This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency&#8217;s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.

1 Preparazione di campioni biologici per congelamento-frattura / Fermo-etch <ol><li> Utilizzare un convenzionale EM formulazione fissazione quale il 2% glutaraldeide + 2% paraformaldeide in tampone fosfato 0,1 M per 1 ora. effettuare fissazione primaria di tessuti biologici. NOTA: Mentre può essere opportuno congelare alcuni tipi di campioni senza fissazione preventiva, ematica precauzioni universali patogeni impongono la fissazione del caso in cui il campione è costituito da tessuto umano. </li><li> A seguito di fissazione primaria, sciacquare il campione nello stesso tampone integrato con 0,2 M di saccarosio per non più di 1 ora. </li><li> Trasferire il campione di una soluzione crioprotettore composta per il 25% glicerolo in tampone fosfato 0,1 M per non più di 1 ora. </li></ol> 2 Congelamento e conservazione dei campioni In Anticipo di Freeze-frattura <ol><li> Selezionare campione di oro o di rame mozziconi di forma e dimensione per il campione adeguato in fase di elaborazione (Figura 4 </strong&gt;). </li><li> Utilizzando una pinza grado fini e / o calibro piccolo posizione siringa aghi piccoli frammenti del campione sulla parte superiore di uno stub provino metallico. <ol><li> Ridurre il contenuto liquido del campione ad un appiccicoso, incollare un po &#39;come la coerenza attingendo il liquido dal bordo dello stub con carta da filtro. </li><li> Per le singole repliche, utilizzare piccoli aghi siringa calibro di creare un tumulo di tessuto sulla stub. Per il doppio repliche, invertire un altro stub e posizionarlo esattamente sopra lo stub e posizionare delicatamente sulla superficie del campione creando un sandwich (Figura 5A). Non premere il campione di tra i due stub. </li></ol></li><li> Riempire due vasi Dewar isolati con azoto liquido. NOTA: La prima nave ospita un palo metallico contenente un pozzetto che viene usato per liquefare un piccolo volume di gas propano da un cilindro disponibile in commercio (Figura 5B). Il secondo vaso è uno storage partizionato / contenitore di accumulo per brevely mantenendo campioni congelati in azoto liquido. <ol><li> Usando l&#39;ugello cilindro posizionato nel pozzo propano, aprire la valvola della bombola e lasciare il gas di fluire nel pozzo della nave dove si liquefare. NOTA: ATTENZIONE !! PROPANO è esplosiva, PUO &#39;CAUSARE CONGELAMENTO LESIONI AL CONTATTO, E&#39; UN asfissiante. Utilizzare propano solo in una cappa chimica certificato per tale uso facendo attenzione anche per evitare fonti di ignizione estranee, utilizzando indumenti protettivi contro le basse temperature, e il mantenimento di una ventilazione adeguata. </li><li> Nel più breve tempo possibile, raccogliere il campione di montaggio con una pinza grado fini e immergerlo nel gas liquefatto nel primo vaso per alcuni secondi poi trasferire rapidamente alla seconda nave in possesso di azoto liquido (Figura 5B). </li><li> Una volta che i campioni sono congelati, conservare in azoto liquido fino al momento di trasferire all&#39;impianto di congelamento-frattura. Trasferire il stub di una memoria più grande azoto liquido contenitore Dewar per estesostoccaggio se lo si desidera, tuttavia occorre prestare attenzione a non permettere la stub per scongelare. </li></ol></li></ol> 3 Funzionamento del Gelo-frattura strumenti e campioni di elaborazione <ol><li> Caricamento campioni sul supporto ottone e nella camera <ol><li> Caricare i campioni d&#39;oro stub in un opuscolo di tipo portacampioni doppia replica o morsetto dispositivo in azoto liquido e mantenere lì fino al momento di posizionare nella camera del campione (figura 6). </li><li> Quando la camera ha raggiunto alto vuoto (circa 2 x 10 -6 mbar) e il passaggio è stato raffreddato alla temperatura dell&#39;azoto liquido, spegnere la pompa, sfiatare la camera, e posizionare il provino mozzi montati sul tavolo campione più rapidamente possibile . </li><li> Accendere la pompa, ristabilire alto vuoto, e utilizzare stadio e temperatura braccio controlli elettronici per regolare la temperatura tabella campione a -100 ° C e azoto liquido diretto al braccio microtomo e bring alla temperatura dell&#39;azoto liquido. </li></ol></li><li> Il processo di frattura <ol><li> Al raggiungimento di alto vuoto, una temperatura di -100 ° C palcoscenico e del braccio microtomo alla temperatura dell&#39;azoto liquido, aprire a distanza il titolare doppia replica esemplare fratturazione in tal modo gli esemplari sui monti campione (freeze-fracture_movie1.mov). </li><li> Nel caso di campioni destinati ad incisione seguente frattura, utilizzare una lama di rasoio mantenuto in una morsa sul braccio microtomo radere (cioè, frattura) la superficie dei campioni in luogo di passaggio 3.2.1 (freeze-etch_movie2.mov). </li><li> Se il passo-freeze etching aggiunto deve essere eseguita, posizionare il braccio microtomo raffreddato sulle superfici fratturate per uno a parecchi minuti. NOTA: Questa manovra sublimare (cioè, etch) l&#39;acqua dalla superficie fratturata. L&#39;effetto di tale manovra è quello di rivelare i veri superfici cellulari, matrice extracellulare e / o assemblaggi molecolari per sublimazione di acqua, oltre a fracture facce passando attraverso il doppio strato lipidico delle membrane. </li></ol></li><li> Shadowing in metallo e supporto replica evaporazione con cannoni elettronici <ol><li> Attivare il platino / elettrone carbonio o la resistenza della pistola e farlo evaporare uno strato sottile (circa 2 nm) di platino / carbonio sulla superficie fratturata da un angolo di 30 ° - 45 °. Ciò richiede in genere circa 15-20 sec. </li><li> Attivare l&#39;elettrone carbonio o la resistenza della pistola come al punto 3.3.1 e far evaporare un sottile strato di carbonio alla superficie del campione fratturata direttamente dall&#39;alto (90 °) per dare sostegno alla replica. Ciò richiede in genere circa 15-20 sec. </li></ol></li><li> Recupero di repliche <ol><li> Al termine di shadowing replica e la stabilizzazione di carbonio, spegnere la pompa del vuoto, ventilare la camera, e rimuovere il campione montare dallo strumento. </li><li> Usando un paio di pinze grado fini rimuovere ogni stub oro esemplare dal doppioreplica libretto / morsetto e lasciare scongelare per alcuni secondi prima di abbassare delicatamente lo stub su una superficie di acqua in un posto piatto (Figura 7). NOTA: La replica di carbonio / platino contenente materiale campione aderente galleggia sulla superficie dell&#39;acqua. </li><li> Manovra le repliche utilizzando sia un loop di filo sottile o una griglia microscopio elettronico rame convenzionale tenuto da una pinza qualità fine e il trasferimento ad un altro posto piatto contenente il 5% di bicromato di sodio in 50% di acido solforico per uno per diverse ore. NOTA: Questo bagno digerisce il materiale reale del campione biologico dalla replica. Forza completa candeggina può essere sostituito per l&#39;/ soluzione di bicromato di acido solforico. </li><li> Quando la digestione è completa, trasferire la replica di nuovo ad una superficie d&#39;acqua pulita e recuperare su una griglia di microscopia elettronica standard di rame. (NOTA: repliche può frammentarsi in pezzi più piccoli durante la digestione, ma anche molto piccole repliche può contenere informazioni sostanziali e dovrebbe essere retrieved ed esaminato.) Conservare replica sostenendo griglie in scatole di griglia in commercio dove rimarranno stabili per anni con un trattamento delicato. </li></ol></li></ol> 4 Esame ultrastrutturale di Freeze-frattura / repliche etch <ol><li> Vedi repliche in un microscopio elettronico a trasmissione ad una tensione di accelerazione tipicamente 50-80 kV. </li><li> Registrare le immagini rilevanti su pellicola TEM standard o con una fotocamera digitale ad alta risoluzione. </li></ol>

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The author has nothing to disclose.

