وأيد هذا العمل من المنح المقدمة من شارع مؤسسة جوزيف (AJF، LJI) وجمعية الرئة الأمريكية، RG-224607-N (LJI).

1. صيانة الخط الخليوي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> BE الإنسان خلد خلل التنسج عالية الجودة (CP-B، CP-C، CP-D) وحؤولي (CP-A) من قبل خطوط الخلايا ترنسفكأيشن مستقرة من تيلوميراز الإنسان الناسخ (TERT) بروتين 11 عكس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ BE خطوط الخلايا القرنية في وسائل الإعلام تستكمل مع استخراج الغدة النخامية البقري (BPE)، عامل نمو البشرة (صندوق تعديل العولمة الأوروبي)، و 5٪ مصل بقري جنيني (FBS)، والأحماض الأمينية غير الأساسية (NEAA)، البنسلين الستربتوميسين، النيوميسين (PSN)، ومعيار شروط زراعة الأنسجة (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 98٪ الرطوبة). </li></ol> 2. BE الخليوي تصفيح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 12 جيدا لوحة / coverslips. وضع 18 ملم coverslips في كوب طبق بتري والأوتوكلاف. نقل تعقيمها 18 coverslips الزجاج ملم إلى 12 طبق جيدا زراعة الأنسجة باستخدام ماصة زجاجية معقمة تعلق على أنبوب فراغ. غسل ساترة مع برنامج تلفزيوني العقيمة وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يعرض للتريبسين عد الخلايا وBE خلد. عد الخلايا باليودنانوغرام عداد الخلايا الآلي أو عدادة الكريات. تمييع الخلايا في وسائل الإعلام والثقافة إلى تركيز 20،000-40،000 خلية / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع 1 مل من الخلايا في كل بئر يحتوي على ساترة لعدد خلايا مجموعه 20،000-40،000 خلايا / جيد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام غيض ماصة معقمة لدفع بلطف ساترة إلى قاع البئر لضمان أن الخلايا نعلق على ساترة. </li></ol> 3. معالجة المخدرات من خلايا BE <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع المخدرات مختارة في الحارة (37 درجة مئوية) وسائل الإعلام إلى التركيز المطلوب وتخلط جيدا بواسطة قلب الأنبوب بشكل متكرر أو باستخدام خلاط دوامة. تركيزات المخدرات تحدد تجريبيا. بدء العلاج 24 ساعة بعد البذر الأولي للخلايا BE للسماح للخلايا المرفقات إلى ساترة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> للمقارنة والسيطرة، وعلاج ساترة إضافية للخلايا يكون مع السيارة 0.1٪ (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [دمس]] أو وكيل تستخدم لذوبان مركب) المخفف في وسائل الإعلام والثقافة. لوحة التسمية مع قلم المختبر لتحديد المخدرات وهاءhicle تعامل العينات. وضع الخلايا في خلية ثقافة حاضنة تعيين إلى 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2، 98٪ الرطوبة واحتضان للحصول على نقاط الوقت المطلوب. </li></ol> 4. مناعي تلطيخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تثبيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد فترة حضانة المطلوب من العلاج من تعاطي المخدرات، ونضح وسائل الإعلام وغسل coverslips بسرعة مع الفوسفات مخزنة المالحة 1X (PBS) في درجة حرارة الغرفة (RT، 25 ° C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح في برنامج تلفزيوني وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني يحتوي على 4٪ PFA [4٪ PFA / PBS] إلى كل بئر واحتضان على RT لمدة 30 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح PFA 4٪ / برنامج تلفزيوني وغسل coverslips 3X، 5 دقائق مع كل برنامج تلفزيوني في RT. متجر coverslips لمدة أسبوع واحد في PBS/0.1٪ PFA في 4 درجات مئوية اذا شئت. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Permeabilization / الحظر Permeabilize الخلايا PFA الثابتة للسماح للالضد للوصول إلى أهداف داخل الخلايا. لخارج الخلية ظهرت البروتينات، تنفيذ جميع الخطوات اللاحقة دون SAPONIN تضاف إلى الحل BSA 1X PBS/0.5٪. