This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

.1 הכנת ביולוגית דוגמאות להקפאה-בר / הקפאה-לחרוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בניסוח מקבע EM קונבנציונלי כגון 2% paraformaldehyde glutaraldehyde + 2% במאגר M 0.1 פוספט עבור שעה 1. לבצע קיבוע ראשוני של רקמות ביולוגיות. הערה: למרות שזה עשוי להיות רצוי להקפיא כמה סוגים של דגימות ללא קיבוע לפני, אמצעי זהירות הפתוגן דם נישא אוניברסלי מחייב קיבעון המתאים שבו הדגימה מורכבת מרקמה אנושית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות קיבעון עיקרי, לשטוף את הדגימה באותו החיץ בתוספת 0.2 M סוכרוז לא יותר מ 1 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הדגימה לפתרון cryoprotectant המורכב מגליצרול 25% ב0.1 חיץ פוספט M לא יותר משעה 1. </li></ol> .2 הקפאה ואחסון של דגימות מראש של הקפאה-שבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספחי דגימת זהב או נחושת בחרו בגודל מתאים ובצורה לדגימה בעיבוד (איור 4 </strong&gt;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים כיתה קנס ו / או שברים קטנים עמדת מד קטנה מחטי מזרק של הדגימה בחלק העליון של בדל דגימת מתכת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את תכולת הנוזל של הדגימה לדביקה, מעט דבק כמו עקביות על ידי ציור את הנוזל מקצה הבדל עם נייר סינון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעתקים יחידים, משתמש במחטי מזרק מד קטנות כדי ליצור תלולית של רקמה על הבדל. להעתקים כפולים, להפוך בדל ותפקיד אחר זה בדיוק מעל הבדל ולמקם בקלילות על פני השטח דגימת יצירת כריך (איור 5 א). אל תלחץ על הדגימה מבין שני הספחים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שני כלי דיואר מבודדים עם חנקן נוזלי. הערה: הכלי הראשון להכיל הודעה מתכת המכילה גם קטן המשמש להנזלת נפח קטן של גז פרופן מצילינדר זמין מסחרי (איור 5). הכלי השני הוא אחסון למחיצות / מחזיק כלי לקצרly שמירת דגימות קפואות תחת חנקן נוזלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השימוש בנחיר הגליל ממוקם בבאר פרופאן, לפתוח את שסתום הגליל ולאפשר גז לזרום לתוך הבאר של הכלי הראשון שבו הוא נוזל. הערה: זהירות !! PROPANE נפיץ, עלול לגרום להקפאת פציעה במגע, והוא ASPHYXIANT. השתמש פרופאן רק במנדף כימי מאושר לשימוש כזה מטפל גם להימנע ממקורות הצתה זרים, תוך שימוש בבגדי מגן מי טמפרטורות נמוכות, ושמירה על אוורור נאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהר ככל האפשר, לאסוף את דגימת הר עם מלקחיים כיתה משובחים ולנעוץ אותה בגז הנוזלי בכלי הראשון לכמה שניות ולאחר מכן להעביר במהירות לכלי מחזיק השני של חנקן נוזלי (איור 5). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שהדגימות קפואות, חנות תחת חנקן נוזלי עד מוכן להעביר למפעל הקפאה שבר. העבר את הספחים למכל דיואר חנקן נוזלי אחסון גדול יותר עבור מורחבאחסון אם תרצה בכך, עם זאת יש להיזהר שלא לאפשר לספחים להפשיר. </li></ol></li></ol> .3 מבצע של ההקפאה-שבר כלי ודגימת עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טעינת דגימות על בעל פליז ולתוך התא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את ספחי דגימת זהב לבעל דגימת העתק כפול חוברת סוג או לצבוט מכשיר תחת חנקן נוזלי ולשמור על קיים עד מוכן למצב בתא הדגימה (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התא השיג ואקום גבוה (כ -2 x 10 -6 mbar) והשלב כבר מקורר לטמפרטורה של חנקן נוזלי, לכבות את המשאבה, לפרוק הקאמרית, ומקם את ספחי דגימה רכובים על גבי שולחן הדגימה במהירות אפשרי . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המשאבה, להקים מחדש ואקום גבוה, ועושים שימוש בפקדי שלב וטמפרטורת זרוע אלקטרוניים כדי להתאים את טמפרטורת שולחן דגימה ל-100 ° C וחנקן נוזלי ישיר לזרוע microtome וbring אותו לטמפרטורה של חנקן נוזלי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תהליך שבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על השגת ואקום גבוה, טמפרטורת שלב של -100 ºC וזרוע microtome בטמפרטורה של חנקן נוזלי, מרחוק לפתוח את בעל דגימת העתק הכפול ובכך שבירה הדגימות על mounts הדגימה (בהקפאה fracture_movie1.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה של דגימות מיועדות לבר הבא תחריט, להשתמש בסכין גילוח נשמר במהדק על זרוע microtome לגלח (כלומר, שבר) את פני השטח של הדגימות במקום צעד 3.2.1 (בהקפאת etch_movie2.mov). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם צעד תחריט הקפאה נוסף הוא שיש לבצע, מקם את זרוע microtome המקורר מעל המשטחים הסדוקים לאחד למספר דקות. מים תמרון זה נשגב (כלומר, לחרוט) מהמשטח שבורה: הערה. ההשפעה של המהלך הזה היא לחשוף משטחים אמיתיים תא, מטריצת חוץ תאית, ו / או מכלולים מולקולריים על ידי סובלימציה של מים, בנוסף לfracture פרצופים עובר דרך bilayer השומנים של קרומים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצללת מתכת ואידוי תמיכת העתק באמצעות רובי אלקטרונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אקדח פלטינה / אלקטרון פחמן או התנגדות ולאפשר לו להתאדות שכבה דקה (כ 2 ננומטר) של פלטינה / פחמן על פני השטח שברים מזווית של 30º - 45º. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אלקטרון פחמן או אקדח התנגדות כמו בשלב 3.3.1 ולהתאדות שכבה דקה של פחמן אל פני השטח דגימה שבורים מישירות (90 מעלות) מעל לראש לתת תמיכה להעתק. זה בדרך כלל דורש כ 15 - 20 שניות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שליפה של העתקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם השלמת הצללת שכפול וייצוב פחמן, לכבות את משאבת הוואקום, לפרוק הקאמרית, ולהסיר את דגימת הר מהמכשיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת זוג המלקחיים כיתה קנס להסיר כל בדל דגימת זהב מכפולחוברת העתק / מהדק ולאפשר להפשיר במשך כמה שניות לפני שמעדנים את הבדל על גבי משטח מים בצלחת מקום (איור 7). הערה: העתק פחמן / פלטינה המכיל חומר דגימה חסיד יצוף על פני המים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתמרן את העתקים או באמצעות לולאת חוט דקה או רשת מיקרוסקופ אלקטרונים קונבנציונלית נחושת המוחזקת על ידי מלקחיים כיתה קנס והעברה לצלחת מקום אחר המכילה 5% dichromate נתרן ב50% חומצה גופרתית לאחד למספר שעות. הערה: אמבטיה זה מעכלת את חומר הדגימה ביולוגי בפועל מההעתק. אקונומיקה ביתית כוח מלא יכולה להחליף dichromate / פתרון החומצה גופרתי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העיכול יושלם, להעביר ההעתק בחזרה למשטח של מים נקי ולאחזור אל רשת במיקרוסקופ אלקטרונים נחושת סטנדרטית. (הערה: העתקים עשויות לפצל לחתיכות קטנות יותר במהלך עיכול אבל גם העתקים קטנים מאוד עשויים להכיל מידע משמעותי וצריכים להיות retrieved ובדק.) העתק חנות תמיכה רשתות בקופסות רשת זמינות המסחרית שבו הם יישארו יציבים במשך שנים עם טיפול עדין. </li></ol></li></ol> .4 Ultrastructural בחינת להקפיא בר / העתקים לחרוט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו בהעתקים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים במתח מאיץ בדרך כלל 50-80 ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקליט תמונות רלוונטיות על סרט TEM סטנדרטי או עם מצלמה דיגיטלית ברזולוציה גבוהה. </li></ol>