Negli anni successivi alla sua introduzione e la disponibilità commerciale, congelamento-frattura / procedure etch sono stati ampiamente utilizzati per le indagini di struttura della membrana biologica. Infatti, le migliori prospettive di alcune delle specializzazioni strutturali delle membrane sono state ottenute in preparati congelamento-frattura / etch. Questi studi non solo hanno contribuito alla comprensione della organizzazione strutturale delle membrane, ma anche fornito intuizioni su come la struttura e la funz...

Il concetto e l&#39;applicazione pratica del trattamento di congelamento-frattura di campioni biologici è stato introdotto da Steere 1 più di mezzo secolo fa. L&#39;apparato presto stanziati componenti disparati in un self-contained unità di lavoro 1. Apparecchiatura originale è stato modificato e raffinato in strumenti disponibili in commercio per ospitare la necessità critica per la manipolazione a distanza, manutenzione di alto vuoto, e l&#39;evaporazione di carbonio e metalli per produrre una replica adatto per l&#39;esame al microscopio elettronico a trasmissione (Figura 1 e Figura 2). Lo strumento tipico è composto da una camera a vuoto elevato con tavolo campione e braccio microtomo avente regolabili throughput azoto liquido (Figura 1). La camera ospita anche due cannoni elettronici, uno per stabilizzare evaporazione carbonio posizionato ad un angolo di 90 ° rispetto alla fase del campione e l&#39;altro per Platinum / carbonio shadowing ad angolo regolabile, tipicamente 15 ° - 45 ° (Figura 2). Alimentazione dell&#39;unità viene applicato per azionare la pompa del vuoto e pannelli elettronici a regolare la regolazione della temperatura e di elettroni controllo delle armi. Originariamente concepito come un mezzo per conseguire una migliore imaging virus, congelamento-frattura guadagnato sempre più popolarità come una tecnica per l&#39;esame e l&#39;analisi delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni 2, 3. Infatti, questa procedura è stata parte integrante chiarire le relazioni struttura / funzione di cellule e tessuti e molti di questi studi si distinguono come i contributi classici di biologia cellulare e molecolare 4-9. L&#39;obiettivo principale e razionale per lo sviluppo della tecnica di congelamento-frattura era di limitare gli artefatti osservabili al microscopio elettronico a risoluzione derivante dalla fissazione chimica e lavorazione utilizzati in microscopia elettronica convenzionale biologica. Qui l&#39;obiettivo è quello di limitare chimicafissazione e di congelare il campione con velocità sufficiente e spesso in presenza di un crioprotettore per limitare la formazione di cristalli di ghiaccio e altri artefatti congelamento. Più di recente, questa tecnica ha trovato una rinascita di interesse da biologi molecolari e gli investigatori scienza dei materiali per l&#39;esame di nanoparticelle e nanomateriali. Immagini Freeze-frattura e congelare-etch presentano un carattere tridimensionale e, a volte sono scambiati per microscopio elettronico a scansione. Tuttavia, i preparativi freeze-fratture sono esaminati mediante microscopia elettronica a trasmissione e il loro importante contributo agli studi morfologici ad alta risoluzione è la loro rappresentazione unica di elementi struttura / funzione delle membrane cellulari. Trasformazione Freeze-frattura è disposta dal congelamento cellule e tessuti con velocità sufficiente a limitare la cristallizzazione del ghiaccio e / o con l&#39;uso di agenti crioprotettori come il glicerolo. I campioni vengono poi fratturate sotto vuoto e un rappresentantelica è generato per evaporazione di carbonio e platino sulla superficie fratturata. Il campione originale viene digerito dalla replica che viene recuperato su una griglia esemplare di serie EM. Un altro errore di interpretazione comune delle immagini freeze-frattura è che essi rappresentano superfici cellulari. Tuttavia la premessa di base di congelamento-frattura è che le membrane biologiche sono divise attraverso il doppio strato lipidico dal processo di frattura (Figura 3). Questo processo in membrane biologiche produce due facce di frattura, uno che rivela l&#39;organizzazione