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> خفض الخلفية التي يحتضنها مع 50 ملي NH 4 الكلورين المخفف في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة في RT ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني RT لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان BE الخلايا لمدة 30 دقيقة في 100-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.1٪ و 0.5٪ سابونين ألبومين المصل البقري (BSA). تمييع سابونين من المخزون فلتر تعقيم 10٪، أعدت في المياه وتخزينها في 4 درجات مئوية. </li></ol> ملاحظة: هذا يمنع غير محددة ملزمة الأجسام المضادة للبروتينات الخلوية من خلال منع coverslips يرجع ذلك إلى إضافة 0.5٪ BSA. بدلا من ذلك، بديلا BSA مع مصل الماعز المخفف إلى 5٪ للمساعدة في خفض ملزم غير محدد من الأجسام المضادة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد غرفة الإنسان <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد طبق الأحيائي مربع بحلول طبقات الجزء السفلي من الغرفة مع مناشف ورقية مبللة ووضع طبقة من parafilm على القمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل بلطف لل coverslips، والخلايا التي تواجه التصاعدي، على Parafilm باستخدام ملقط وإبرة الحقنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بمناسبة Parafilm بالقلم المختبر لتحديد coverslips. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl">الأجسام المضادة الأولية الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الأجسام المضادة الأولية في برنامج تلفزيوني تحتوي على كل BSA 0.5٪ و 0.1٪ سابونين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وصمة عار بلطف من عرقلة الحل باستخدام الأنسجة المختبرات وإضافة 100 ميكرولتر من الحل الأجسام المضادة الأولية. احتضان الأجسام المضادة الأولية على خلايا BE بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الأجسام المضادة الثانوية الحضانة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل الشرائح 3x أخرى مع PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين لمدة 5 دقائق كل في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع الضد الثانوية مترافق مع علامة فلوري في PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين أن الأجسام المضادة الثانوية يعترف الأنواع التي تم رفع الأجسام المضادة الأولية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 100 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف إلى كل ساترة. احتضان الضد الثانوية لمدة 2 ساعة على RT. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الغسيل وتركيب Coverslips <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل coverslips 3X، 5 دقائق في كل من PBS/0.5٪ BSA/0.1٪ سابونين. إزالة غسل العازلة وإضافة 100-300 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني للل coverslips. ملاحظة: للحصول على ضعف المضادةتلطيخ الجسم، كرر الخطوات من 4،4-4،5 مع الأجسام المضادة الأولية والثانوية إضافية المطلوب وفقا للمعلومات الواردة في المناقشة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملقط، ترفع بلطف صعودا ساترة وصمة عار قبالة PBS باستخدام الأنسجة المختبر أو منشفة ورقية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 15 ميكرولتر من وسائل الاعلام مكافحة تتلاشى تصاعد مناسبة تحتوي على 4 &#39;،6-diamidino-2-phenylindole (دابي) إلى ساترة وعكس ساترة، وخلايا أسفل، على شريحة المجهر والزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع الشرائح في مجلد واحتضان الشريحة بعيدا عن الضوء المباشر بين عشية وضحاها في RT للسماح للتعيين من الصعب مكافحة تتلاشى المتوسطة لعلاج، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. مرة واحدة وقد وضعت وسيلة مكافحة تتلاشى، والشرائح يمكن تخزينها إما في 4 درجة مئوية أو -20 درجة مئوية حتى التصور المجهرية. </li></ol></li></ol> 5. التصور المجهري Coverslips الخلايا الملون يمكن تصويرها إما عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر أو IF microscop تستقيم قادرةه. على الرغم من أن الفحص المجهري متحد البؤر توفر صورا عالية الدقة في أعماق منفصلة، ​​وهي مجهرية تستقيم قادر على انتاج الصور مفيدة بشكل أسرع. للإيجاز، طريقة التصوير الملون BE الخلايا باستخدام المجهر القياسية يرد. بشكل عام، لصورة فلوريسئين ثيوسيانات (FITC) أو fluorophores مماثلة (أي بروتين الفلورية الخضراء)، تكساس الأحمر ودابي، يتطلب المجهر مع مرشحات قادرة على تمييز هذه fluorophores. تحقق المجهر قبل البدء بروتوكول لتحديد fluorophores متوافق. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير على IF مجهر قياسي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة تخزين الشرائح / coverslips من -20 درجة مئوية أو 4 درجات مئوية، والسماح لهم لتسخين إلى درجة حرارة الغرفة. الطاقة على المجهر ومصباح قوس الزئبق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع شريحة المجهر مع ساترة تواجه نحو الهدف على المسرح المجهر. لاستخدام هدفا الغمر النفط، إضافة قطرة من زيت الغمر على ساترة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد مرشح دابي وفتح مصراع. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> التركيز على الهدف في حين يبحث من خلال العدسات حتى تظهر الصورة. لأن جميع الخلايا وصمة عار مع دابي، ينبغي أن يكون نواة يمكن ملاحظتها بسهولة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع الصور باستخدام برامج معالجة الصور منها. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Reid, B. J., Li, X., Galipeau, P. C., Vaughan, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Barrett's+oesophagus+and+oesophageal+adenocarcinoma:+time+for+a+new+synthesis.">Barrett's oesophagus and oesophageal adenocarcinoma: time for a new synthesis.</a> Nat. Rev. Cancer. 10, 87-101 (2010).</li><li>Hayeck, T. J., Kong, C. Y., Spechler, S. J., Gazelle, G. S., Hur, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+Barrett's+esophagus+in+the+US:+estimates+from+a+simulation+model+confirmed+by+SEER+data.">The prevalence of Barrett's esophagus in the US: estimates from a simulation model confirmed by SEER data.</a> Dis. Esophagus. 23, 451-457 (2010).</li><li>Brown, L. M., Devesa, S. S., Chow, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence+of+adenocarcinoma+of+the+esophagus+among+white+Americans+by+sex,+stage,+and+age.">Incidence of adenocarcinoma of the esophagus among white Americans by sex, stage, and age.</a> J. Natl. Cancer Inst. 100, 1184-1187 (2008).</li><li>Konturek, P. C., Burnat, G., Hahn, E. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+Barret's+adenocarcinoma+cell+growth+by+simvastatin:+involvement+of+COX-2+and+apoptosis-related+proteins.">Inhibition of Barret's adenocarcinoma cell growth by simvastatin: involvement of COX-2 and apoptosis-related proteins.</a> J. Physiol. Pharmacol. 58 Suppl 3, 141-148 (2007).</li><li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells.">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li><li>Vona-Davis, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MAPK+and+PI3K+inhibition+reduces+proliferation+of+Barrett's+adenocarcinoma+in+vitro.">MAPK and PI3K inhibition reduces proliferation of Barrett's adenocarcinoma in vitro.</a> Surg. Res. 127, 53-58 (2005).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=a+small+molecule+inhibitor+of+the+Src+kinase,+reduces+the+growth+and+activates+apoptosis+in+pre-neoplastic+Barrett's+esophagus+cell+lines:+evidence+for+a+noninvasive+treatment+of+high-grade+dysplasia.">a small molecule inhibitor of the Src kinase, reduces the growth and activates apoptosis in pre-neoplastic Barrett's esophagus cell lines: evidence for a noninvasive treatment of high-grade dysplasia.</a> Thoracic Cardiovasc. Surg. 145, 531-538 (2013).</li><li>Jovov, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ion+transport+and+barrier+function+in+a+telomerase-immortalized+human+nondysplastic,+Barrett's+cell+line+(BAR-T).">Ion transport and barrier function in a telomerase-immortalized human nondysplastic, Barrett's cell line (BAR-T).