This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1. إعداد العينات البيولوجية لتجميد كسر / تجميد حفر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام صياغة تثبيتي EM التقليدية مثل غلوتارالدهيد 2٪ + 2٪ امتصاص العرق في 0.1 م العازلة الفوسفات لمدة 1 ساعة. لإجراء التثبيت الأولي من الأنسجة البيولوجية. ملاحظة: في حين أنه قد يكون من المرغوب فيه تجميد بعض أنواع العينات دون تثبيت مسبق، والدم المنقولة الاحتياطات العالمية الممرض ولاية تثبيت المناسبة حيث تتكون العينة من الأنسجة البشرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التثبيت الأولي، وشطف العينة في نفس عازلة تستكمل مع 0.2 M السكروز مدة لا تزيد عن 1 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل العينة إلى حل cryoprotectant تتكون من الجلسرين 25٪ في 0.1 م العازلة الفوسفات مدة لا تزيد عن 1 ساعة. </li></ol> 2. تجميد وتخزين العينات قبل تجميد كسر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر الذهب أو النحاس عينة بذرة من حجم وشكل العينة المناسب ليتم معالجتها (الشكل 4 </stرونغ&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط الصف غرامة و / أو قياس موقف إبر حقنة صغيرة شظايا صغيرة من العينة على رأس كعب عينة المعدن. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض محتوى السائل من العينة إلى زجة، الغراء قليلا مثل الاتساق عن طريق رسم خارج السائل من حافة كعب مع ورق الترشيح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النسخ المتماثلة واحدة، استخدام إبر صغيرة مقياس حقنة لخلق كومة من الأنسجة على كعب. النسخ المتماثلة مزدوجة، عكس كعب آخر وضعه بالضبط على كعب ووضعه برفق على سطح العينة خلق شطيرة (الشكل 5A). لا تضغط على عينة من بذرة من بين اثنين. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء سفينتين ديوار معزولة مع النيتروجين السائل. ملاحظة: السفينة الأولى يستوعب وظيفة المعدنية التي تحتوي على بئر صغير الذي يستخدم لتسييل كمية صغيرة من غاز البروبان من اسطوانة المتاحة تجاريا (الشكل 5B). السفينة الثانية هي التخزين المقسمة / عقد سفينة للجيزةلاي الحفاظ على العينات المجمدة تحت النيتروجين السائل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فوهة الاسطوانة وضعه في البئر البروبان، افتح صمام اسطوانة والسماح لتدفق الغاز في البئر السفينة الأولى حيث سيتم تسييل. ملاحظة: تحذير! البروبان متفجر، قد تسبب تجميد الإصابة على الاتصال، ويعتبر خانقة. استخدام البروبان فقط في غطاء الكيميائية المعتمدة لمثل هذا الاستخدام مع الحرص على تجنب مصادر الاشتعال غريبة، وذلك باستخدام الملابس الواقية ضد درجات الحرارة المنخفضة، والحفاظ على التهوية الكافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أسرع وقت ممكن، والتقاط عينة جبل بالملقط الصف غرامة ويغرق عليه في الغاز المسال في أول سفينة لعدة ثوان ثم نقل بسرعة الى السفينة عقد الثانية من النيتروجين السائل (الشكل 5B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة يتم تجميد العينات وتخزينها تحت النيتروجين السائل حتى جاهزة للنقل إلى محطة تجميد كسر. نقل بذرة إلى تخزين أكبر النيتروجين السائل الحاويات ديوار للتمديدينبغي أن تؤخذ تخزين إذا رغبت، ولكن الحرص على عدم السماح للبذرة لذوبان الجليد. </li></ol></li></ol> 3. عملية لتجميد كسر صك وتجهيز العينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل العينات على حامل نحاس والى غرفة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل بذرة عينة الذهب في كتيب من نوع نسخة مزدوج حامل عينة أو المشبك الجهاز تحت النيتروجين السائل والحفاظ هناك حتى على استعداد لوضع في غرفة العينة (الشكل 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما حقق فراغ الغرفة عالية (حوالي 2 × 10 -6 م بار) وتم تبريد المرحلة إلى درجة حرارة النيتروجين السائل، وإيقاف المضخة، وتنفيس الغرفة، ووضع عينة بذرة شنت على الطاولة عينة في أسرع وقت ممكن . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على مضخة، إعادة فراغ عالية، واستخدام مرحلة ودرجة الحرارة ذراع التحكم الإلكترونية لضبط درجة الحرارة جدول العينة إلى -100 درجة مئوية والنيتروجين السائل مباشرة إلى الذراع مشراح وBRIنانوغرام إلى درجة حرارة النيتروجين السائل. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عملية كسر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> على تحقيق فراغ عالية، ودرجة حرارة -100 درجة مئوية مرحلة والذراع مشراح في درجة حرارة النيتروجين السائل، وفتح عن بعد مزدوج حامل عينة طبق الأصل مما كسر العينات على يتصاعد العينة (تجميد fracture_movie1.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في حالة العينات المعدة للالحفر كسر التالية، استخدم شفرة حلاقة الاحتفاظ بها في المشبك على الذراع مشراح أن يحلق (أي كسر) سطح العينات بدلا من خطوة 3.2.1 (تجميد-etch_movie2.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كانت خطوة الحفر تجميد المضافة هي التي يتعين القيام بها، ضع الذراع مشراح تبريد فوق السطوح كسر واحد لعدة دقائق. ملاحظة: هذه المناورة سامية (أي حفر) الماء من سطح كسر. تأثير هذه المناورة هو الكشف عن خلية الأسطح الحقيقية، المصفوفة خارج الخلية، و / أو التجمعات الجزيئية من التسامي من المياه، بالإضافة إلى FRActure يواجه تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التظليل المعدنية والدعم نسخة التبخر باستخدام البنادق الإلكترون <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل البلاتين / الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة والسماح لها تتبخر طبقة رقيقة (حوالي 2 نانومتر) من البلاتين / الكربون على سطح كسر من زاوية من 30º - 45º. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفعيل الإلكترون الكربون أو بندقية المقاومة كما في الخطوة 3.3.1 وتتبخر طبقة رقيقة من الكربون على سطح عينة من كسر مباشرة (90º) النفقات العامة لتقديم الدعم إلى النسخة المتماثلة. وهذا يتطلب عادة حوالي 15-20 ثانية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استرجاع النسخ المتماثلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند الانتهاء من التظليل التكرار والاستقرار الكربون، إيقاف مضخة فراغ، وتنفيس الغرفة، وإزالة عينة من جبل الصك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام زوج من ملقط الصف غرامة إزالة كل كعب عينة الذهب من ضعفكتيب متماثلة / المشبك والسماح لذوبان الجليد لعدة ثوان قبل خفض بلطف كعب على سطح الماء في لوحة البقعة (الشكل 7). ملاحظة: النسخة المتماثلة الكربون / البلاتين تحتوي على مواد العينة ملتصقة سوف تطفو على سطح الماء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناورة النسخ المتماثلة باستخدام سلك حلقة غرامة أو التقليدية النحاس الإلكترون شبكة المجهر عقدت بواسطة ملقط الصف غرامة ونقل إلى مكان آخر لوحة تحتوي على 5٪ ثاني كرومات الصوديوم في حامض الكبريتيك 50٪ للواحد إلى عدة ساعات. ملاحظة: هذا الحمام يساعد على هضم المواد البيولوجية الفعلية عينة من النسخة المتماثلة. يمكن استبدال قوة الكامل التبييض المنزلية لثاني كرومات / محلول حمض الكبريتيك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال عملية الهضم، ونقل النسخة المتماثلة مرة أخرى إلى سطح المياه النظيفة واسترداد على معيار النحاس الإلكترون المجهري الشبكة. (ملاحظة: النسخ قد تفتيت إلى قطع صغيرة أثناء عملية الهضم ولكنها قد تحتوي حتى النسخ المتماثلة صغيرة جدا معلومات جوهرية ويجب أن تكون RETRieved وفحصها.) مخزن نسخة تدعم شبكات في صناديق الشبكة المتاحة تجاريا حيث ستبقى مستقرة لسنوات مع معالجة طيف. </li></ol></li></ol> 4. التركيبية فحص تجميد كسر / النسخ حفر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مشاهدة النسخ المتماثلة في المجهر الإلكتروني النافذ في لتسريع الجهد عادة 50-80 كيلو فولت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسجيل الصور ذات الصلة على الفيلم TEM القياسية أو مع كاميرا رقمية عالية الدقة. </li></ol>