della metà della membrana adiacente al citoplasma, il PF-faccia, e uno che rivela la metà del foglio bimolecolare della membrana che è adiacente alla extracellulare milieu, l&#39;EF-faccia. Superficie delle cellule veri non sono rappresentati nelle immagini freeze-frattura, ma appaiono solo quando si utilizza la successiva fase di aggiunta di freeze-etching seguendo la procedura di frattura. Al fine di incidere efficacemente campioni preventivamente fratturate per rivelare detai di superficiel, i campioni devono essere congelati a un ritmo rapido e senza unetchablecryoprotectant. Incisione di acqua dalla superficie del campione fratturati rivelano caratteristiche sottostanti si ottiene posizionando il braccio microtomo raffreddamento sul tavolino portaoggetti creando un differenziale di temperatura tra la fase che tiene il campione e il braccio microtomo raffreddamento che provoca l&#39;acqua a sublimare dalla superficie. Quando l&#39;acqua viene sublimata dalla superficie del campione fratturati durante la manovra di congelazione incisione, poi aspetti di superfici reali cellulari, matrice extracellulare, strutture del citoscheletro e assiemi molecolari possono essere rivelate ad alta risoluzione. Così freeze-frattura e congelare-etch non sono termini intercambiabili, ma piuttosto riflettono un processo graduale l&#39;ultima delle quali può non essere necessario o desiderabile a seconda delle esigenze del particolare studio. Dopo il congelamento-frattura / freeze-etch procedure, le superfici fratturate sono sottoposti a evaporazione direttitiva mani di carbonio e di platino, al fine di fornire sostegno e di imaging contrasto alla replica. Il / carbonio di imaging evaporazione platino può essere unidirezionale o rotativo, ed è compiuta da una resistenza o cannoni elettronici. Shadowing unidirezionale da un angolo noto, tipicamente 30 ° - 45 °, è utile per eseguire alcuni calcoli morfometrici. I campioni che sono stati sottoposti a profonda incisione in genere sono a rotazione in ombra e le immagini risultanti di questi esemplari sono fotograficamente invertiti per la valutazione. Lo storico così come un attuale obiettivo del / tecnica di congelamento-frattura freeze-etch è quello di limitare la fissazione e la trasformazione chimica dei campioni artefatti che sono associati con più procedure di microscopia elettronica a trasmissione convenzionale. Tuttavia, questa tecnica fornisce un vantaggio sostanziale nella sua capacità di conferire dettaglio tridimensionale e quindi facilitare l&#39;acquisizione dei dati morfometrici in biologico, scienza dei materiali, e nesemplari anotechnology. Procedure di congelamento-frattura e congelare-etch sono complessi e multi-sfaccettato e alcuni aspetti della sua applicazione sono personalizzati. Questa presentazione offre una vista panoramica delle principali caratteristiche del processo e si rimanda il lettore alla completa protocolli pubblicati 10, 11 al fine di affrontare i dettagli e personalizzare il processo per le esigenze di ricerca specifiche.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:71px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant</td>
			<td style="width:71px;">Balzers</td>
			<td style="width:119px;">BAF400T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Standard buffers</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">standard aldehyde fixatives</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sodium dichromate</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">sulfuric acid</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation</td>
			<td style="width:71px;">Technotrade International</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Liquid nitrogen</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Freon</td>
			<td style="width:71px;">various suppliers</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Disposable supplies for electron microscopy</td>
			<td style="width:71px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:71px;">Carl Zeiss Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fundamental technical elements of freeze-fracture/freeze-etch in biological electron microscopy