<ol>
	<li>Steere, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+structural+detail+in+frozen+biological+specimens.">Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens.</a> J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).</li><li>Pinto da Silva, P., Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+splitting+in+freeze-etching.+Covalently+bound+ferritin+as+a+membrane+marker.">Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker.</a> J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).</li><li>Friend, D. S., Gilula, N. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variations+in+tight+and+gap+junctions+in+mammalian+tissues.">Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues.</a> J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).</li><li>Branton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fracture+faces+of+frozen+membranes.">Fracture faces of frozen membranes.</a> ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).</li><li>Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+vesicleexocytosiscaptured+by+quick+freezing+and+correlated+with+quantal+transmitter+release.">Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release.</a> J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+inner+dynein+arms,+radial+spokes,+and+the+central+pair/projection+complex+of+cilia+and+flagella.">Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella.</a> J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).</li><li>Goodenough, U. W., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substructure+of+the+outer+dynein+arm.">Substructure of the outer dynein arm.</a> J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).</li><li>Hirokawa, N., Heuser, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick-freeze,+deep-etch+visualization+of+the+cytoskeleton+beneath+surface+differentiations+of+intestinal+epithelial+cells.">Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells.</a> J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).</li><li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quick+freeze,+deep+etch+of+the+cytoskeleton.">Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton.</a> Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).</li><li>Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze+fracture+and+freeze+etching.+Electron+Microscopy:+Methods+and+Protocols.">Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols.</a> Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).</li><li>Severs, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+electron+microscopy.">Freeze-fracture electron microscopy.</a> Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).</li><li>Gilula, N. B., Satir, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+necklace.+A+ciliary+membrane+specialization.">The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization.</a> J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).</li><li>Rohatgi, R., Snell, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ciliary+membrane.">The ciliary membrane.</a> CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).</li><li>Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+cilia+and+flagella-back+to+the+future.">Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future.</a> Biol Cell. 103, 249-270 (2011).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphometric+aspects+of+ciliary+distribution+and+ciliogenesis+in+human+nasal+epithelium.">Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium.</a> Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+observations+on+the+ultrastructure+of+mammalian+conducting+airway+epithelium:+Application+of+liquid+propane+freezing+and+rotary+shadowing+techniques+to+freeze-fracture.">New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture.</a> J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+organization,+and+function+of+tight+junctional+complexes+in+the+tracheal+epithelium+of+infant+ferrets.">Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets.</a> Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).</li><li>Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+claudin+interactions+in+airway+tight+junctional+permeability.">Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability.</a> Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+studies+of+hamster+tracheal+epithelium+in+vivo+and+in+vitro.">Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro.</a> J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+characterization+of+epithelial+cell+membranes+in+normal+human+conducting+airway+epithelium:+A+freeze-fracture+study.">Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study.</a> Am J Anat. 173, 257-268 (1985).</li><li>Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+calcium+signaling+via+gap+junctions+in+glioma+cells.">Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells.</a> J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).</li><li>Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+stimulation+and+intercellular+communication+increases+intercellular+CA2++in+epithelial+cells.">Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells.</a> Cell Regul. 1, 585-596 (1990).</li><li>Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+teratogen+on+[3H]uridine+nucleotide+transfer+between+human+embryonal+cells+and+on+gap+junctions.">Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions.</a> Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).</li><li>Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+intercellular+communication+and+differentiation+in+a+rapidly+developing+mammalian+airway+epithelium.">Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium.</a> Am J Respir Cell &amp; Molec Biol. 1, 385-390 (1989).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ciliary+membrane+alterations+occurring+in+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+infection.">Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection.</a> Science. 206, 349-351 (1979).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+on+cellular+and+subcellular+aspects+of+experimental+Mycoplasma+pneumoniae+disease.">Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease.</a> Infect &amp; Immun. 29, 1117-1124 (1980).</li><li>Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+observations+of+Pneumocystis+carinii+attachment+to+rat+lung.">Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung.</a> J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+appearance+of+compound+cilia+in+the+nasal+mucosa+of+normal+human+subjects+in+response+to+acute,+low+level+sulfur+dioxide+exposure.">The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure.</a> Environ Res. 42, 155-165 (1987).</li><li>Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructure+of+airway+epithelial+cell+membranes+among+patients+with+cystic+fibrosis.">Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis.</a> Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).</li><li>Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+ultrastructural+investigations+of+airway+epithelium+following+experimental+exposure+to+defined+air+pollutants+and+lifestyle+exposure+to+tobacco+smoke.">Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke.</a> InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).</li><li>Boonstra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunocytochemical+demonstrations+of+cytoplasmic+and+cell-surface+EGF+receptors+in+A431+cells+using+cryo-ultramicrotomy,+surface+replication,+freeze-etching+and+label+fracture.">Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture.</a> J Microscopy. 140, 119-129 (1985).</li><li>Fujimoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-fracture+replica+electron+microscopy+combined+with+SDS+digestion+for+cytochemical+labeling+of+integral+membrane+proteins.+Application+to+the+immunogold+labeling+of+intercellular+junctional+complexes.">Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes.</a> J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).</li><li>Quinn, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+tocopherol+on+the+structure+and+permeability+of+phosphatidylcholine+liposomes.">The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes.</a> J Control Release. 160, 158-163 (2012).</li></ol>

