وأيد هذا العمل في جزء من المنحة DP2OD008470 المعاهد الوطنية للصحة. بالإضافة إلى ذلك، كان مدعوما من ذاكرة الوصول العشوائي في جزء من الأموال المقدمة من جامعة نوتردام مدرسة نوتردام العليا. نشكر الموظفين من قسم العلوم البيولوجية، ومركز للبحوث اسماك الزرد، ومركز للخلايا الجذعية والطب التجديدي في جامعة نوتردام. نخص بالشكر أعضاء مختبر لإشراك مناقشات حول علم الأحياء الكلى وتغذية راجعة مفيدة على هذا العمل.

وتمت الموافقة على إجراءات للعمل مع الأجنة الزرد الموصوفة في هذا البروتوكول من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في جامعة نوتردام. 1. إعداد حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل 50X الأسهم وسائل الإعلام الجنين E3 عن طريق خلط 73.0 غرام كلوريد الصوديوم، 3.15 ز بوكل، 9.15 غ CaCl 2، و9.95 ز MgSO 4 في 5 لتر من الماء المقطر، وتخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لزراعة الأجنة الزرد، وتمييع الحل 50X الأسهم من الأسهم وسائل الاعلام الجنين E3 إلى حل العمل 1X بالماء المقطر، ثم يضاف 200 ميكرولتر من 0.05٪ الميثيلين الأزرق إلى كل 1 لتر من 1X E3 ليكون بمثابة فطريات، وتخزينها في RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل حل تصبغ منع وسائل الإعلام الجنين E3 مع 0.003٪ 1-فينيل-2-ثيوريا (PTU) عن طريق الجمع بين 40 مل من الأسهم 50X E3 مع PTU 0.06 ملغ. ثم جعل حجم ما مجموعه 2 L مع الماء المقطر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحريك E3 / PTU O / N في RT للحصول على مسحوق PTU إلى حل. ثم تخزين E3 / PTU فيRT. ملاحظة: E3 / PTU لديه الصلاحية لمدة أسبوع تقريبا، وسوف الحلول القديمة تكون أقل فعالية في منع تطوير تصبغ في يرقات الزرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقديم حل مخدر من 0.2٪ تريكين (MS-222) وذلك بإضافة 1 غرام من تريكين إلى 500 مل من الماء المقطر، وضبط درجة الحموضة إلى 7.2 مع 1 M تريس، ودرجة الحموضة 9.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الاستعداد لتقديم حل ميثيل 2٪ للتصوير عن طريق وضع حل 1X E3 (لا الميثيلين الأزرق)، مع حجم ال 10/01 من 0.2٪ وأضاف تريكين في 4 درجات مئوية. ملاحظة: الحل ميثيل هو الحل سميكة، والواضح أن تستخدم لتحقيق الاستقرار بلطف الأجنة الحية للفحص المجهري. بعد يتم تنفيذ التلاعب الأجنة يمكن غسلها في 1X E3 بحل ميثيل دون إصابة الحيوان وتمكين المجهري في مراحل لاحقة في نفس العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تبرد إلى 4 درجات مئوية، وإثارة الحل 1X E3 / تريكين بقوة على طبق من ضجة وإضافة تدريجيا كمية مناسبة من الميثيلمسحوق السليلوز في حين تواصل اثارة بقوة. تدريجيا إضافة مسحوق إلى حل لمنع تشكيل المجاميع ميتيل غير قابلة للذوبان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد يتم خلط كل مسحوق في 2٪ محلول ميتيل / E3 / تريكين، وإثارة الحل المركب في 4 درجات مئوية الغرفة الباردة O / N. ملاحظة: درجات الحرارة الباردة هو أفضل لإذابة تماما مسحوق. إذا كان هذا الحل ليس واضحا بعد ليلة واحدة، وإثارة لساعات العمل الإضافي و / أو O الثاني / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة فقاعات الهواء من 2٪ ميتيل / E3 حل / تريكين، قسامة الخليط في أنابيب 1.5 مل وتدور بسرعة عالية (12،000 x ج) في 4 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو لتصل إلى 2 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع 2٪ ميثيل حل / E3 / تريكين في 4 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل. ملاحظة: قبل الاستخدام وقسامات يجب أن يكون قبل تحسنت إلى RT للعمل مع العينات الزرد. </li></ol> 2. إعداد أدوات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد أداة الجنين مناور، وتستخدم لحماماتsitioning الأجنة ل microinjection، عن طريق ربط طرف جل التحميل على نهاية 5 &quot;إبرة تشريح التوالي، وآمنة مع الشريط أو superglue. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد microinjection الإبر باستخدام مجتذب إبرة، عن طريق وضع أول حريق مصقول 10 سم زجاج البورسليكات مع خيوط في الصك وتأمين الزجاج البورسليكات من خلال تشديد المقابض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب الزجاج البورسليكات لأزياء الإبر غرامة مدبب. استخدام الإعدادات التالية: حرارة 540، وسحب 245، سرعة 200، والوقت 125. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الإبر داخل طبق بتري، تعليقها على شريط من الصلصال لحماية نصائح إبرة، والحفاظ على طبق مغطى لمنع تراكم الغبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإنهاء إعداد إبرة للإبر دقيقة جدا، واستخدام شفرة حلاقة أو ملقط غرامة حافة لقطع في نهاية سحبت من الإبرة إلى إنشاء حاد حقن طرف الزاوي التي يبلغ قطرها حوالي 0،05 حتي 0،1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لجعل علبة حقن مكروي، إعداد محلول 1.5٪ الاغاروز / E3 في 100 مل دورق مخروطي سعة وحل الاغاروز عن طريق تسخين E3 ليغلي في الميكروويف ثم يترك ليبرد على RT لمدة حوالي 10 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل حل الاغاروز / E3 تبرد في طبق بيتري لجعل الأساس وعلى عمق حوالي 0.5 سم. عندما عزز هذا صب طبقة ثانية على عمق حوالي 0.3 سم وإدراج الجاهزة الجنين جيدا العفن، والسماح للالاغاروز ليصلب في RT. ملاحظة: عند إدخال القالب في أعلى أجار / E3 طبقة، ووضع القالب في أجار في زاوية لخفض عدد من فقاعات الهواء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعندما وضعت علبة حقن مكروي كامل، ورفع الجنين الجاهزة العفن جيدا ببطء وبعناية باستخدام سكوبولا، ثم ملء الطبق مع حل E3 وتخزين عند 4 درجات مئوية. </li></ol> 3. الأجنة إعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انشاء خزانات التزاوج الزرد عن طريق وضع فواصل إلى غرف التزاوج وملء مع الماء النظام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع السمك واحدة على كل جانب من المفرق الصورةاوك أن كل غرفة تحتوي على التزاوج امرأة واحدة والأسماك واحد من الذكور، وتشمل كل غرفة التزاوج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في صباح اليوم التالي، وإزالة فواصل لتمكين وضع البيض. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق السمك بعد ما يقرب من 30 دقيقة، وبعد عودته من البالغين إلى الحوض، وجمع الأجنة عن طريق تمرير الماء من خزان التزاوج من خلال أداة مصفاة سلك شبكة غرامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عكس مصفاة على طبق بيتري وشطف مع E3 لجمع الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأجنة في 28.5 درجة CO / N. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما وصلت إلى الأجنة في مرحلة 24-26 الجسيدة 26، صب معظم وسائل الإعلام E3 ثم dechorionate بإضافة 100 ميكرولتر من 50 ملغ / مل pronase إلى كل طبق من الأجنة واحتضان طبق في RT (23 درجة مئوية) لمدة ما يقرب من 15 دقيقة. ملاحظة: وسوف يستغرق حوالي 24-25 ساعة من وقت حدوث الإخصاب لأجنة للوصول إلى مرحلة 24-26 الجسيدة إن جمعت بطريقة وصفت وحضنت O / N عند 28.5 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء الطبق معE3 ثم دوامة بلطف لإزاحة chorions من الأجنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب E3 / pronase وشطف الطبق مع 25 مل من E3 جديدة. كرر الخطوة شطف لإزالة جميع pronase. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لمنع تطور تصبغ، صب E3 واستبدالها مع 25 مل من جديد E3 / PTU عندما وصلت الأجنة 24 ساعة بعد الإخصاب. ملاحظة: للحصول على التجارب التي تغطي عدة أيام، يستعاض عن حل E3 / PTU مع وسائل الإعلام الجديدة مرة واحدة يوميا للحفاظ على طبق نظيف. </li></ol> 4. Microinjection من سم كلوي الحل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في يوم من الحقن، وإعداد حل سم كلوي المطلوب إلى جانب السيطرة على السيارة المناسبة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دوامة أو المزيج بلطف لضمان المخدرات (ق) هو / هي في حل، والتحقق من جانبي الأنبوب وأعلى من عمود الماء. ملاحظة: الحلول سم كلوي يمكن أن تكون على استعداد لتحتوي على كميات ضئيلة من ديكستران مترافق fluorescently لمراقبة كفاءة حقن مكروي وأيضا تقييم التصفية الكلوية في subseqالوقت uent يشير 20،28. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل إبرة حقن مكروي قلص مع ~ 2-3 ميكرولتر من سم كلوي بواسطة خيوط غرامة طرف جل التحميل في الجزء الخلفي من الإبرة وتعليق الإبرة عموديا مع قطعة من الشريط للسماح للحل لملء طرف الإبرة قلص عن طريق الجاذبية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مرة واحدة في رأس الإبرة هو الكامل، وتأمين إبرة تحميلها في micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختبار حجم حقن مكروي عن طريق وضع قطرة من الزيت المعدني على شريحة ميكرون وحقن في الزيت لتقييم حجم القطيرات. وحجم الحقن من 500 رر التي يبلغ قطرها 0.1 ملم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة طبق من الأجنة من الحاضنة، وتخدير عن طريق إضافة حوالي 5 مل من 0.2٪ تريكين إلى الطبق الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لضمان التخدير الكامل، المس بلطف الجنين مع غيض من أداة الجنين مناور. قلة الحركة يشير تخدير كاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التخدير الناجح، ونقل الأجنة إلى حقن القالب مع transfإيه ماصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مناورة كل جنين في بئر مختلفة من العفن وضع الرأس في أعمق منطقة مثل جيدا أن جذع تقع على طول الاكتئاب والذيل العصي حتى من الاكتئاب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ادخال الإبرة شغل في micromanipulator وموقف طرف الإبرة بجانب الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج بلطف إبرة في الإناء ذيل بتحريك عصا التحكم إلى الأمام، وتضغط على دواسة القدم لتقديم حقن مكروي. ملاحظة: حقن الناجح يمكن قياس من خلال مشاهدة السائل يدخل الدورة الدموية. وعلاوة على ذلك، وشارك في حقن nephrotoxicant مع ديكستران مترافق fluorescently تمكن الباحث للتحقق من نجاح الحقن لاحق لهذا الإجراء. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> سحب بلطف مرة أخرى على عصا التحكم لإزالة الإبرة من الجنين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحقن، ونقل الأجنة إلى طبق نظيف وشطف لإزالة تريكين واستبدالها مع الطازجة E3 / PTU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الجنين الى نقطة الوقت المطلوب لالحميرالصورة التشكل، والتي يمكن أن تكون موثقة عن التصوير في ميثيل سائل الإعلام المتصاعدة، أو عملية التحليل التجريبي كما تريد. ملاحظة: يجب تقييم استرداد الأجنة لتحديد نسبة الأفراد الذين يعانون من وذمة، مما يدل عادة الإصابة الكلوية. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

