العلامات النجمية (*) تشير إلى خطوات جديدة أو معدلة بالمقارنة مع كريستنسن وآخرون. 1 1. إعداد المواد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتطلب إجراء زراعة الخلايا كميات كبيرة من البيض معزولة عن البالغين حامل. تنمو C. ايليجانس على 8P لوحات أجار المصنف مع NA22 (المتاحة من خلال كونسورتيوم الوراثية C. ايليجانس - CGC) لعزل البكتيريا كميات كبيرة من البيض. في هذه اللوحات كمية ببتون المستخدمة هي 8 أضعاف المبلغ الذي يستخدم عادة لوحات NGM. تركيز أعلى ببتون يحافظ على نمو البكتيريا NA22 أكثر كفاءة، والتي تتعارض مع OP50، تنمو في طبقات سميكة. </li></ol> 8P لوحات وصفة: حل 3 غرام كلوريد الصوديوم، 20 غراما Bacto-ببتون، 25 غراما أجار في 1 لتر من الماء المعقم المقطر والأوتوكلاف لمدة 30 دقيقة. اسمحوا بارد في المتوسط ​​55 درجة مئوية ثم قم بإضافة تصفيتها العقيمة-1 مل من الكولسترول (5 ملغ / مل في ETOH)، 1 مل من 1 MgCl 2، 1 مل من MgSO 4 و 25 مل من العازلة KP (الأسهم من 500 مل: 5 ز K 2 هبو 4، 30 غ KH 2 PO 4، ودرجة الحموضة 6.00). صب السائل أجار المتوسطة إلى 10 سم أطباق بتري (25 مل / لوحة). <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نشر في اليوم التالي السطح كله من كل المخصب ببتون وحة آغار مع 1 مل من NA22 E. القولونية بين عشية وضحاها مثقف في وسائل الإعلام 2XYT (16 ز تريبتون، استخراج 10 ز الخميرة، 5 ز كلوريد الصوديوم في 1 لتر من الماء المعقم، ودرجة الحموضة 7.0) في 37 درجة مئوية. تشكل هذه البكتيريا مصدر الغذاء وفيرة من شأنها أن تشكل طبقة سميكة دعم نمو كميات كبيرة من البالغين حامل. ترك لوحات المصنف بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة للسماح نمو البكتيريا. ويمكن تسريع هذه العملية عن طريق الحضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 4-5 ساعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات جوعا حتى المصنفة 8P لوحات. غسل الحيوانات قبالة لوحة NGM جوعا باستخدام 5-6 مل من العازلة M9 أو الماء وإضافة 1-2 مل من هذا التعليق على كل لوحة 8P. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمح بنمو وتكاثر الحيوانات الاتحاد الوطني للعماليتم ملؤها ايل لوحات في التقاء قبل الكبار حامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل البيض اللازمة لإعداد C. ايليجانس الخلايا الجنينية، من البالغين حامل باستخدام 5-6 مل من محلول تحلل. </li></ol> حل تحلل وصفة 5 مل من الطازجة بليتش، 1.25 مل من هيدروكسيد الصوديوم 10 N و 18.5 مل من H 2 O. العقيمة يجب أن يكون مستعدا هذا الخليط الطازجة قبل كل استعمال. <ol start="6" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البيض معزولة عن البالغين باستخدام حامل البيض العازلة: </li></ol> العازلة البيض وصفة 118 ملي مول كلوريد الصوديوم، و 48 ملي بوكل، 2 مم CaCl 2، 2 مم MgCl 2، 25 ملي Hepes، ودرجة الحموضة 7.3، الأسمولية 340 الميلي أسمول. <ol start="7" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قشر البيض الذي يحيط البيض عن طريق العلاج مع كيتيناز. كيتيناز هو انزيم مع أعلى نشاط في الرقم الهيدروجيني الحمضية 25. حل كيتيناز (سيغما، كتالوج رقم C6137) في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 عند تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. تخزين الأسهم كيتينازالحل في -20 درجة مئوية في 1 مل مأخوذة في معقم 15 مل أنابيب مخروطية. ويمكن تخزين aliquots في -20 درجة مئوية تصل إلى بضعة أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو C. ايليجانس الخلايا المستزرعة coverslips على تعقيمها (12 مم) مغطاة الفول السوداني كتين. حل الفول السوداني كتين في الماء المعقم (0.5 ملغ / مل). لا ينبغي أن تتم تصفيته الفول السوداني حل كتين أو تعقيمها. كما أنها لا تحتاج إلى أن تعامل مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية. مخزن 2 مل aliquots في -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كاملة مستنبت الخلية (500 مل) يحتوي على 500 مل L-15 مستنبت من GIBCO، 50 مل مصل بقري جنيني (الحرارة المعطل)، 7.7 غرام السكروز (45 