<ol>
	<li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens.">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li><li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker.">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li><li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues.">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+faces+of+frozen+membranes.">Fracture faces of frozen membranes.</a> ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release.">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+inner+dynein+arms,+radial+spokes,+and+the+central+pair/projection+complex+of+cilia+and+flagella.">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+the+outer+dynein+arm.">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li><li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick-freeze,+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells.">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+freeze,+deep+etch+of+the+cytoskeleton.">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li><li>Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy:+Methods+and+Protocols.">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li><li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization.">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li><li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+membrane.">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li><li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future.">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium.">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium:+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture.">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+organization,+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets.">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li><li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability.">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro.">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium:+A+freeze-fracture+study.">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li><li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells.">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li><li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2++in+epithelial+cells.">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li><li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+teratogen+on+[3H]uridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions.">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li><li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium.">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell &amp; Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease.">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect &amp; Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li><li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung.">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute,+low+level+sulfur+dioxide+exposure.">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis.">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li><li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke.">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li><li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy,+surface+replication,+freeze-etching+and+label+fracture.">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes.">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li><li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes.">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

في السنوات التالية مقدمته والتوافر التجاري، تجميد كسر / واستخدمت على نطاق واسع لحفر إجراءات التحقيق في هيكل غشاء البيولوجي. في الواقع، لقد تم الحصول على أفضل وجهات النظر من بعض التخصصات الهيكلية للأغشية في الاستعدادات تجميد كسر / حفر. وساهمت هذه الدراسات ليس فقط لفهم...

