td> p-value </td></tr><tr><td> בקרה </td><td> 1 </td><td> 5 </td><td> 180,245 </td><td> 2.8 </td><td> 2.6 </td><td> 1.0 </td><td> - </td></tr><tr><td></td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 137,835 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 3 </td><td> 11 </td><td> 385,672 </td><td> 2.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 4 </td><td> 2 </td><td> 431,396 </td><td> 0.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 5 </td><td> 6 </td><td> 152,413 </td><td> 3.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 25 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 6 </td><td> 17 </td><td> 162,353 </td><td> 10.5 </td><td> 6.9 </td><td> 2.6 </td><td> 0.0002 </td></tr><tr><td></td><td> 7 </td><td> 14 </td><td> 150,094 </td><td> 9.3 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 8 </td><td> 4 </td><td> 154,401 </td><td> 2.6 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 9 </td><td> 9 </td><td> 154,401 </td><td> 5.8 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 10 </td><td> 12 </td><td> 196,978 </td><td> 6.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 11 </td><td> 17 </td><td> 155,727 </td><td> 10.9 </td><td> 9.3 </td><td> 3.6 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 12 </td><td> 11 </td><td> 135,847 </td><td> 8.1 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 13 </td><td> 25 </td><td> 193,499 </td><td> 12.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 14 </td><td> 12 </td><td> 133,859 &lt;/ Td&gt; <td> 9.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 15 </td><td> 14 </td><td> 252,807 </td><td> 5.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 100 מ&quot;ג / קילוגרם </td><td> 16 </td><td> 26 </td><td> 170,968 </td><td> 15.2 </td><td> 11.5 </td><td> 4.4 </td><td> &lt;0.0001 </td></tr><tr><td></td><td> 17 </td><td> 28 </td><td> 234,584 </td><td> 11.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 18 </td><td> 10 </td><td> 145,289 </td><td> 6.9 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 19 </td><td> 35 </td><td> 292,236 </td><td> 12.0 </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> 20 </td><td> 22 </td><td> 190,848 </td><td> 11.5 </td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> לוח 2: תדירות המוטציה lacZ בזרע cauda של מ &#39;גברים מהונדסיםקרח נחשף בחריפות לENU כשהיו תאי spermatogonial גזע (זמן = יום 1 ממשל, זמן דגימה = 70 ימים). PFU = יחידת יצירת פלאק, MF = תדירות מוטציה. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig1highres.jpg" /> איור 1 ייצוג סכמטי של מבנה הפאג λgt10. <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig2highres.jpg" /> איור 2 מתאר של assay המוטציה תא החיידק מכרסם המהונדס. <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" /> איור 3 תרשים סכמטי של תהליך יצור תאי זרע בעכבר וסוגי התאים וPHAs<html> es שממוקדים על ידי assay המוטציה מכרסם המהונדס על ידי עיצובים ניסיוניים שונים הערה:. ברים הלבנים סיימו מייצגים את חלקם היחסי של סוגי תאים קיימים בהשעיות תא שהוכנו מאבוביות הזרע (כלומר spermatids&gt; spermatocytes&gt;&gt; תאי גזע spermatogonia). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51576/51576fig3highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig4highres.jpg" /> איור 4 אוסף של יותרת האשך cauda העכבר. ) עושה חתך בבטן לכיוון שק אשכים. B) זהה את epididymal שומן כרית. C) משוך בעדינות את כרית השומן כדי להוציא את האשכים ויותרת האשך. D) אתר, ולהסיר את יותרת האשך cauda. ss = &quot;jove_content&quot; FO: לשמור-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig5highres.jpg" /> איור 5 הכנת ההשעיה של תאי נבט מאבוביות הזרע. ) מבצעת חתך בכמוסת האפיתל של האשך, חושף אבוביות הזרע. B) אבוביות הזרע הם סחט של הקפסולה. C) רולר רקמות עובר בעדינות על הצינוריות בזווית של 5-10 מעלות ל לשחרר את תאי נבט הכלול בתוך. D) ההשעיה תא החיידק נאסף לעיבוד נוסף. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig6highres.jpg" /> איור 6 ייצוג גרפי של תדירות המוטציה lacZ בזרע MutaMouse נחשף בחריפות כתאי גזע לENU (n = 5). כלמשולש מייצג את MF של חיה אחת. * p &lt;0.05 כפי שנקבע על ידי רגרסיה פואסון. <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" width="600" src="/files/ftp_upload/51576/51576fig7highres.jpg" /> איור 7 צלחות אגר נציג מassay המוטציה המכרסם המהונדס עם שלטים נוצרו על דשא של א &#39; חיידקי מארח coli. ) הצלחות &quot;המוטציה&quot; תהיה לי מעט מאוד לוחות (מסומנים בחיצים), במיוחד בקבוצות מינון שליטה, אשר יהיו מעת לעת אפס שלטים על כמה צלחות. B) הצלחות &quot;כייל&quot; יכולות להיות מאות שלטים.