</a> Dis. Esophagus. 22, 386-395 (2009).</li><li>Merlo, L. M., Kosoff, R. E., Gardiner, K. L., Maley, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+co-culture+model+of+esophageal+cells+identifies+ascorbic+acid+as+a+modulator+of+cell+competition.">An in vitro co-culture model of esophageal cells identifies ascorbic acid as a modulator of cell competition.</a> BMC Cancer. 11, 461 (2011).</li><li>Zhang, H. Y., Hormi-Carver, K., Zhang, X., Spechler, S. J., Souza, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+benign+Barrett's+epithelial+cells,+acid+exposure+generates+reactive+oxygen+species+that+cause+DNA+double-strand+breaks.">In benign Barrett's epithelial cells, acid exposure generates reactive oxygen species that cause DNA double-strand breaks.</a> Cancer Res. 69, 9083-9089 (2009).</li><li>Palanca-Wessels, M. C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+lifespan+of+Barrett's+esophagus+epithelium+transduced+with+the+human+telomerase+catalytic+subunit:+a+useful+in+vitro+model.">Extended lifespan of Barrett's esophagus epithelium transduced with the human telomerase catalytic subunit: a useful in vitro model.</a> Carcinogenesis. 24, 1183-1190 (2003).</li><li>Kumble, S., Omary, M. B., Cartwright, C. A., Triadafilopoulos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+activation+in+malignant+and+premalignant+epithelia+of+Barrett's+esophagus.">Src activation in malignant and premalignant epithelia of Barrett's esophagus.</a> Gastroenterology. 112, 348-356 (1997).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=alpha-Catenin+overrides+Src-dependent+activation+of+beta-catenin+oncogenic+signaling.">alpha-Catenin overrides Src-dependent activation of beta-catenin oncogenic signaling.</a> Mol. Cancer Ther. 7, 1386-1397 (2008).</li><li>Coluccia, A. M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SKI-606+Decreases+Growth+and+Motility+of+Colorectal+Cancer+Cells+by+Preventing+pp60(c-Src)-Dependent+Tyrosine+Phosphorylation+of+&#946;-Catenin+and+Its+Nuclear+Signaling.">SKI-606 Decreases Growth and Motility of Colorectal Cancer Cells by Preventing pp60(c-Src)-Dependent Tyrosine Phosphorylation of &#946;-Catenin and Its Nuclear Signaling.</a> Cancer Res. 66, 2279-2286 (2006).</li><li>Nam, J. -. S., Ino, Y., Sakamoto, M., Hirohashi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src+Family+Kinase+Inhibitor+PP2+Restores+the+E-Cadherin/Catenin+Cell+Adhesion+System+in+Human+Cancer+Cells+and+Reduces+Cancer+Metastasis.">Src Family Kinase Inhibitor PP2 Restores the E-Cadherin/Catenin Cell Adhesion System in Human Cancer Cells and Reduces Cancer Metastasis.</a> Clin. Cancer Res. 8, 2430-2436 (2002).</li><li>Chu, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p27+phosphorylation+by+Src+regulates+inhibition+of+cyclin+E-Cdk2.">p27 phosphorylation by Src regulates inhibition of cyclin E-Cdk2.</a> Cell. 128, 281-294 (2007).</li><li>Inge, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Soluble+E-cadherin+promotes+cell+survival+by+activating+epidermal+growth+factor+receptor.">Soluble E-cadherin promotes cell survival by activating epidermal growth factor receptor.</a> Exp. Res. 317, 838-848 (2011).</li><li>Gan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+roles+of+ERK+and+Akt+pathways+in+regulation+of+EGFR-mediated+signaling+and+motility+in+prostate+cancer+cells.">Differential roles of ERK and Akt pathways in regulation of EGFR-mediated signaling and motility in prostate cancer cells.</a> Oncogene. 29, 4947-4958 (2010).</li></ol>