تم تقديم مفهوم والتطبيق العملي لمعالجة تجميد كسر العينات البيولوجية بواسطة Steere 1 قبل أكثر من نصف قرن. جهاز أوائل خصصت المكونات المتباينة إلى مكتفية ذاتيا وحدة العمل 1. تم تعديل الجهاز الأصلي وصقلها في الأدوات المتاحة تجاريا من أجل استيعاب الحاجة الماسة للتلاعب عن بعد، وصيانة فراغ عالية، وتبخر الكربون والمعادن لإنتاج نسخة طبق الأصل مناسبة للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (الشكل 1 والشكل 2). يتكون الصك النموذجي لفراغ الغرفة عالية مع جدول العينة وجود الذراع مشراح ريغولابلي الانتاجية النيتروجين السائل (الشكل 1). يضم غرفة أيضا على مسدسين الإلكترون، واحدة لتحقيق الاستقرار تبخر الكربون المتمركزة على 90º زاوية لمرحلة عينة والآخر لالبلاتين عيوالأسطوانات / الكربون التظليل في زاوية قابلة للتعديل، وعادة 15º - 45º (الشكل 2). يتم تطبيق السلطة الى وحدة لتشغيل مضخة فراغ والألواح الإلكترونية ينظم تعديل درجة الحرارة والإلكترون السيطرة على السلاح. تصور أصلا كوسيلة لتحقيق تحسين التصوير من الفيروسات وتجميد كسر اكتسبت المزيد من الشعبية كأسلوب لفحص وتحليل أغشية الخلايا وتخصصاتهم 2، 3. في الواقع، كان هذا الإجراء جزءا لا يتجزأ من توضيح العلاقات هيكل / وظيفة في الخلايا والأنسجة والعديد من هذه الدراسات الوقوف صفا ومساهمات الكلاسيكية إلى الخلية والبيولوجيا الجزيئية 4-9. كان الهدف الرئيسي والأساس المنطقي لتطوير تقنية تجميد كسر للحد من التحف ملاحظتها في الإلكترون المجهري المستمدة من قرار التثبيت الكيميائية والمعالجة التقليدية المستخدمة في المجهر الإلكتروني البيولوجي. هنا الهدف هو الحد الكيميائيةتثبيت وتجميد العينة مع سرعة كافية وغالبا في وجود cryoprotectant من أجل الحد من تكوين بلورات الجليد والتحف تجميد الأخرى. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجدت هذه التقنية تجدد الاهتمام من علماء البيولوجيا الجزيئية والمحققين علوم المواد للفحص الجسيمات النانوية والمواد النانوية. تجميد كسر وتجميد حفر الصور تظهر طابع ثلاثي الأبعاد، وأحيانا مخطئون لالميكروسكوب الإلكتروني الماسح. ومع ذلك، يتم فحص الاستعدادات للتجمد الكسر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ومساهمة رئيسية لدراسات مورفولوجية عالية الدقة هو تمثيلها فريد من عناصر هيكل / وظيفة أغشية الخلايا. يبدأ التجهيز تجميد كسر من خلال تجميد الخلايا والأنسجة مع سرعة كافية للحد من بلورة الجليد و / أو مع استخدام وكلاء cryoprotectant مثل الجلسرين. ثم يتم كسر العينات تحت فراغ ومندوبيتم إنشاء LICA عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين على سطح كسر. يتم هضم العينة الأصلية من النسخ المتماثلة التي يتم استردادها على معيار EM العينة الشبكة. سوء تفسير آخر شائع من الصور للتجمد الكسر هي أنها توضح سطوح الخلايا. لكن المنطلق الأساسي لتجميد كسر هو أن يتم تقسيم الأغشية البيولوجية من خلال طبقة ثنائية الدهون من خلال عملية كسر (الشكل 3). هذه العملية في الأغشية البيولوجية غلة جهان كسر، واحد الذي يكشف عن تنظيم نصف الغشاء الملاصق للالسيتوبلازم، وPF وجه، واحد الذي يكشف عن نصف النشرة ثنائي الجزيء من الغشاء الذي هو المتاخمة للخارج الخلية الوسط، وEF وجه. لا تمثل سطوح الخلايا الحقيقية في الصور تجميد كسر ولكن تظهر فقط عند استخدام الخطوة اللاحقة أضاف تجميد الحفر باتباع الإجراء الكسر. من أجل حفر العينات بشكل فعال بكسر سابقا للكشف عن سطح التفصيللتر، يجب أن يتم تجميد العينات بمعدل سريع وبدون unetchablecryoprotectant. ويتم إنجاز الحفر من المياه من سطح العينة بكسر كشف الميزات الأساسية عن طريق وضع ذراع مشراح التبريد خلال المرحلة عينة خلق فرق درجة الحرارة بين مرحلة عقد العينة والتبريد الذراع مشراح الذي يسبب الماء لسامية من على سطح الأرض. عندما يتم تصعيد المياه من سطح العينة بكسر خلال المناورة-الحفر تجميد، ثم قد كشفت جوانب الأسطح الفعلية الخلية المصفوفة خارج الخلية، والهياكل هيكل الخلية، والتجمعات الجزيئية في ارتفاع القرار. وبالتالي تجميد كسر وتجميد حفر ليست حيث تبادل بل تعكس عملية تدريجية وهذه الأخيرة التي قد لا يكون ضروريا أو مرغوبا فيه تبعا لاحتياجات الدراسة معينة. بعد تجميد كسر / حفر إجراءات تجميد، تتعرض السطوح المتصدعة إلى evapora موجهةTIVE المعاطف من الكربون والبلاتين من أجل تقديم الدعم والتصوير النقيض من النسخة المتماثلة. قد يكون البلاتين / الكربون أحادي الاتجاه أو التبخر التصوير الدوارة ويتم إنجاز إما المقاومة أو البنادق الإلكترون. التظليل أحادي الاتجاه من زاوية معروفة، وعادة 30º - 45º، مفيد في أداء العمليات الحسابية المورفولوجية معينة. العينات التي تعرضوا إلى أعماق الحفر وعادة ما تكون دوارة مظلل ويتم عكس الصور الناتجة من هذه العينات فوتوغرافيا للتقييم. التاريخية فضلا عن الهدف الحالي للتجميد كسر / تجميد حفر تقنية هو الحد التثبيت الكيميائية ومعالجة العينات القطع الأثرية التي ترتبط مع المزيد من إجراءات انتقال المجهر الإلكتروني التقليدية. ومع ذلك، توفر هذه التقنية ميزة جوهرية في قدرته على إضفاء التفاصيل ثلاثي الأبعاد، وبالتالي تسهيل الحصول على البيانات المظهرية في البيولوجي، وعلم المواد، ونالعينات anotechnology. إجراءات تجميد كسر وتجميد حفر معقدة ومتعددة الأوجه، ويتم تخصيص بعض جوانب تطبيقها. يقدم هذا العرض وجهة نظر الدراسة من السمات الرئيسية لعملية ويشار القارئ لبروتوكولات شاملة نشرت 10 و 11 من أجل معالجة التفاصيل وتخصيص عملية لتلبية احتياجات بحثية محددة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