Freeze-frattura / freeze-etch descrive un processo in cui i campioni, in genere biologici o nanomateriali in natura, sono congelati, fratturato, e replicato per generare un carbonio / platino &quot;cast&quot; destinato ad esame mediante microscopia elettronica a trasmissione. I campioni vengono sottoposti a tassi di congelamento ultrarapido, spesso in presenza di agenti crioprotettivi di limitare la formazione di cristalli di ghiaccio, con conseguente frattura del campione in azoto liquido raffreddato a temperature sotto alto vuoto. La superficie fratturata risultante viene replicato e stabilizzato mediante evaporazione di carbonio e platino da un angolo che conferisce dettaglio superficie tridimensionale al cast. Questa tecnica si è rivelata particolarmente illuminante per lo studio delle membrane cellulari e delle loro specializzazioni ed ha contribuito notevolmente alla comprensione della forma cellulare per la funzione delle cellule correlate. In questo rapporto, passiamo in rassegna i requisiti dello strumento e protocollo tecnico per l&#39;esecuzione dicongelamento-frattura, la nomenclatura e le caratteristiche dei piani di frattura associata, variazioni sul procedimento tradizionale, e criteri per l&#39;interpretazione delle immagini freeze-frattura. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per le indagini ultrastrutturali in molti settori della biologia cellulare e detiene promessa come una tecnica di imaging emergente per molecolare, le nanotecnologie, e studi di scienza dei materiali.

La premessa fondamentale di congelamento-frattura immagine interpretazione è che i piani di frattura passano attraverso il doppio strato lipidico delle membrane che conferiscono due facce di frattura, chiamato per convenzione il PF-faccia (plasma frattura-face) e EF-faccia (extracellulare frattura-face) (Figura 3). Il PF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al citoplasma della cellula e EF-viso è la metà della membrana lipidica a due strati adiacenti al mezzo extracellulare...

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Fundamental Technical Elements of Freeze-fracture/Freeze-etch in Biological Electron Microscopy

Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l&#39;esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l&#39;ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici.

Fondamentale elementi tecnici di Freeze-frattura / Fermo-etch in Biological microscopia elettronica

Freeze-fracture/freeze-etch describes a process whereby specimens, typically biological or nanomaterial in nature, are frozen, fractured, and replicated ...

fundamental-technical-elements-freeze-fracturefreeze-etch-biological

Research

JoVE Journal

Biology

33.0K Views.  The University of North Carolina at Chapel Hill.  Sono descritte le tecniche di base e parametri di lavorazione congelamento-frattura di campioni biologici e dei nanomateriali per l'esame di microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è un metodo preferito per rivelare caratteristiche ultrastrutturali e specializzazioni delle membrane biologiche e per l'ottenimento di dati dimensionali e spaziali di livello ultrastrutturale in scienze dei materiali e dei prodotti nanotecnologici. 

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Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

The morphogenesis of the Drosophila embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell shape changes during embryonic development. One of the challenges faced in studying this structure is that the lumen of the heart tube, as well as the membrane features that are crucial to heart tube formation, are difficult to visualize in whole mount embryos, due to the small size of the heart tube and intra-lumenal space relative to the embryo. The use of transmission electron microscopy allows for higher magnification of these structures and gives the advantage of examining the embryos in cross section, which easily reveals the size and shape of the lumen. In this video, we detail the process for reliable fixation, embedding, and sectioning of late stage Drosophila embryos in order to visualize the heart tube lumen as well as important cellular structures including cell-cell junctions and the basement membrane.

Preparation of embryos for Electron Microscopy of the Drosophila embryonic heart tube

We describe a process for fixation, embedding, sectioning, and imaging of late stage Drosophila embryos for Trasmission Electron Microscopy of the embryonic heart tube. This technique allows for the visualization of the heart tube lumen as well as the basement membrane, which lines the lumen of the heart.