Watch this Scientific Journal Video about Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency at JoVE.com

Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

De novo mutations arise mostly in the male germline and may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Traditional methods for ...

transgenic-rodent-assay-for-quantifying-male-germ-cell-mutant

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

16.2K Views.  Environmental Health Centre. De novo mutations in the male germline may contribute to adverse health outcomes in subsequent generations. Here we describe a protocol for the use of a transgenic rodent model for quantifying mutations in male germ cells induced by environmental agents.

Video: Transgenic Rodent Assay for Quantifying Male Germ Cell Mutant Frequency

Primary Dissociated Midbrain Dopamine Cell Cultures from Rodent Neonates

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation from systemic input from elsewhere in the brain. In our lab, we use these neurons to assess dopamine release kinetics using carbon fiber amperometry, as well as expression levels of dopamine related genes and proteins using quantitative PCR and immunocytochemistry. In this video, we show you how we generate these cultures from rodent neonates.
The process involves several steps, including the plating of cortical glial astrocytes, the conditioning of neuronal cell culture media by the glial substrate, the dissection of the midbrain in neonates, the digestion, extraction and plating of dopamine neurons and the addition of neurotrophic factors to ensure cell survival.
The applications suitable for such a preparation include electrophysiology, immunocytochemistry, quantitative PCR, video microscopy (i.e., of real-time vesicular fusion with the plasma membrane), cell viability assays and other toxicological screens.

Primary dissociated midbrain dopamine cell cultures allow for the study of presynaptic characteristics of dopamine neurons. They can be used to monitor real-time dopamine release kinetics and protein/mRNA levels of regulators of dopamine exocytosis. Here, we show you how to generate these cultures from rodent neonates.

ראשי ניתק דופמין במוח התיכון Cell תרבויות מן ילודים מכרסמים

The ability to create primary cell cultures of dopamine neurons allows for the study of the presynaptic characteristics of dopamine neurons in isolation ...

Modified Mouse Embryonic Stem Cell based Assay for Quantifying  Cardiogenic Induction Efficiency

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways. One of the hurdles to its understanding has been the varied methods in correlating changes of key signaling events to differentiation efficiency. We describe here the use of a mouse embryonic stem (ES) cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. By scoring for contracting embryonic bodies (EBs) in a 96-well plate format, we can quickly quantify cardiogenic efficiency and identify crucial time windows for Wnt/&beta;-catenin and BMP signal activation in a time course following specific modulator treatments. The principal outlined here is not limited to cardiac induction alone, and can be applied towards the study of many other cell lineages. In addition, the 96-well format has the potential to be further developed as a high throughput, automated assay to allow for the testing of more sophisticated experimental hypotheses.

We describe the use of a mouse ES cell based assay to identify critical time windows for Wnt/&#946;-catenin and BMP signal activation during cardiogenic induction. The method provides a standardized platform that reliably quantifies cardiogenic efficiency, and it is applicable to the study of other cell lineages.

השתנה עכבר תא גזע עובריים Assay מבוסס על כימות יעילות אינדוקציה קרדיוגני

Differentiation of pluripotent stem cells is tightly controlled by temporal and spatial regulation of multiple key signaling pathways.  One of the hurdles ...

Quantifying the Frequency of Tumor-propagating Cells Using Limiting Dilution Cell Transplantation in Syngeneic Zebrafish