الميلي أسمول)، 5 مل من 100 U / مل البنسلين و100 ميكروغرام / مل الستربتوميسين (2٪). ثم يتم تصفية المتوسطة كاملة باستخدام فلتر المسام 0.20 ميكرون. </li></ol> لاحظ أن المخزن المؤقت البيض ومستنبت لها الأسمولية من 340 و 345 على التوالي الميلي أسمول. في الواقع، خلافا للخلايا الثدييات، C. الخلايا ايليجانس ديك الأسمولية عالية نسبياالتي تحتاج إلى أن تؤخذ في العد عند إعداد الحلول التي سوف تأتي في اتصال مباشر مع غشاء البلازما من الخلايا. تم تعديل وصفات من هذه الكواشف للوصول إلى الأسمولية المطلوب، الذي يقاس باستخدام مقياس التناضح 1. فإنه ليس من الضروري استخدام مقياس التناضح إذا تم اتباع هذه الوصفات بالضبط ويتم استخدام الرعاية في إعداد هذه الكواشف. ومع ذلك، ينبغي للمرء أن استخدام osmoter إذا كان بحاجة إلى حلول أخرى لتكون مستعدة، التي لا يتم الإبلاغ عن وصفات هنا أو في أي من المطبوعات التي تستخدم C. ايليجانس الخلايا المستزرعة. 2. عزل البيض <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فمن المستحسن أن تبدأ مع أربعة 8P على الأقل لوحات لجمع ما يكفي من البيض لمدة 12 بئرا من الخلايا المستزرعة (في 24 لوحات جيدة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل البدء مع الإجراء ذوبان الجليد أنبوب واحد من محلول الفول السوداني الأسهم كتين. وضع coverslips تعقيمها في الجزء السفلي من الآبار في 24 لوحة جيدا وإضافة 200 ميكرولتر من الفول السوداني لكتين لل coverslips. احتضان لمدة 1 ساعة أو شntil الخلايا جاهزة للمطلي. إزالة تماما كتين الفول السوداني ويغسل مرة واحدة مع الآبار 1 مل من الماء المعقم تعقيمها. الاستئصال الكامل للكتين الفول السوداني من لل coverslips أمر ضروري لتجنب تراكمها الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل البالغين حامل قبالة لوحات أجار تعقيمها باستخدام الماء المعقم. جمع التعليق إلى قسمين العقيمة المخروطية أنبوب 50 مل. ترك الأنابيب على الجليد لمدة تصل إلى 5 دقائق للسماح للترسيب الديدان في الجزء السفلي من الأنابيب (*). إزالة المياه مع ماصة نقل البلاستيك واستبدالها بالماء تعقيمها العقيمة الطازجة. بيليه الديدان حسب الجدول بين كبار الطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). كرر هذه الخطوة الأخيرة على الأقل 3. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الديدان الى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي وبيليه لهم في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة (*). لا تستخدم أعلى سرعة الطرد المركزي لتجنب جمع البكتيريا في الجزء السفلي من الأنبوب كذلك. أحيانا بعد centrifugations لا مكعبات الديدان تماما. بالعربيةثالثا كل غسل وقبل إزالة طاف، ووضع الأنابيب لمدة 5 دقائق على الجليد. في مبرد المياه الديدان يعجل في الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الماء وإضافة 5-6 مل من محلول تحلل (انظر ضبط المواد متابعة). صخرة تعليق بلطف لمدة 5-10 دقائق ثم تبدأ رصد دودة تحلل تحت stereomicroscope كل 2-3 دقائق. يمكن وضع قطرة من التعليق أيضا على ساترة لتسهيل التفتيش. فترة حضانة تختلف تبعا لنضارة التبييض، شراء زجاجات صغيرة من التبييض وفتح زجاجة جديدة كل شهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم ~ هي lysed 70-80٪ من الديدان (10 دقيقة من بداية الحضانة)، ووقف رد فعل تحلل بإضافة 9 مل من البيض العازلة درجة الحموضة 7.3 (انظر ضبط المواد متابعة). الطرد المركزي تعليق في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. من هذه النقطة لديك ناسخ بنسن على، على مقاعد البدلاء لمنع إعادة التلوث من البيض (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية طاف باستخدام ماصة معقمة نقل البلاستيك وغسل بيليه 3-4س مع العازلة البيض حتى الحل واضح. تأكد من أن يمزج جيدا بيليه في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتم فصل البيض من جثث الحيوانات باستخدام 30٪ محلول السكروز. resuspend وبيليه في 2 مل من العازلة بيضة معقمة وإضافة 2 مل من 60٪ محلول السكروز (الأسهم في المخزن بيضة معقمة). تخلط جيدا وأجهزة الطرد المركزي لمدة 20 دقيقة