Preparazione di embrioni per la microscopia elettronica del Drosophila Tubo cuore embrionale

The morphogenesis of the Drosophila  embryonic heart tube has emerged as a valuable model system for studying cell migration, cell-cell adhesion and cell ...

Ricerca

Biologia

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

Microscopia time-lapse di Embriogenesi All&#39;inizio del Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Microscopy of Fission Yeast Sexual Lifecycle

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the mechanics of cell division and cell polarity. Furthermore, classical experiments on its sexual reproduction have yielded results pivotal to current understanding of DNA recombination and meiosis. More recent analysis of fission yeast mating has raised interesting questions on extrinsic stimuli response mechanisms, polarized cell growth and cell-cell fusion. To study these topics in detail we have developed a simple protocol for microscopy of the entire sexual lifecycle. The method described here is easily adjusted to study specific mating stages. Briefly, after being grown to exponential phase in a nitrogen-rich medium, cell cultures are shifted to a nitrogen-deprived medium for periods of time suited to the stage of the sexual lifecycle that will be explored. Cells are then mounted on custom, easily built agarose pad chambers for imaging. This approach allows cells to be monitored from the onset of mating to the final formation of spores.

We provide a reproducible basic method for the long-term microscopy of the fission yeast sexual lifecycle. With minor adjustments described, the presented protocol allows research focus on different steps of the reproductive process.

Microscopia di lievito di fissione del ciclo di vita sessuale

The fission yeast Schizosaccharomyces pombe has been an invaluable model system in studying the regulation of the mitotic cell cycle progression, the ...

Characterization of Calcification Events Using Live Optical and Electron Microscopy Techniques in a Marine Tubeworm

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH distribution and calcium ions can be observed using live microscopy over time. This allows identification of the life stage and the tissue with the feature of interest for further electron microscopy studies. Life stage and tissues of interest are typically higher in pH and Ca signals. 
Here, using H. elegans, we present a protocol to characterize the presence of calcium carbonate structures in a biological specimen on the scanning electron microscope (SEM), using energy-dispersive X-ray spectroscopy (EDS) to visualize elemental composition, using electron backscatter diffraction (EBSD) to determine the presence of crystalline structures, and using transmission electron microscopy (TEM) to analyze the composition and structure of the material. In this protocol, a focused ion beam (FIB) is used to isolate samples with dimension suitable for TEM analysis. As FIB is a site specific technique, we demonstrate how information from the previous techniques can be used to identify the region of interest, where Ca signals are highest.

We demonstrate the use of various microscopy methods that are useful in observing the calcification of a tubeworm, Hydroides elegans, as well as locating and characterizing the first calcified material. Live microscopy and electron microscopy are used together to provide functional and material information that are important in studying biomineralization.

Caratterizzazione di calcificazione eventi utilizzando dal vivo ottica ed elettronica Microscopia tecniche in un tubeworm Marine

Characterizing the first event of biological production of calcium carbonate requires a combination of microscopy approaches. First, intracellular pH ...

Preparation and Observation of Thick Biological Samples by Scanning Transmission Electron Tomography

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It also describes an imaging method for studying the 3D structure of thick biological specimens by scanning transmission electron tomography. The sample preparation protocol is based on conventional methods in which the sample is fixed using chemical agents, treated with a heavy atom salt contrasting agent, dehydrated in a series of ethanol baths, and embedded in resin. The specific imaging conditions for observing thick samples by scanning transmission electron microscopy are then described. Sections of the sample are observed using a through-focus method involving the collection of several images at various focal planes. This enables the recovery of in-focus information at various heights throughout the sample. This particular collection pattern is performed at each tilt angle during tomography data collection. A single image is then generated, merging the in-focus information from all the different focal planes. A classic tilt-series dataset is then generated. The advantage of the method is that the tilt-series alignment and reconstruction can be performed using standard tools. The collection of through-focal images allows the reconstruction of a 3D volume that contains all of the structural details of the sample in focus.