يعلن الكتاب أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

وقد أوجزنا طريقة لتطبيق IF الخلايا BE نحو توضيح الآثار الفسيولوجية للالعلاجات المستهدفة على هذه الخلايا. في حين وصفناها استخدام هذه الإجراءات نحو الخلايا BE، وجدنا أن هذه الأساليب تنطبق أيضا على مجموعة متنوعة من أنواع مختلفة من الخلايا 13،17،18. علاوة على ذلك، يمكن ...

<html> المريء باريت (BE) هو تغيير حؤولي في ظهارة الحرشفية العادي من المريء ونتيجة التعرض المزمن لمحتويات المعدة الناتجة عن مرض الجزر المعدي المريئي (GERD) 1. BE ويعتقد أن تكون آلية وقائية في التصدي لارتجاع المريء، ولكن وجود BE يضفي على زيادة خطر غدية المريء (EAC)، وهو المرض الذي يحمل الفقراء بشكل كبير البقاء على قيد الحياة 1. وتشير التقديرات الحالية إلى أن ما يصل إلى 5.6٪ من سكان أمريكا قد تكون، ولكن كما هو في كثير من الأحيان أعراض BE، ويعتقد أن غالبية BE لا تزال غير مشخصة 2. كما شهدت معدلات وقوع كل من ارتجاع المريء وEAC استمرار النمو 3، فقد أصبح من المهم لفهم الآليات الجزيئية المشاركة في تطور BE لEAC، وخصوصا هذه المعلومات يمكن أن يوفر النهج العلاجية من أجل منع تطور BE لEAC. وقد أسفرت نتائج الدراسات&gt; المريض الموجهة في النموذج الحالي من BE-EAC المرضية 1. الالتهابات المزمنة، والإصابات، والأضرار السمية الناتجة عن التعرض لفترات طويلة لمحتويات المعدة ممارسة ضغوط انتقائية على BE الآفة تعزيز تطور الأورام لمجموعة شرق افريقيا. وقد تم تحديد عدد من التعديلات الوراثية خلال BE لتطور EAC. ومع ذلك، على الرغم من هذا هناك نقص واضح في الفهم عن التغييرات الدقيقة في إشارة الخلية والآثار اللاحقة على بنية الخلية ووظيفتها. خلدت في خطوط الخلايا في المختبر هي أدوات مفيدة لدراسة آثار إشارة الخلية، ولا سيما في التحقيق في الآثار المترتبة على المركبات العلاجية المستهدفة. توافر التجارية مؤخرا مخلد BE خطوط الخلايا يسمح لمثل هذه الدراسات. على الرغم من أن فحوصات عالية الإنتاجية، مثل فحوصات الجدوى المستعملة على نطاق واسع، ويمكن أن تكون ذات قيمة في تقييم آثار العلاجات المستهدفة على تكاثر الخلايا وسوrvival 4-6، وهذه المقايسات ليست مفيدة لاستجواب آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. تلطيخ مناعي (IF) هو تقنية مفيدة للتحقيق في آثار العلاجات المستهدفة على الخصائص المورفولوجية، والنمو، والبقاء على قيد الحياة من الخلايا والبروتينات التي ينطوي عليها. مختبرنا تكيفت هذه الطرق نحو خطوط BE خلية خلد، وذلك باستخدام IF لتقييم آثار المخدرات المتوفرة سريريا على خطوط الخلايا BE أملا في ترسيم ممكن علاج chemopreventative والعلامات البيولوجية لعلاج المخدرات 7. وبالمثل، وتطبيق هذه التقنيات في مجموعة شرق افريقيا، وتكون خطوط الخلايا خلد المريء وقد حددت نتائج حاسمة بشأن BE لEAC تطور 8-10. نجد IF تحليل الخلايا BE تعامل مع العلاجات المستهدفة لها قيمة، مما يسمح لتوصيف التغيرات في بنية الخلية والترجمة البروتين. هنا، نقدم طرقنا لIF من الخلايا BE مخلد إلى جharacterize العلاج من تعاطي المخدرات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="743">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:295px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:116px;">Company</td>
			<td style="width:108px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/ Description (optional)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-A (Metaplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-B (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-C (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CP-D (High-grade Dysplastic Cell Line)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CRL-4030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Keratinocyte-SFM (1X), Liquid</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17005-042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fetal Bovine Serum, Qualified, HI</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10438026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PSN ANTIBIOTIC MIXTURE</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15640</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PBS - Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pro-long Gold Antifade Reagent with DAPI&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P36931</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Circular Glass Coverslip 18mm</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>15-183-86</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#946;-catenin Primary Antibody (Rabbit)</td>
			<td>Cell Signaling</td>
			<td>9562S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alexafluor 488 (Goat Anti-Rabbit)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">10cm TC treated PS dish, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>CC7682-3394</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">12-well TC treated PS plate, sterile</td>
			<td>USA Scientific</td>
			<td>5666-5180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DMSO</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>276855</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ammonium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Saponin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>47036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bovine Serum Albumin - Fraction V</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>85040C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SKI-606 (Bosutinib)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Square Bioassay Dish&#160;</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>240835</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Parafilm&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>82024-546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Disposable Pasteur Pipets, Flint Glass</td>
			<td>VWR</td>
			<td>14672-380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nexcelom Mini Cell Counter</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cellometer Counting Chambers</td>
			<td>Nexcelom</td>
			<td>CHT4-SD100-014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss Apotome microscope&#160;</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an immunofluorescent method for characterization of barrett&#8217;s esophagus cells

غدية المريء (EAC) لديه معدل البقاء على قيد الحياة عموما أقل من 17٪ وارتفع معدل الإصابة EAC بشكل كبير خلال العقدين الماضيين. واحد من عوامل الخطر الرئيسية للEAC هو المريء باريت (BE)، وهو تغيير حؤولي من المريء الحرشفية العادي ردا على حرقة مزمنة. على الرغم من اتصال راسخة بين EAC وأن تكون والاستجواب من الأحداث الجزيئية، وخاصة مسارات الإشارات التي تنطوي على تغير تطور هو EAC، ولا يزال الغموض يكتنف. الكثير من هذا يعود لعدم وجود مناسبة في نماذج المختبر متاح لدراسة هذه الأمراض. في الآونة الأخيرة، أصبحت خطوط BE خلية خلد المتاحة تجاريا يسمح لفي المختبر دراسات BE. هنا، نقدم طريقة لتلوين مناعي من خطوط الخلايا خلد BE، مما يسمح في توصيف المختبر من إشارات الخلية والهيكل بعد التعرض للمركبات العلاجية. وتطبيق هذه التقنيات هيلع تطوير التبصر في الآليات التي تشارك في BE لEAC التقدم وتوفير السبل المحتملة للعلاج والوقاية من EAC.