وقد ارتبطت عدد متنوع من العوامل العلاجية مع آكي 29. كانت هناك التقدم في البحوث كبيرة في فهم الضرر الناجم عن العديد من المركبات الفردية، مثل أمينوغليكوزيد جنتاميسين (30) وسيسبلاتين العلاج الكيميائي المستخدمة على نطاق واسع 31،32. بعض التغيرات المرضية الم...

آكي هو خسارة مفاجئة من وظيفة الكلى الذي يمكن أن يؤدي إلى عواقب صحية وخيمة 1. AKI قضية الرعاية الصحية كبيرة في جميع أنحاء العالم بسبب الإصابة في ارتفاع ما يقرب من 20٪ من المرضى في المستشفيات، مع معدلات أعلى من 30-50٪ في حالات الرعاية الحرجة وكبار السن، ومعدلات وفيات من 50-70٪ 1-3. للأسف، وانتشار آكي يتزايد، ومن المتوقع أن تزيد من تصعيد على مدى العقد المقبل، ويرجع ذلك جزئيا إلى تنوع العوامل التي يمكن أن تحدث AKI، والتي تشمل الإجهاد ما بعد الجراحة، نقص التروية، والتعرض لnephrotoxins مثل المضادات الحيوية و أدوية العلاج الكيميائي 4. AKI ينطوي على تلف الخلايا المفاجئ في الكلى، والتي تحدث عادة في النيفرون، والتي هي وحدات وظيفية أساسية، وتتألف من تصفية الدم وأنبوب صغير مجزأة التي تستنزف البول في المسالك جمع المركزية 1. عندما عددا كبيرا من النيفرون همتضررت خلال AKI، وتشمل الآثار المباشرة انقطاع في إزالة النفايات من الدورة الدموية، وخفض أو إلغاؤها تدفق السوائل من خلال النيفرون بسبب عرقلة من الميتة والخلايا 1. مع مرور الوقت، يمكن أن انسداد أنبوبي يؤدي إلى انحطاط النيفرون بأكملها، مما يقلل من وظيفة الكلى 1 بشكل دائم. تشمل التعديلات الفسيولوجية في الكلى التالية آكي أيضا أحداث التهابات المعقدة التي يمكن أن تؤدي إلى تندب المزمن 1. وعلى الرغم من هذه النتائج، النيفرون لديها بعض القدرة على الخضوع لتجديد بعد AKI أن reconstitutes 5،6 ظهارة أنبوبي. في حين كان هناك تفاهم الجزيئي المتزايد للتجديد كليون، تبقى آليات بعيد المنال في كثير من التحيات وتستلزم واصلت التحقيق 7. يبقى الدرجة التي ينتج AKI في تلف الكلى الدائم أيضا غير معروف. وتشير الأبحاث الحالية إمكانات التجدد لالكلى هيأعلى التالية الحالات الأقل شدة من AKI، في حين حلقات أكثر وضوحا أو المتكررة تؤدي إلى مرض الكلى المزمن (CKD) وتبلغ ذروتها في نهاية مرحلة المرض الكلوي (الداء الكلوي بمراحله الأخيرة) يتطلب زرع المنقذة للحياة أو غسيل الكلى 8،9. بالإضافة إلى ذلك، الأشخاص الذين يعانون بالفعل من كد هم في خطر أعلى للإصابة حاده حلقة من AKI 8،9. مجتمعة، فمن الواضح أن استمرار البحوث الأساسية والسريرية أمر حيوي لفهم ومعالجة ومنع AKI. وكانت الأبحاث مع نماذج حيوانية مفيدة في تقدير تطور التغيرات المحلية والبيئية التي تحدث أثناء AKI 10. لتوسيع هذا الفهم، وكذلك تطوير علاجات جديدة، وقد تم استخدام نموذج حيواني الزرد في مجموعة متنوعة من الطرق 11،12. النيفرون في الكلى الزرد، في كل من جنين وتعليم الكبار، وعرض على درجة عالية من الحفظ مع الثدييات 13-16. وعلاوة على ذلك، والإصابة الظهارية كليون في زيbrafish يشبه العملية في الفقاريات العليا، التي يعقب تدمير المحلي الخلايا الأنبوبية التي كتبها الانتشار داخل النبيبات وإعادة الهندسة المعمارية كليون 17-19. في الجنين، ومع ذلك، يرتبط تلف أنبوب صغير واسعة من nephrotoxins مثل سيسبلاتين مع الفتك 20،21. وعلى سبيل المقارنة، البالغين الزرد البقاء على قيد الحياة AKI وتظهر قدرات التجدد الموضوعية في الكلى. على سبيل المثال، بعد التعرض لجنتاميسين المضادات الحيوية أمينوغليكوزيد، الزرد تجديد أنبوب صغير الضرر الظهارية وتنمو وحدات كليون جديدة فضلا 22-24. في حين أن هذه الدراسات آكي الناجم عن جنتاميسين تقديم معلومات لا تقدر بثمن، فهم تلف الكلى من nephrotoxins المتنوعة أمرا حاسما في تقدير التأثيرات والاستجابة لأنواع مختلفة من الضرر 25. الجنين الزرد، نظرا لحجمها، والشفافية، وقابلية الإستطراق الجيني، له فوائد عديدة للدراسات سم كلوي &lt;سوب&gt; 25، حيث يتم استخدام طريقة حقن مكروي 20،21 لإدارة جزيء (ق) للتحقيق فيها. تتشكل النيفرون بنسبة 24 آخر ساعة الإخصاب (HPF) والبدء في تصفية الدم قبل ما يقرب من 48 HPF 26،27. وهكذا، وتشكيل السريع وظيفة الكلى الجنينية يسهل التحليل التجريبي. ومع ذلك، فإن عملية حقن مكروي ديها تحديات تقنية ويمكن أن يكون هناك منحنى التعلم حاد لاتقان هذه التقنية. في هذه المقالة الفيديو، ونحن تصف كيفية تنفيذ إبر دقيقة جدا، وتقديم نصائح استكشاف الأخطاء وإصلاحها من أجل تعزيز معدل الحقن الناجحة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="801">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:355px;">Sodium Chloride</td>
			<td style="width:229px;">American Bioanalytical</td>
			<td style="width:129px;">AB01915</td>
			<td style="width:88px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Potassium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB01652</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcium Chloride</td>
			<td>American Bioanalytical</td>
			<td>AB00366</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N-Phenylthiourea (PTU)</td>
			<td>Aldrich Chemistry</td>
			<td>P7629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethyl 3-aminobenzoate (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Borosilicate glass</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>BF100-50-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instruments Co.</td>
			<td>Mo. P097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">UltraPure Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>15510-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Magnesium Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M7506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methylene Blue</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Falcon Diposable Petri Dishes, Sterile, Corning:</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">60mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">100mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;(microinjection tray) 150mm x 15mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>25373-187</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Low Temperature Incubator</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>11 690 516DQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Micro Dissecting Tweezer</td>
			<td>Roboz Surgical Instruments Co.</td>
			<td>RS-5010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Micrometer</td>
			<td>Ted Pella, Inc.</td>
			<td>2280-24</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