This report describes a sample preparation protocol and specific imaging conditions for performing scanning transmission electron tomography of thick biological specimens.

Preparazione e di osservazione di campioni biologici spessi da Scanning Transmission Electron Tomografia

This report describes a protocol for preparing thick biological specimens for further observation using a scanning transmission electron microscope. It ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the imaging modality in a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM), which is used to obtain stacks of sequential images for 3D reconstruction and modelling. High-pressure freezing (HPF) allows close to native structural preservation, but the subsequent freeze substitution often does not provide sufficient contrast, especially for a bigger specimen, which is needed for high-quality imaging in the SEM required for 3D reconstruction. Therefore, in this protocol, after the freeze substitution, additional contrasting steps are carried out at room temperature. Although these steps are performed in a microwave, it is also possible to follow traditional bench processing, which requires longer incubation times.The subsequent embedding in minimal amounts of resin allows for faster and more precise targeting and preparation inside the FIB-SEM. This protocol is especially useful for samples that require preparation by high-pressure freezing for a reliable ultrastructural preservation but do not gain enough contrast during the freeze substitution for volume imaging using FIB-SEM. In combination with the minimal resin embedding, this protocol provides an efficient workflow for the acquisition of high-quality volume data.

Here we present a protocol for combining two sample processing techniques, high-pressure freezing and microwave-assisted sample processing, followed by minimal resin embedding for acquiring data with a focused ion beam scanning electron microscope (FIB-SEM). This is demonstrated using a mouse tibial nerve sample and Caenorhabditis elegans.

Preparazione del campione biologico di congelamento ad alta pressione, aumento di contrasto assistita da microonde e Minimal resina incorporamento per Imaging con volumi

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy (SBF-SEM) of Biological Tissue Samples

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, offering an unprecedented three-dimensional view of tissue microanatomy. While SBF-SEM has seen an exponential increase in use in recent years, technical aspects such as proper tissue preparation and imaging parameters are paramount for the success of this imaging modality. This imaging system benefits from the automated nature of the device, allowing one to leave the microscope unattended during the imaging process, with the automated collection of hundreds of images possible in a single day. However, without appropriate tissue preparation cellular ultrastructure can be altered in such a way that incorrect or misleading conclusions might be drawn. Additionally, images are generated by scanning the block-face of a resin-embedded biological sample and this often presents challenges and considerations that must be addressed. The accumulation of electrons within the block during imaging, known as "tissue charging," can lead to a loss of contrast and an inability to appreciate cellular structure. Moreover, while increasing electron beam intensity/voltage or decreasing beam-scanning speed can increase image resolution, this can also have the unfortunate side effect of damaging the resin block and distorting subsequent images in the imaging series. Here we present a routine protocol for the preparation of biological tissue samples that preserves cellular ultrastructure and diminishes tissue charging. We also provide imaging considerations for the rapid acquisition of high-quality serial-images with minimal damage to the tissue block.

Serial Block-Face Scanning Electron Microscopy SBF-SEM of Biological Tissue Samples

This protocol outlines a routine method for using serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM), a powerful 3D imaging technique. Successful application of SBF-SEM hinges on proper fixation and tissue staining techniques, as well as careful consideration of imaging settings. This protocol contains practical considerations for the entirety of this process.

Microscopia elettronica seriale a scansione a blocchi (SBF-SEM) di campioni di tessuto biologico

Serial block-face scanning electron microscopy (SBF-SEM) allows for the collection of hundreds to thousands of serially-registered ultrastructural images, ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental challenge of great interest to the field of cryo-electron microscopy (cryo-EM). A few methodological strategies have been developed that support these &#34;time-resolved&#34; studies, one of which, Spotiton-a novel robotic system-combines the dispensing of picoliter-sized sample droplets with precise temporal and spatial control. The time-resolved Spotiton workflow offers a uniquely efficient approach to interrogate early structural rearrangements from minimal sample volume. Fired from independently controlled piezoelectric dispensers, two samples land and rapidly mix on a nanowire EM grid as it plunges toward the cryogen. Potentially hundreds of grids can be prepared in rapid succession from only a few microliters of a sample. Here, a detailed step-by-step protocol of the operation of the Spotiton system is presented with a focus on troubleshooting specific problems that arise during grid preparation.