The author has nothing to disclose.

בשנים שלאחר השקתו וזמינות מסחרית, הקפאה שבר / נהלים לחרוט נוצלו באופן נרחב לחקירות של מבנה קרום ביולוגי. ואכן, נקודות המבט הטובות ביותר של חלק מההתמחויות המבניות של קרומים התקבלו בהכנות להקפיא בר / לחרוט. מחקרים אלה לא רק תרמו להבנה של המבנה הארגוני של ממברנות אלא גם ס?...

הרעיון והיישום מעשי של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות הוצג על ידי 1 סטיר יותר ממחצית לפני מאה שנה. המנגנון המוקדם ניכס רכיבים שונים ליחידה עצמאית עובדת 1. המנגנון המקורי שונה ומעודן לתוך מכשירים זמינים באופן מסחרי במטרה לענות על הצורך הקריטי במניפולציה מרחוק, תחזוקה של ואקום גבוה, והאידוי של פחמן ומתכות כדי לייצר העתק מתאים לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (איור 1 ואיור 2). המכשיר הטיפוסי מורכב של תא ואקום גבוה עם שולחן דגימה וזרוע microtome יש תפוקת חנקן נוזלית regulable (איור 1). התא כולל גם שני רובי אלקטרונים, אחד לייצוב אידוי פחמן ממוקם בזווית 90 מעלות לשלב דגימה והאחרת לPlatinum / פחמן הצללה בזווית מתכווננת, בדרך כלל 15º - 45º (איור 2). כוח ליחידה מוחל לתפעול משאבת הוואקום ולוחות אלקטרוניים לווסת שליטת התאמת הטמפרטורה ואלקטרון אקדח. הגה במקור כאמצעי להשגת הדמיה משופרת של וירוסים, להקפיא-שבר זכה לפופולריות עוד יותר כטכניקה לבחינה והניתוח של קרום תא וההתמחויות שלהם 2, 3. ואכן, הליך זה היה בלתי נפרד מהבהרת יחסי מבנה / תפקוד בתאים וברקמות ורבים מהמחקרים האלה עומדים כמו תרומות קלאסיות לביולוגיה מולקולרית של תא 4-9. המטרה העיקרית והרציונל לפיתוח של טכניקת הקפאה-השבר היה להגביל חפצים נצפים ברזולוציה מיקרוסקופית אלקטרונים הנובעות מקיבעון כימי והעיבוד השתמש במיקרוסקופ אלקטרונים ביולוגי קונבנציונלי. כאן המטרה היא להגביל כימיקיבעון ולהקפיא את הדגימה במהירות מספקת, ולעתים קרובות בנוכחות cryoprotectant כדי להגביל את היווצרות גבישי קרח וחפצי הקפאה אחרות. לאחרונה, בטכניקה זו מצאה התעוררות מחודשת של עניין מביולוגים מולקולריים וחוקרי מדע חומרים לבדיקה של חלקיקים וננו. תמונות בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט מפגינות אופי תלת ממדים ולעתים טועים לmicrographs אלקטרונים הסורקים. עם זאת, הכנות להקפיא בר נבחנות על ידי מיקרוסקופי אלקטרונים הולכה והתרומה הגדולה שלהם ללימודים מורפולוגיים ברזולוציה גבוהה היא הייצוג הייחודי שלהם של אלמנטי מבנה / תפקוד של קרום תא. עיבוד בהקפאה שבר הוא ביוזמת הקפאת תאים ורקמות במהירות מספיקה כדי להגביל את התגבשות קרח ו / או בשימוש בסוכנים cryoprotectant כגון גליצרול. לאחר מכן הדגימות שבר תחת ואקום ונציגLica מופק על ידי אידוי של פחמן ופלטינה על פני