nephrotoxin microinjection in zebrafish to model acute kidney injury

الكلى هي عرضة للضرر من التعرض للمواد الكيميائية التي يتم ترشيحها من مجرى الدم. هذا يمكن أن يؤدي إلى إصابة الجهاز يرتبط مع انخفاض سريع في وظائف الكلى وتطوير متلازمة سريرية المعروفة باسم قصور كلوي حاد وكالة (آكي). استخدام وكلاء الدوائية لعلاج الحالات الطبية التي تتراوح بين العدوى البكتيرية إلى السرطان، وعندما تدار بشكل فردي أو في تركيبة مع أدوية أخرى، يمكن الشروع AKI. الزرد هي نموذج حيواني مفيد لدراسة تأثيرات المواد الكيماوية على وظيفة الكلى في الجسم الحي، كما أنها تشكل الكلى الجنينية يتكون من وحدات وظيفية كليون التي يتم حفظها مع الفقاريات العليا، بما في ذلك البشر. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام الزرد لأداء شاشات الوراثية والكيميائية، والتي توفر فرصا لإلقاء الضوء على جوانب الخلوية والجزيئية لAKI ووضع استراتيجيات علاجية مثل تحديد جزيئات nephroprotective. هنا، علينا أن نظهر كيف microinjection فيويمكن استخدام الأجنة الزرد كنموذج للدراسات سم كلوي.