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as tumor-propagating cells, or tumor-initiating cells. It is thought that targeting these self-renewing cells for destruction will block tumor progression and stop relapse, greatly improving patient prognosis1. The most common way to determine the frequency of self-renewing cells within a tumor is a limiting dilution cell transplantation assay, in which tumor cells are transplanted into recipient animals at increasing doses; the proportion of animals that develop tumors is used the calculate the number of self-renewing cells within the original tumor sample2, 3. Ideally, a large number of animals would be used in each limiting dilution experiment to accurately determine the frequency of tumor-propagating cells. However, large scale experiments involving mice are costly, and most limiting dilution assays use only 10-15 mice per experiment. 
Zebrafish have gained prominence as a cancer model, in large part due to their ease of genetic manipulation and the economy by which large scale experiments can be performed. Additionally, the cancer types modeled in zebrafish have been found to closely mimic their counterpart human disease4. While it is possible to transplant tumor cells from one fish to another by sub-lethal irradiation of recipient animals, the regeneration of the immune system after 21 days often causes tumor regression5. The recent creation of syngeneic zebrafish has greatly facilitated tumor transplantation studies 6-8. Because these animals are genetically identical, transplanted tumor cells engraft robustly into recipient fish, and tumor growth can be monitored over long periods of time. Syngeneic zebrafish are ideal for limiting dilution transplantation assays in that tumor cells do not have to adapt to growth in a foreign microenvironment, which may underestimate self-renewing cell frequency9, 10. Additionally, one-cell transplants have been successfully completed using syngeneic zebrafish8 and several hundred animals can be easily and economically transplanted at one time, both of which serve to provide a more accurate estimate of self-renewing cell frequency.
Here, a method is presented for creating primary, fluorescently-labeled T-cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) in syngeneic zebrafish, and transplanting these tumors at limiting dilution into adult fish to determine self-renewing cell frequency. While leukemia is provided as an example, this protocol is suitable to determine the frequency of tumor-propagating cells using any cancer model in the zebrafish.

Limiting dilution cell transplantation assays are used to determine the frequency of tumor-propagating cells. This protocol describes a method for generating syngeneic zebrafish that develop fluorescently-labeled leukemia and details how to isolate and transplant these leukemia cells at limiting dilution into the peritoneal cavity of adult zebrafish.

כימות תדירות הגידול מתפשט תאים באמצעות הגבלת השתלת דילול ב Syngeneic דג הזברה

Self-renewing cancer cells are the only cell types within a tumor that have an unlimited ability to promote tumor growth, and are thus known as ...

Germ Cell Transplantation and Testis Tissue Xenografting in Mice

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies showed that microinjection of germ cells from fertile donor mice into the seminiferous tubules of infertile recipient mice results in donor-derived spermatogenesis and sperm production by the recipient animal2. The use of donor males carrying the bacterial &beta;-galactosidase gene allowed identification of donor-derived spermatogenesis and transmission of the donor haplotype to the offspring by recipient animals1. Surprisingly, after transplantation into the lumen of the seminiferous tubules, transplanted germ cells were able to move from the luminal compartment to the basement membrane where spermatogonia are located3. It is generally accepted that only SSCs are able to colonize the niche and re-establish spermatogenesis in the recipient testis. Therefore, germ cell transplantation provides a functional approach to study the stem cell niche in the testis and to characterize putative spermatogonial stem cells. To date, germ cell transplantation is used to elucidate basic stem cell biology, to produce transgenic animals through genetic manipulation of germ cells prior to transplantation4,5, to study Sertoli cell-germ cell interaction6,7, SSC homing and colonization3,8, as well as SSC self-renewal and differentiation9,10.
Germ cell transplantation is also feasible in large species11. In these, the main applications are preservation of fertility, dissemination of elite genetics in animal populations, and generation of transgenic animals as the study of spermatogenesis and SSC biology with this technique is logistically more difficult and expensive than in rodents. Transplantation of germ cells from large species into the seminiferous tubules of mice results in colonization of donor cells and spermatogonial expansion, but not in their full differentiation presumably due to incompatibility of the recipient somatic cell compartment with the germ cells from phylogenetically distant species12. An alternative approach is transplantation of germ cells from large species together with their surrounding somatic compartment. We first reported in 2002, that small fragments of testis tissue from immature males transplanted under the dorsal skin of immunodeficient mice are able to survive and undergo full development with the production of fertilization competent sperm13. Since then testis tissue xenografting has been shown to be successful in many species and emerged as a valuable alternative to study testis development and spermatogenesis of large animals in mice14.

Protocols for germ cell transplantation and testis tissue xenografting are described. Germ cell transplantation results in donor-derived spermatogenesis in recipient testes and represents a functional reconstitution assay for identification of spermatogonial stem cells (SSCs). Testis tissue xenografting reproduces testis development and spermatogenesis of various donor species in recipient mice.