ويتضح مثال للنتائج التي تم الحصول عليها من تطبيق الإجراءات الموضحة في أرقام 1A-D. وعولج Coverslips مع CP-D وCP-C BE الخلايا لمدة 24 ساعة مع 1 ميكرومتر من SRC المانع الأسرة، SKI-606، أو مركبة (DMSO) والملون باستخدام الإجراءات المذكورة أعلاه لالملتصقة مفرق وإشارات Wnt البروتين، β -ca...

Watch this Scientific Journal Video about An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrettâ€™s Esophagus Cells at JoVE.com

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&amp;#8217;s Esophagus Cells

هناك حاجة ملحوظة لتحسين المعلومات عن السائقين الجزيئية من المريء باريت. تلوين مناعي هو تقنية مفيدة لفهم آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخدام مناعي تلطيخ لتقييم العلاجية في خلايا المريء باريت.

على الطريقة مناعي لتوصيف خلايا المريء باريت

Esophageal adenocarcinoma (EAC) has an overall survival rate of less than 17% and incidence of EAC has risen dramatically over the past two decades. One ...

an-immunofluorescent-method-for-characterization-barretts-esophagus

Research

JoVE Journal

Biology

An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

14.0K Views.  St. Joseph's Hospital and Medical Center.  هناك حاجة ملحوظة لتحسين المعلومات عن السائقين الجزيئية من المريء باريت. تلوين مناعي هو تقنية مفيدة لفهم آثار إشارة الخلية على مورفولوجيا الخلايا. نقدم بروتوكول بسيطة وفعالة لاستخدام مناعي تلطيخ لتقييم العلاجية في خلايا المريء باريت. 

Video: An Immunofluorescent Method for Characterization of Barrett&#8217;s Esophagus Cells

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated heavy chains that are noncovalently associated with beta2-microglobulin. They bind lipids rather than peptides. Although their structure confirms the similarity of CD1 proteins to MHC class I and class II antigen presenting molecules, the mCD1d groove is relatively narrow, deep, and highly hydrophobic and it has two binding pockets instead of the several shallow pockets described for the classical MHC-encoded antigen-presenting molecules. Based upon their amino acid sequences, such a hydrobphobic groove provides an ideal environment for the binding of lipid antigens. The Natural Killer T (NKT) cells use their TCR to recognize glycolipids bound to or presented by CD1d. T cells reactive to lipids presented by CD1 have been involved in the protection against autoimmune and infectious diseases and in tumor rejection. Thus, the ability to identify, purify , and track the response of CD1-reactive NKT cell is of great importance . The generation of tetramers of alpha Galactosyl ceramide (a-Galcer) with CD1d has significant insight into the biology of NKT cells. Tetramers constructed from other CD1 molecules have also been generated and these new reagents have greatly expanded the knowledge of the functions of lipid-reactive T cells, with potential use in monitoring the response to lipid-based vaccines and in the diagnosis of autoimmune diseases and other treatments.

A Method to prepare Insect cells and infect them with baculovirus for the the purpose of production of recombinant mCD1d proteinand generating mCD1d tetramers.

وهناك طريقة للحصول على إنتاج بروتين المؤتلف mCD1d في خلايا الحشرات.

CD1 proteins constitute a third class of antigen-presenting molecules. They are cell surface glycoproteins, expressed as approximately 50-kDa glycosylated ...

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require direct access to cells and isolation of specific cell types, could not be applied in C. elegans. This limitation was due to the fact that tissues are confined within a pressurized cuticle which is not easily digested by treatment with enzymes and/or detergents. Based on early pioneer work by Laird Bloom, Christensen and colleagues 1 developed a robust method for culturing C. elegans embryonic cells in large scale. Eggs are isolated from gravid adults by treatment with bleach/NaOH and subsequently treated with chitinase to remove the eggshells. Embryonic cells are then dissociated by manual pipetting and plated onto substrate-covered glass in serum-enriched media. Within 24 hr of isolation cells begin to differentiate by changing morphology and by expressing cell specific markers. C. elegans cells cultured using this method survive for up 2 weeks in vitro and have been used for electrophysiological, immunochemical, and imaging analyses as well as they have been sorted and used for microarray profiling.