محطة حقن مكروي اقامة يتضمن مجهر تشريحي، micromanipulator ومنظم ضغط (الشكل 1A). تضوء من لوحة حقن هو الأفضل لعرض العينات خلال هذا الإجراء (الشكل 1B). إعداد إبرة الحقن ينطوي على سحب الزجاج البورسليكات المناسب، تليها إعداد حافة مع قطع والخلفية تح...

Watch this Scientific Journal Video about Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury at JoVE.com

Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

الإصابات الكلوية تكبدها من nephrotoxins، والتي تشمل الأدوية التي تتراوح بين المضادات الحيوية لمبحث المعالجة الكيميائية، يمكن أن يؤدي إلى اضطرابات معقدة التي لا تزال غير مفهومة تماما المرضية. يوضح هذا البروتوكول كيف الزرد يمكن استخدامها للنمذجة مرض من هذه الشروط، والتي يمكن تطبيقها لتحديد التدابير renoprotective.

سم كلوي حقن مكروي في الزرد لنموذج قصور كلوي حاد

The kidneys are susceptible to harm from exposure to chemicals they filter from the bloodstream. This can lead to organ injury associated with a rapid ...

nephrotoxin-microinjection-in-zebrafish-to-model-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Biology

8.8K Views.  University of Notre Dame.  الإصابات الكلوية تكبدها من nephrotoxins، والتي تشمل الأدوية التي تتراوح بين المضادات الحيوية لمبحث المعالجة الكيميائية، يمكن أن يؤدي إلى اضطرابات معقدة التي لا تزال غير مفهومة تماما المرضية. يوضح هذا البروتوكول كيف الزرد يمكن استخدامها للنمذج...

Video: Nephrotoxin Microinjection in Zebrafish to Model Acute Kidney Injury

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

زرع نخاع الكلى في الجامعة اسماك الزرد الكبار

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression studies. In zebrafish (Danio rerio), microinjection of RNA, DNA, proteins, antisense oligonucleotides and other small molecules into the developing embryo provides researchers a quick and robust assay for exploring gene function in vivo. In this video-article, we will demonstrate how to prepare and microinject in vitro synthesized EGFP mRNA and a translational-blocking morpholino oligo against pkd2, a gene associated with autosomal dominant polycystic kidney disease (ADPKD), into 1-cell stage zebrafish embryos. We will then analyze the success of the mRNA and morpholino microinjections by verifying GFP expression and phenotype analysis. Broad applications of this technique include generating transgenic animals and germ-line chimeras, cell-fate mapping and gene screening. Herein we describe a protocol for overexpression of EGFP and knockdown of pkd2 by mRNA and morpholino oligonucleotide injection.

Microinjection is a well-established and effective method for introducing foreign substances into fertilized zebrafish embryos. Here, we demonstrate a robust microinjection technique for performing mRNA overexpression, and morpholino oligonucleotide gene knockdown studies in zebrafish.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

An essential tool for investigating the role of a gene during development is the ability to perform gene knockdown, overexpression, and misexpression ...

Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic oligonucleotides with antisense complementarity to target RNAs, can be added to the embryo to reduce the expression of a particular gene product.  Conversely, processed mRNA can be added to the embryo to increase levels of a gene product.  The vehicle for adding either mRNA or morpholino to an embryo is microinjection.  Microinjection is efficient and rapid, allowing for the injection of hundreds of embryos per hour.  This video shows all the steps involved in microinjection.  Briefly, eggs are collected immediately after being laid and lined up against a microscope slide in a Petri dish.  Next, a fine-tipped needle loaded with injection material is connected to a microinjector and an air source, and the microinjector controls are adjusted to produce a desirable injection volume.  Finally, the needle is plunged into the embryo's yolk and the morpholino or mRNA is expelled.

This video shows how morpholino or mRNA can be injected into zebrafish embryos at the one-cell stage to decrease or increase the level of specific gene products during subsequent development.