השטח שהברים. הדגימה המקורית מתעכלת מההעתק שמאוחזר על רשת דגימת EM סטנדרטית. עוד פירוש מוטעה נפוץ של תמונות להקפיא בר הוא שהם מתארים משטחי תא. עם זאת ההנחה הבסיסית של הקפאה שבר היא שקרומים ביולוגיים מפוצלים דרך bilayer השומנים על ידי תהליך שבר (איור 3). תהליך בקרומים ביולוגיים זה מניב שני פרצופים שבר, אחד החושף את הארגון של מחצית מהקרום הסמוך אל הציטופלסמה,-PF הפנים, ואחד אשר חושף את מחצית עלון bimolecular של הקרום שנמצאה בסמוך לתאי הסביבה,-EF הפנים. משטחי תא אמיתיים אינם מיוצגים בתמונות להקפיא בר אך מופיעים רק כאשר הצעד שנוסף לאחר הקפאת תחריט ביצוע הליך שבר משמש. כדי לחרוט ביעילות דגימות שבר בעבר כדי לחשוף detai משטחl, דגימות חייבות להיות קפוא בקצב מהיר וללא unetchablecryoprotectant. תחריט של מים מפני השטח של הדגימה שבר חושפת תכונות הבסיסיות מושגת על ידי הצבת זרוע קירור microtome מעל הבמה דגימת יצירת ההפרש טמפרטורה בין השלב מחזיק את הדגימה וזרוע microtome הקירור אשר גורמת למים נשגבים מהמשטח. כאשר מים בסובלימציה מפני השטח של הדגימה שבר במהלך תמרון תחריט ההקפאה, אז היבטים של משטחים בפועל תא, מטריצת חוץ תאית, מבני cytoskeletal, והרכבות מולקולריות עשויים להתגלות ברזולוציה גבוהה. כך בהקפאה שבר ולהקפיא לחרוט אינן תנאים להחלפה, אלא משקף את תהליך צעד חכם האחרונה שבם לא עשוי להיות נחוץ או רצוי בהתאם לצרכים של מחקר המסוים. בעקבות ההקפאה-הבר / להקפיא לחרוט נהלים, המשטחים הסדוקים חשופים לevapora המכווןtive שכבות של פחמן ופלטינה על מנת לספק תמיכה והדמיה ניגוד להעתק. אידוי ההדמיה / פחמן הפלטינה יכול להיות חד כיווני או סיבובי, והוא נעשה על ידי או התנגדות או רובי אלקטרונים. הצללה חד כיווני מזווית ידועה, בדרך כלל 30º - 45º, היא שימושית בביצוע חישובי morphometric מסוימים. דגימות שהיו נתונים לעמוקים תחריט בדרך כלל הן סיבוביות מוצל והתמונות כתוצאה של דגימות אלה מתהפכות photographically להערכה. ההיסטורי, כמו גם מטרה הנוכחית של הקפאה שבר טכניקת ההקפאה לחרוט / היא להגביל קיבעון כימי ועיבוד דגימת ממצאים הקשורים ליותר נהלים במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים קונבנציונליים. עם זאת, טכניקה זו מספקת יתרון מהותי ביכולתה להעניק פירוט תלת ממדים ובכך להקל על רכישה של נתונים morphometric במדע ביולוגי, חומר, וnדגימות anotechnology. נהלי ההקפאה שבר ולהקפיא לחרוט הם מורכבים ורבי פנים והיבטים מסוימים של היישום שלה מותאמים אישית. מצגת זו מציעה נוף סקר של התכונות העיקריות של התהליך והקורא מופנה לפרוטוקולים שפורסמו מקיפים 10, 11 על מנת לתת מענה לפרטים ולהתאמה אישי של התהליך לצרכי מחקר ספציפיים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