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

We describe here a revised protocol for large-scale culture of embryonic C. elegans cells. Embryonic C. elegans cells cultured in vitro using this method, appear to differentiate and recapitulate the expression of genes in a cell specific manner. Techniques that require direct access to the cells or isolation of specific cell types from the other tissues can be applied on C. elegans cultured cells.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

طريقة مبتكرة لExosome الكمي وقياس الحجم

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Isolation of Myofibroblasts from Mouse and Human Esophagus

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for 25 min. Human esophageal resection specimens are stripped of muscularis propria and adventitia and the remaining mucosa is minced, and subjected to enzymatic digestion with collagenase and dispase for up to 6 hr. Cultured cells express &#945;-SMA and vimentin and express desmin weakly or not at all. Culture conditions are not conducive to growth of epithelial, hematopoietic, or endothelial cells. Culture purity is further confirmed by flow cytometric evaluation of cell surface marker expression of potential contaminating hematopoietic and endothelial cells. The described technique is straightforward and results in consistent generation of non-hematopoieitc, non-endothelial stromal cells. Limitations of this technique are inherent to the use of primary cultures in molecular biology studies, i.e., the unavoidable variability encountered among cultures established across different mice or humans. Primary cultures however are a more representative reflection of the in vivo state compared to cell lines. These methods also provide investigators the ability to isolate and culture stromal cells from different clinical and experimental conditions, allowing comparisons between groups. Characterized esophageal stromal cells can also be used in functional studies investigating epithelial-stromal interactions in esophageal disorders.

We present a protocol to generate primary cultures of murine and human esophageal stromal cells with a myofibroblast phenotype. Cultured cells have spindle shaped morphology, express &#945;-SMA and vimentin, and lack epithelial, hematopoietic and endothelial cell surface markers. Characterized stromal cells can be used in functional studies of epithelial-stromal interactions.

عزل Myofibroblasts من الفأر والمرئ الإنسان

Murine and human esophageal myofibroblasts are generated via enzymatic digestion. Neonate (8-12 day old) murine esophagus is harvested, minced, washed, ...

Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current literature describes several different methodological approaches to obtain images of intestinal tissues for data validation. In this paper, we delineate a common protocol relating to the derivation and processing of mouse intestinal tissues. Proper fixation of intestinal tissues and Swiss-roll techniques that enhance intestinal epithelial morphology are discussed. Postresection processing and reorientation of embedded intestinal tissues are critical in obtaining paraffin-embedded blocks that display intact intestinal structural features after sectioning. The Swiss-rolling technique helps in histological assessment of the complete intestinal or colonic sections examined. An ability to differentiate intestinal structural features can be vital in quantitative measurements of intestinal inflammation and tumorigenesis along the entire length. Finally, paraffin-embedded sections are ideal for robust processing using both immunohistochemical and immunofluorescent detection methods. Nonfluorescent immunohistochemical sections provide a vibrant image of the tissue detailing different cellular structural features but do not provide flexibility for intracellular co-localization experiments. Multiple fluorescent channels can be appropriately utilized with immunofluorescent detection for co-localization experiments, lending support to mechanistic studies.

Accurate identification and location of epithelial cells along the intestinal mucosal lining are essential to define different cell lineages. Proper imaging of intestinal tissues is crucial for identification of protein expression patterns with maximum resolution. This study aims to delineate the optimal methods and conditions for processing mouse intestinal tissues.

تحسين تقنيات السويسري المتداول لإعداد المعوية الأنسجة لالمناعى وتحليلات مناعي

Understanding the role of factors that regulate intestinal epithelial homeostasis and response to injury and regeneration is important. The current ...