Microinjection الجنين اسماك الزرد إلى تحليل وظائف الجينات

One of the advantages of studying zebrafish is the ease and speed of manipulating protein levels in the embryo.  Morpholinos, which are synthetic ...

Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae to Study Acute Kidney Injury

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections on 2 dpf zebrafish. This technique represents an efficient and rapid method to deliver soluble substances into the bloodstream of zebrafish larvae, allowing for the injection of 15-20 fish per hour. In addition to AKI studies, this microinjection technique can also be used for other types of experimental studies such as angiography.  We provide a detailed protocol of the technique from equipment required to visual measures of decreased kidney function. In addition, we also demonstrate the process of fixation, whole mount immunohistochemistry with a kidney tubule marker, plastic embedding and sectioning of the larval zebrafish. We demonstrate that zebrafish larvae injected with gentamicin show morphological features consistent with AKI: edema, loss of cell polarity in proximal tubular epithelial cells, and morphological disruption of the tubule.

We describe a technique of microinjecting the aminoglycoside, gentamicin, into 2 days post-fetilization (dpf) zebrafish larvae to induce acute kidney injury (AKI). We also describe a method for whole mount immunohistochemistry, plastic embedding and sectioning of zebrafish larvae to visualize the AKI mediated damage.

في الوريد من يرقات اسماك الزرد Microinjections لدراسة إصابة الكلى الحاد

In this video article we describe a zebrafish model of AKI using gentamicin as the nephrotoxicant.  The technique consists of intravenous microinjections ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

زرع الخلايا مباشرة في الكلى من اسماك الزرد الكبار

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1. Apoptosis can be triggered when cells encounter a wide range of cytotoxic stresses. These insults initiate signaling cascades that ultimately cause the release of cytochrome c from the mitochondrial intermembrane space to the cytoplasm2. The release of cytochrome c from mitochondria is a key event that triggers the rapid activation of caspases, the key cellular proteases which ultimately execute cell death3-4.
The pathway of apoptosis is regulated at points upstream and downstream of cytochrome c release from mitochondria5. In order to study the post-mitochondrial regulation of caspase activation, many investigators have turned to direct cytoplasmic microinjection of holocytochrome c (heme-attached) protein into cells6-9. Cytochrome c is normally localized to the mitochondria where attachment of a heme group is necessary to enable it to activate apoptosis10-11. Therefore, to directly activate caspases, it is necessary to inject the holocytochrome c protein instead of its cDNA, because while the expression of cytochrome c from cDNA constructs will result in mitochondrial targeting and heme attachment, it will be sequestered from cytosolic caspases. Thus, the direct cytosolic microinjection of purified heme-attached cytochrome c protein is a useful tool to mimic mitochondrial cytochrome c release and apoptosis without the use of toxic insults which cause cellular and mitochondrial damage.
In this article, we describe a method for the microinjection of cytochrome c protein into cells, using mouse embryonic fibroblasts (MEFs) and primary sympathetic neurons as examples. While this protocol focuses on the injection of cytochrome c for investigations of apoptosis, the techniques shown here can also be easily adapted for microinjection of other proteins of interest.

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

In this protocol, we describe the direct cytoplasmic microinjection of cytochrome c protein into fibroblasts and primary sympathetic neurons. This technique allows for the introduction of cytochrome c protein into the cytoplasm of cells and mimics the release of cytochrome c from mitochondria, which occurs during apoptosis.