נבט השתלת ורקמות testis Xenografting ב עכברים

Germ cell transplantation was developed by Dr. Ralph Brinster and colleagues at the University of Pennsylvania in 19941,2. These ground-breaking studies ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell migration, gene expression, cell cycle progression and cell adhesion 1. Rho proteins are molecular switches that are active in GTP-bound and inactive in GDP-bound state. Their activation is mediated by a family of Guanine-nucleotide Exchange Factor (GEF) proteins. Rho-GEFs constitute a large family, with overlapping specificities 2. Although a lot of progress has been made in identifying the GEFs activated by specific signals, there are still many questions remaining regarding the pathway-specific regulation of these proteins. The number of Rho-GEFs exceeds 70, and each cell expresses more than one GEF protein. In addition, many of these proteins activate not only Rho, but other members of the family, contributing further to the complexity of the regulatory networks. Importantly, exploring how GEFs are regulated requires a method to follow the active pool of individual GEFs in cells activated by different stimuli. Here we provide a step-by-step protocol for a method used to assess and quantify the available active Rho-specific GEFs using an affinity precipitation assay. This assay was developed a few years ago in the Burridge lab 3,4 and we have used it in kidney tubular cell lines 5,6,7. The assay takes advantage of a "nucleotide free" mutant RhoA, with a high affinity for active GEFs. The mutation (G17A) renders the protein unable to bind GDP or GTP and this state mimics the intermediate state that is bound to the GEF. A GST-tagged version of this mutant protein is expressed and purified from E. coli, bound to glutathione sepharose beads and used to precipitate active GEFs from lysates of untreated and stimulated cells. As most GEFs are activated via posttranslational modifications or release from inhibitory bindings, their active state is preserved in cell lysates, and they can be detected by this assay8. Captured proteins can be probed for known GEFs by detection with specific antibodies using Western blotting, or analyzed by Mass Spectrometry to identify unknown GEFs activated by certain stimuli.

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

The method presented here describes an assay to follow activation of RhoA specific GDP/GTP Exchange Factors (GEFs) in cultured cells by making use of a mutant RhoA GST fusion protein that has high affinity for activated GEFs. GEFs are precipitated from cell lysates, detected by Western blotting and quantified by densitometry.

הזיקה של רטיבות פעילים Rho-GEFs שימוש GST-מתויג מוטנטי חלבון Rho (GST-RhoA (G17A)) מ lysates תא אפיתל

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

Separation of Spermatogenic Cell Types Using STA-PUT Velocity Sedimentation

Mammalian spermatogenesis is a complex differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous tubules of the testes. Currently, there is no reliable cell culture system allowing for spermatogenic differentiation in vitro, and most biological studies of spermatogenic cells require tissue harvest from animal models like the mouse and rat. Because the testis contains numerous cell types - both non-spermatogenic (Leydig, Sertoli, myeloid, and epithelial cells) and spermatogenic (spermatogonia, spermatocytes, round spermatids, condensing spermatids and spermatozoa) - studies of the biological mechanisms involved in spermatogenesis require the isolation and enrichment of these different cell types. The STA-PUT method allows for the separation of a heterogeneous population of cells - in this case, from the testes - through a linear BSA gradient. Individual cell types sediment with different sedimentation velocity according to cell size, and fractions enriched for different cell types can be collected and utilized in further analyses. While the STA-PUT method does not result in highly pure fractions of cell types, e.g. as can be obtained with certain cell sorting methods, it does provide a much higher yield of total cells in each fraction (~1 x 108 cells/spermatogenic cell type from a starting population of 7-8 x 108 cells). This high yield method requires only specialized glassware and can be performed in any cold room or large refrigerator, making it an ideal method for labs that have limited access to specialized equipment like a fluorescence activated cell sorter (FACS) or elutriator.

The STA-PUT method allows for the separation of different populations of spermatogenic cells based on size and density.

הפרדה של סוגי תאי Spermatogenic שימוש בשקיעה מהירות STA-PUT

Mammalian spermatogenesis is a complex  differentiation process that occurs in several stages in the seminiferous  tubules of the testes. Currently, there ...

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes differentiation from a stem cell population, mitotic amplification, and meiosis. In addition, post-meiotic germ cells undergo a dramatic morphological reshaping process as well as a global epigenetic reconfiguration of the germ line chromatin&#8212;the histone-to-protamine switch.
Studying the role of a protein in post-meiotic spermatogenesis using mutagenesis or other genetic tools is often impeded by essential embryonic, pre-meiotic, or meiotic functions of the protein under investigation. The post-meiotic phenotype of a mutant of such a protein could be obscured through an earlier developmental block, or the interpretation of the phenotype could be complicated. The model organism Drosophila melanogaster offers a bypass to this problem: intact testes and even cysts of germ cells dissected from early pupae are able to develop ex vivo in culture medium. Making use of such cultures allows microscopic imaging of living germ cells in testes and of germ-line cysts. Importantly, the cultivated testes and germ cells also become accessible to pharmacological inhibitors, thereby permitting manipulation of enzymatic functions during spermatogenesis, including post-meiotic stages.
The protocol presented describes how to dissect and cultivate pupal testes and germ-line cysts. Information on the development of pupal testes and culture conditions are provided alongside microscope imaging data of live testes and germ-line cysts in culture. We also describe a pharmacological assay to study post-meiotic spermatogenesis, exemplified by an assay targeting the histone-to-protamine switch using the histone acetyltransferase inhibitor anacardic acid. In principle, this cultivation method could be adapted to address many other research questions in pre- and post-meiotic spermatogenesis.