The protocol presented here describes the use of Spotiton, a novel robotic system, to deliver two samples of interest onto a self-wicking, nanowire grid that mix for a minimum of 90 ms prior to vitrification in liquid cryogen.

Preparazione della griglia crio-elettrone microscopica per studi risolti nel tempo utilizzando un nuovo sistema robotico, Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Strategies for Optimization of Cryogenic Electron Tomography Data Acquisition

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current state-of-the-art cryoET combined with subtomogram averaging analysis enables the high-resolution structural determination of macromolecular complexes that are present in multiple copies within tomographic reconstructions. Tomographic experiments usually require a vast amount of tilt series to be acquired by means of high-end transmission electron microscopes with important operational running-costs. Although the throughput and reliability of automated data acquisition routines have constantly improved over the recent years, the process of selecting regions of interest at which a tilt series will be acquired cannot be easily automated and it still relies on the user's manual input. Therefore, the set-up of a large-scale data collection session is a time-consuming procedure that can considerably reduce the remaining microscope time available for tilt series acquisition. Here, the protocol describes the recently developed implementations based on the SerialEM package and the PyEM software that significantly improve the time-efficiency of grid screening and large-scale tilt series data collection. The presented protocol illustrates how to use SerialEM scripting functionalities to fully automate grid mapping, grid square mapping, and tilt series acquisition. Furthermore, the protocol describes how to use PyEM to select additional acquisition targets in off-line mode after automated data collection is initiated. To illustrate this protocol, its application in the context of high-end data collection of Sars-Cov-2 tilt series is described. The presented pipeline is particularly suited to maximizing the time-efficiency of tomography experiments that require a careful selection of acquisition targets and at the same time a large amount of tilt series to be collected.

The increasing demand for large-scale data collection in cryogenic electron tomography requires high-throughput image acquisition routines. Described here is a protocol that implements the recent developments of advanced acquisition strategies aimed at maximizing the time-efficiency and throughput of tomographic data collection.

Strategie per l'ottimizzazione dell'acquisizione dei dati della tomografia elettronica criogenica

Cryogenic electron tomography (cryoET) is a powerful method to study the 3D structure of biological samples in a close-to-native state. Current ...

Rapid Freezing using Sandwich Freezing Device for Good Ultrastructural Preservation of Biological Specimens in Electron Microscopy

Chemical fixation has been used for observing the ultrastructure of cells and tissues. However, this method does not adequately preserve the ultrastructure of cells; artifacts and extraction of cell contents are usually observed. Rapid freezing is a better alternative for the preservation of cell structure. Sandwich freezing of living yeast or bacteria followed by freeze-substitution has been used for observing the exquisite natural ultrastructure of cells. Recently, sandwich freezing of glutaraldehyde-fixed cultured cells or human tissues has also been used to reveal the ultrastructure of cells and tissues. 
These studies have thus far been carried out with a handmade sandwich freezing device, and applications to studies in other laboratories have been limited. A new sandwich freezing device has recently been fabricated and is now commercially available. The present paper shows how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. Also shown is the preparation of specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing and procedures for freeze-substitution, resin embedding, trimming of blocks, cutting of ultrathin sections, recovering of sections, staining, and covering of grids with support films.

Here we show how to use the sandwich freezing device for rapid freezing of biological specimens, including bacteria, yeast, cultured cells, isolated cells, animal and human tissues, and viruses. We also show how to prepare specimens for ultrathin sectioning after rapid freezing.

Congelamento rapido con dispositivo di congelamento a sandwich per una buona conservazione ultrastrutturale di campioni biologici in microscopia elettronica