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

تشريح الكلى اسماك الزرد الكبار

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

Laser-inflicted Injury of Zebrafish Embryonic Skeletal Muscle

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections (bupivacaine, cardiotoxin or notexin), muscle transplantations (denervation-devascularization induced regeneration), intensive exercise, but also murine muscular dystrophy models such as the mdx mouse (for a review of these approaches see 1). In zebrafish, genetic approaches include mutants that exhibit muscular dystrophy phenotypes (such as runzel2 or sapje3) and antisense oligonucleotide morpholinos that block the expression of dystrophy-associated genes4. Besides, chemical approaches are also possible, e.g. with Galanthamine, a chemical compound inhibiting acetylcholinesterase, thereby resulting in hypercontraction, which eventually leads to muscular dystrophy5. However, genetic and pharmacological approaches generally affect all muscles within an individual, whereas the extent of physically inflicted injuries are more easily controlled spatially and temporally1. Localized physical injury allows the assessment of contralateral muscle as an internal control. Indeed, we recently used laser-mediated cell ablation to study skeletal muscle regeneration in the zebrafish embryo6, while another group recently reported the use of a two-photon laser (822 nm) to damage very locally the plasma membrane of individual embryonic zebrafish muscle cells7.
Here, we report a method for using the micropoint laser (Andor Technology) for skeletal muscle cell injury in the zebrafish embryo. The micropoint laser is a high energy laser which is suitable for targeted cell ablation at a wavelength of 435 nm. The laser is connected to a microscope (in our setup, an optical microscope from Zeiss) in such a way that the microscope can be used at the same time for focusing the laser light onto the sample and for visualizing the effects of the wounding (brightfield or fluorescence). The parameters for controlling laser pulses include wavelength, intensity, and number of pulses.
Due to its transparency and external embryonic development, the zebrafish embryo is highly amenable for both laser-induced injury and for studying the subsequent recovery. Between 1 and 2 days post-fertilization, somitic skeletal muscle cells progressively undergo maturation from anterior to posterior due to the progression of somitogenesis from the trunk to the tail8, 9. At these stages, embryos spontaneously twitch and initiate swimming. The zebrafish has recently been recognized as an important vertebrate model organism for the study of tissue regeneration, as many types of tissues (cardiac, neuronal, vascular etc.) can be regenerated after injury in the adult zebrafish10, 11.

The method presented here comprises the precise injury of live zebrafish embryos with high-energy laser pulses and the subsequent analysis of these injuries and their recovery with time. We also show how genetically labeled single or groups of skeletal muscle cells can be tracked during and after laser light induced damage.

الليزر بإلحاق الضرر من العضلات الهيكلية اسماك الزرد الجنينية

Various experimental approaches have been used in mouse to induce muscle injury with the aim to study muscle regeneration, including myotoxin injections ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging اسماك الزرد الكبار

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Analysis of Nephron Composition and Function in the Adult Zebrafish Kidney

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys are composed of functional units known as nephrons, which are highly conserved with other vertebrates, including mammals. Research in zebrafish has recently demonstrated that two distinctive phenomena transpire after adult nephrons incur damage: first, there is robust regeneration within existing nephrons that replaces the destroyed tubule epithelial cells; second, entirely new nephrons are produced from renal progenitors in a process known as neonephrogenesis. In contrast, humans and other mammals seem to have only a limited ability for nephron epithelial regeneration. To date, the mechanisms responsible for these kidney regeneration phenomena remain poorly understood. Since adult zebrafish kidneys undergo both nephron epithelial regeneration and neonephrogenesis, they provide an outstanding experimental paradigm to study these events. Further, there is a wide range of genetic and pharmacological tools available in the zebrafish model that can be used to delineate the cellular and molecular mechanisms that regulate renal regeneration. One essential aspect of such research is the evaluation of nephron structure and function. This protocol describes a set of labeling techniques that can be used to gauge renal composition and test nephron functionality in the adult zebrafish kidney. Thus, these methods are widely applicable to the future phenotypic characterization of adult zebrafish kidney injury paradigms, which include but are not limited to, nephrotoxicant exposure regimes or genetic methods of targeted cell death such as the nitroreductase mediated cell ablation technique. Further, these methods could be used to study genetic perturbations in adult kidney formation and could also be applied to assess renal status during chronic disease modeling.

The zebrafish adult kidney is an excellent system for renal regeneration and disease studies. An essential aspect of such research is the assessment of nephron structure and function. This protocol describes several methodologies that can be implemented to assess nephron tubule composition and to evaluate renal reabsorption.

تحليل التركيب كليون وظيفة في الكلى اسماك الزرد الكبار

The zebrafish model has emerged as a relevant system to study kidney development, regeneration and disease. Both the embryonic and adult zebrafish kidneys ...