Ex vivo Culture of Drosophila Pupal Testis and Single Male Germ-line Cysts: Dissection, Imaging, and Pharmacological Treatment

This protocol describes the dissection and cultivation of intact testes and germ-line cysts from Drosophila melanogaster pupae. This method allows microscopic observation of spermatogenesis ex vivo. Furthermore, we describe a pharmacological assay of the effect of inhibitors on specific stages of germ-cell development in pupal testes.

אקס תרבות Vivo של דרוזופילה גלמי אשך וציסטות נבט אונליין רווק בן: Dissection, הדמיה, ותרופתי טיפול

During spermatogenesis in mammals and in Drosophila melanogaster, male germ cells develop in a series of essential developmental processes. This includes ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.

דור של הטרנסגניים<em&gt; הידרה</em&gt; על ידי Microinjection העובר

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among ...

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and experimentally tractable. It is economical and easy to culture and dispense in liquid medium which makes it well suited for medium-throughput screening. We have previously validated the use of transgenic luciferase expressing C. elegans strains to provide rapid in vivo assessment of the nematode&#8217;s ATP levels.1-3 Here we present the required materials and procedure to carry out bioassays with the bioluminescent C. elegans strains PE254 or PE255 (or any of their derivative strains). The protocol allows for in vivo detection of sublethal effects of drugs that may identify mitochondrial toxicity, as well as for in vivo detection of potential beneficial drug effects. Representative results are provided for the chemicals paraquat, rotenone, oxaloacetate and for four firefly luciferase inhibitory compounds. The methodology can be scaled up to provide a platform for screening drug libraries for compounds capable of modulating mitochondrial function. Pre-clinical evaluation of drug toxicity is often carried out on immortalized cancerous human cell lines which derive ATP mostly from glycolysis and are often tolerant of mitochondrial toxicants.4,5 In contrast, C. elegans depends on oxidative phosphorylation to sustain development into adulthood, drawing a parallel with humans and providing a unique opportunity for compound evaluation in the physiological context of a whole live multicellular organism.

A Screenable In Vivo Assay for Mitochondrial Modulators Using Transgenic Bioluminescent Caenorhabditis elegans

A protocol is described for in vivo detection of effects of mitochondrial inhibitors in the model organism Caenorhabditis elegans and for identification of potential enhancing compounds. This protocol can be used to screen drug libraries for compounds modulating mitochondrial function.

Screenable<em&gt; In vivo</em&gt; Assay עבור מיטוכונדריאלי מאפנני שימוש הטרנסגניים Bioluminescent<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The multicellular model organism Caenorhabditis elegans is a small nematode of approximately 1 mm in size in adulthood that is genetically and ...

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm cell to penetrate the zona pellucida and fertilize the egg. It is therefore of great interest to test compounds (e.g., environmental chemicals or drug candidates) for their effect on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm either to examine the potential adverse effects on human sperm cell function or to investigate a possible role as a contraceptive. Here, two medium-throughput assays are described: 1) a fluorescence-based assay for assessment of effects on Ca2+-signaling in human sperm, and 2) an image cytometric assay for assessment of acrosome reaction in human sperm. These assays can be used to screen a large number of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm. Furthermore, the assays can be used to generate highly specific dose-response curves of individual compounds, determine potential additivity/synergism for two or more compounds, and to study the pharmacological mode of action through competitive inhibition experiments with CatSper inhibitors.

Medium-throughput Screening Assays for Assessment of Effects on Ca2+-Signaling and Acrosome Reaction in Human Sperm

Here, two medium-throughput assays for assessment of effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm are described. These assays can be used to quickly and easily screen large amounts of compounds for effects on Ca2+-signaling and acrosome reaction in human sperm.

הקרנת מבחני עבור הערכה של השפעות על Ca2 +תפוקה בינונית-איתות ותגובה Acrosome זרע אנושי

Ca2+-signaling is essential to normal sperm cell function and male fertility. Similarly, the acrosome reaction is vital for the ability of a human sperm ...

המהונדס מכרסמים Assay עבור תדר Mutant תאי ניבט זכר כימות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video