להקפיא בר / להקפיא לחרוט מתאר תהליך שבו דגימות, בדרך כלל ביולוגי או nanomaterial בטבע, הם קפואים, שבר, ומשוכפל ליצירת פחמן / פלטינה &quot;להפיל&quot; המיועד לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים. דגימות נתונים לשיעורי הקפאת ultrarapid, לעתים קרובות בנוכחות סוכני cryoprotective להגביל היווצרות גבישי קרח, עם השבירה הבאה של הדגימה בחנקן נוזלי מקוררת טמפרטורות תחת ואקום גבוה. המשטח סדוק התוצאה משוכפל והתייצב על ידי אידוי של פחמן ופלטינה מזווית שמקנה משטח פירוט תלת ממדי לשחקנים. טכניקה זו הוכיחה מאיר עיניים במיוחד לחקירה של קרום תא וההתמחויות שלהם ותרמה במידה ניכרת להבנה של צורה סלולרית לתפקוד תא קשור. בדוח זה, נסקור את דרישות המכשיר ופרוטוקול טכני לביצועהקפאה שבר, המינוח ומאפיינים של מטוסי שבר הקשורים, וריאציות על ההליך המקובל, וקריטריונים לפרשנות של תמונות להקפיא בר. טכניקה זו נמצאת בשימוש נרחב לחקירת ultrastructural בתחומים רבים של ביולוגיה של תא וטומנת בחובו הבטחה כטכניקת הדמיה המתעוררות למולקולרית, ננוטכנולוגיה, ולימודי מדע חומרים.

הנחת היסוד המרכזית של פרשנות תמונת הקפאה שבר הוא שמטוסי שבר עוברים דרך bilayer השומנים של קרומים המקנים שני פרצופים שבר, שנקרא על ידי אמנה-PF הפנים (שבר פנים פלזמה) וEF פנים (שבר פנים תאיים) (איור 3). -PF הפנים הוא מחצית מbilayer השומנים הקרום הסמוך לציטופלסמה של התא ו- EF ה?...

Watch this Scientific Journal Video about Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy at JoVE.com

Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastructural במדעי חומרים ומוצרי ננוטכנולוגיה.

טכני אלמנטים בסיסיים של ההקפאה-בר / הקפאה-לחרוט בביולוגי מיקרוסקופית אלקטרונים

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Views.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  טכניקות וחידודים של עיבוד הקפאה שבר של דגימות ביולוגיות וננו לבדיקה על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים בסיסיים מתוארות. טכניקה זו היא שיטה מועדפת לחשיפת תכונות והתמחויות של ממברנות ביולוגיות ultrastructural ולקבלת נתונים ממדיים ומרחבי רמת ultrastr...

Video: Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

הכנת עוברים אלקטרונים מיקרוסקופית של תסיסנית לב עוברי צינור

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

מיקרוסקופי של שמרי ביקוע Lifecycle המיני

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

אפיון של אירועים קלציפיקציה שימוש אופטי חיה מיקרוסקופית אלקטרונים טכניקות בתוך ימית תולעת-שפופרת

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

הכנה תצפית של דגימות ביולוגיות העבה ידי סריקת הילוכים אלקטרונים טומוגרפיה

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

הכנת הדוגמא ביולוגית על ידי הקפאת בלחץ גבוה, שיפור ניגודיות בסיוע מיקרוגל, ושרף מינימלי הטמעה של אמצעי הדמיה

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

סריקת בלוק-פנים טורית מיקרוסקופ אלקטרונים (SBF-SEM) של דגימות רקמה ביולוגית

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

הכנת רשת מיקרוסקופית קריו-אלקטרון למחקרים שנפתרו בזמן באמצעות מערכת רובוטית חדשנית, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

אסטרטגיות לאופטימיזציה של רכישת נתונים טומוגרפיה אלקטרוגנית

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.