An Easy Method for Plant Polysome Profiling

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the analysis of translational regulation. The method described here is an easy and economical way for fractionating polysomes from various plant tissues. A sucrose gradient is made without the need for a gradient maker by sequentially freezing each layer. Cytosolic extracts are then prepared in a buffer containing cycloheximide and chloramphenicol to immobilize the cytosolic and chloroplastic ribosomes to mRNA and are loaded onto the sucrose gradient. After centrifugation, six fractions are directly collected from the bottom to the top of the gradient, without piercing the ultracentrifugation tube. During collection, the absorbance at 260 nm is read continuously to generate a polysome profile that gives a snapshot of global translational activity. Fractions are then pooled to prepare three different mRNA populations: the polysomes, mRNAs bound to several ribosomes; the monosomes, mRNAs bound to one ribosome; and mRNAs that are not bound to ribosomes. mRNAs are then extracted. This protocol has been validated for different plants and tissues including Arabidopsis thaliana seedlings and adult plants, Nicotiana benthamiana, Solanum lycopersicum, and Oryza sativa leaves.

This protocol describes an easy method to extract and fractionate transcripts from plant tissues on the basis of the number of bound ribosomes. It allows a global estimate of translation activity and the determination of the translational status of specific mRNAs.

طريقة سهلة لمحطة Polysome التنميط

Translation of mRNA to protein is a fundamental and highly regulated biological process. Polysome profiling is considered as a gold standard for the ...

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid decline in renal function and development of the clinical syndrome known as acute kidney injury (AKI). Pharmacological agents used to treat medical circumstances ranging from bacterial infection to cancer, when administered individually or in combination with other drugs, can initiate AKI. Zebrafish are a useful animal model to study the chemical effects on renal function in vivo, as they form an embryonic kidney comprised of nephron functional units that are conserved with higher vertebrates, including humans. Further, zebrafish can be utilized to perform genetic and chemical screens, which provide opportunities to elucidate the cellular and molecular facets of AKI and develop therapeutic strategies such as the identification of nephroprotective molecules. Here, we demonstrate how microinjection into the zebrafish embryo can be utilized as a paradigm for nephrotoxin studies.

Renal injuries incurred from nephrotoxins, which include drugs ranging from antibiotics to chemotherapeutics, can result in complex disorders whose pathogenesis remains incompletely understood. This protocol demonstrates how zebrafish can be used for disease modeling of these conditions, which can be applied to the identification of renoprotective measures.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex signaling mechanisms underlying filopodial initiation, elongation and subsequent stabilization or retraction, it is crucial to determine the spatio-temporal protein activity in these dynamic structures. To analyze protein function in filopodia, we recently developed a semi-automated tracking algorithm that adapts to filopodial shape-changes, thus allowing parallel analysis of protrusion dynamics and relative protein concentration along the whole filopodial length. Here, we present a detailed step-by-step protocol for optimized cell handling, image acquisition and software analysis. We further provide instructions for the use of optional features during image analysis and data representation, as well as troubleshooting guidelines for all critical steps along the way. Finally, we also include a comparison of the described image analysis software with other programs available for filopodia quantification. Together, the presented protocol provides a framework for accurate analysis of protein dynamics in filopodial protrusions using image analysis software.

We present a software solution for semi-automated tracking of relative protein concentration along the length of dynamic cellular protrusions.

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal muscle development and regeneration, and the autophagic process has been described in several muscular pathologies and age-related muscle disorders. A recently described block of the autophagic process that correlates with the functional exhaustion of satellite cells during muscle repair supports the notion that active autophagy is coupled with productive muscle regeneration. These data uncover the crucial role of autophagy in satellite cell activation during muscle regeneration in both normal and pathological conditions, such as muscular dystrophies. Here, we provide a protocol to monitor the autophagic process in the adult Muscle Stem Cell (MuSC) compartment during muscle regenerative conditions. This protocol describes the setup methodology to perform in situ immunofluorescence imaging of LC3, an autophagy marker, and MyoD, a myogenic lineage marker, in muscle tissue sections from control and injured mice. The methodology reported allows for monitoring the autophagic process in one specific cell compartment, the MuSC compartment, which plays a central role in orchestrating muscle regeneration.

In Situ Immunofluorescent Staining of Autophagy in Muscle Stem Cells

Active autophagy is associated with productive muscle regeneration, which is essential for Muscle Stem Cell (MuSC) activation. Here, we provide a protocol for the in situ detection of LC3, an autophagy marker in MyoD-positive MuSCs of muscle tissue sections from control and injured mice.

في الموقع تلطيخ إمونوفلورزنت من البلعمة الذاتية في الخلايا الجذعية العضلات

Increasing evidence points to autophagy as a crucial regulatory process to preserve tissue homeostasis. It is known that autophagy is involved in skeletal ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.