يصف تجميد كسر / تجميد عملية يتم بموجبها حفر العينات والبيولوجية عادة أو المواد متناهية الصغر في الطبيعة، والمجمدة، ومتشظية، وتكراره لتوليد الكربون / البلاتين &quot;الزهر&quot; يهدف للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. تخضع العينات معدلات تجميد ultrarapid، وغالبا في وجود وكلاء واق من البرد للحد من تكوين بلورات الجليد، مع انقسام لاحق من العينة في النيتروجين السائل تبريد تحت درجات حرارة عالية فراغ. يتم نسخ سطح بكسر الناتجة واستقرت عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين من زاوية أن يمنح السطح التفاصيل ثلاثي الأبعاد لالمدلى بها. وقد أثبتت هذه التقنية المنير خاصة للتحقيق في أغشية الخلايا وتخصصاتهم، وساهمت إلى حد كبير في فهم النموذج الخلوي للخلية وظيفة ذات الصلة. في هذا التقرير، إلا أننا مسح متطلبات الصك والبروتوكول الفني لأداءتجميد الكسر، والتسمية وخصائص الطائرات كسر المرتبطة بها، الاختلافات على الإجراء التقليدي، ومعايير لتفسير الصور للتجمد الكسر. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لتحقيق التركيبية في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية ويبشر بالخير باعتبارها تقنية التصوير الناشئة عن الجزيئي، وتكنولوجيا النانو، ودراسات علوم المواد.

فرضية رئيسيا من تجميد كسر صورة التفسير هو أن الطائرات كسر تمر عبر طبقة ثنائية المادة الدهنية من الأغشية منح جهان الكسر الذي دعا اليه الاتفاقية وجه PF (البلازما كسر وجه) وEF-الوجه (خارج الخلية كسر وجه) (الشكل 3). وPF وجه هو النصف من الغشاء الدهني طبقة ثنائية المتاخم...

Watch this Scientific Journal Video about Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy at JoVE.com

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات والأبعاد المكانية مستوى التركيبية في علوم المواد وتكنولوجيا النانو المنتجات.

العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Views.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات ?...

Video: Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

إعداد الأجنة المجهري للإلكترون من ذبابة الفاكهة أنبوب القلب الجنينية

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

الوقت الفاصل بين مرحلة التطور الجنيني المبكر من الميكروسكوب في انواع معينة ايليجانس

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

المجهر من دورة حياة الجنسية الانشطار الخميرة

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

توصيف تكلس الأحداث عن طريق لايف البصرية والمجهر الإلكتروني تقنيات في Tubeworm البحرية

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

إعداد ومراقبة العينات البيولوجية سميكة من قبل الضوئي نقل الإلكترون التصوير المقطعي

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

إعداد العينات البيولوجية بالتجميد ذات الضغط العالي، وتعزيز النقيض ساعدت الموجات الدقيقة، والحد الأدنى راتنج التضمين لتصوير حجم

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

المجهر الإلكتروني المتسلسل لمسح الوجه الكتلي (SBF-SEM) لعينات الأنسجة البيولوجية

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

إعداد الشبكة المجهرية كريو إلكترون للدراسات التي تم حلها عبر الزمن باستخدام نظام روبوتي جديد، Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

استراتيجيات لتحسين الحصول على بيانات التصوير المقطعي الإلكتروني المبرد

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.