في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية من أنابيب الطرد المركزي. البيض تطفو في الجزء العلوي من الحل. باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، ونقل عن البيض الطازج في 15 مل العقيمة أنبوب مخروطي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 مل من العازلة البيض العقيمة في أنبوب والطرد المركزي في 200 x ج (~ 1،200 دورة في الدقيقة) لمدة 10 دقيقة. تكرار غسل 3 ×. تأكد من معلق البيض تماما في المخزن المؤقت البيض أثناء كل غسل. </li></ol> 3. خلايا الجنينية التفكك إجراء الخطوات التالية من الإجراء تحت ظروف معقمة باستخدام غطاء تدفق الصفحي. بينما الحيواناتثوب على البكتيريا لوحات، ويغسل والعلاج مع الحل تحلل تحتوي على مواد التبييض يجب القضاء على معظم إن لم يكن كل البكتيريا. وبالتالي استخدام غطاء الصفحي في هذه المرحلة من الإجراء يمنع تلوث جديدة لتعليق البيض. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في resuspend مكعبات البيض في 1 مل من 2 ملغ / مل كيتيناز (الأسهم في البيض العازلة درجة الحموضة 6.5 (*)) ونقلها إلى العقيمة 15 مل أنبوب مخروطي الشكل الجديد. موسيقى الروك في أنبوب لمدة 10-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. فترة حضانة بالضبط يتغير وفقا لنضارة الإنزيم ودرجة حرارة الغرفة، ولذا ينبغي أن تحدد لكل إعداد. فمن المستحسن لبدء مراقبة البيض تحت المجهر مقلوب خلية الثقافة بعد 10 دقيقة من الحضانة. ملاحظة: في تجربتنا، وانخفاض الرقم الهيدروجيني يزيد من النشاط الأنزيمي كيتيناز. لهذا السبب نستخدم العازلة البيض في درجة الحموضة 6.5 حل كيتيناز (وصفة ذكرت أعلاه، حيث يتم ضبط درجة الحموضة إلى 6.5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يتم هضمها ~ 80٪ من البيض من قبلالعلاج كيتيناز (الشكلان 1 AB)، بيليه البيض بواسطة الطرد المركزي في 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة، وإزالة بعناية طاف وإضافة 3 مل من L-15 متوسطة (*). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل البيض في طبق قطره 6 سم وفصل بلطف الخلايا باستخدام محقنة معقمة 10 مل مزودة إبرة G 18. رصد درجة التفكك عن طريق وضع قطرة من تعليق في البلاستيك طبق بيتري الطازجة وعن طريق عرض تحت المجهر. لا نضح الهواء في حقنة خلال هذا الإجراء لتجنب الخلايا الضارة. تواصل التفكك حتى يتم فصلها ~ 80٪ من الخلايا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد التعليق باستخدام العقيمة 5 ميكرون ميليبور التصفية. يجب أن تتم تصفيته تعليق خلية من أجل إزالة كتل الخلايا والبيض واليرقات عسر الهضم. تصفية 4-5 مل إضافية من جديد L-15 وسائل الإعلام من خلال تصفية لاسترداد جميع الخلايا. لا تستخدم القوة المفرطة أثناء خطوة الترشيح لتجنب داmaging مرشح و / أو الخلايا. </li></ol> 4. زراعة خلايا <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في فصلها 900 x ج (~ 2،500 دورة في الدقيقة) لمدة 3 دقائق (*). باستخدام pipettor P1000 ونصائح عقيمة إزالة بعناية طاف جميع. resuspend الخلايا مكعبات كاملة في L-15 لوحة متوسطة و1 مل / جيد. مبلغ المتوسطة أضاف يعتمد على عدد من لوحات 8P المستخدمة، والتقاء الديدان على لوحات، ونوع التجارب التي سوف يتم تنفيذها على الخلايا. يمكن تحديد كثافة الخلية باستخدام عدادة الكريات. للحصول على تسجيلات التصحيح، المشبك تصفيح كثافة ~ 230،000 خلية / سم 2 هو الأمثل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على لوحة 24 بئرا في وعاء تثبرور بلاستيكية تحتوي على مناشف ورقية مبللة لتجنب التبخر من مستنبت. تخزين الحاويات في حاضنة ترطيب عند 20 درجة مئوية والهواء المحيط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وعادة ما تكون الخلايا جاهزة للتجارب في غضون 24 ساعة عندما تمايز المورفولوجية وصريحةايون من علامات GFP كاملة. يمكن أن تظل الخلايا في الثقافة لمدة تصل الى 2 أسابيع ولكنها عادة ما تكون أكثر صحية تصل إلى 7-9 أيام بعد الطلاء. المتوسط ​​يحتاج إلى استبداله مرة واحدة يوميا للحفاظ على الخلايا السليمة. </li></ol>

C. ايليجانس هو كائن نموذج فك رموز قوية لمسارات الجينية التي تساهم في التنمية والسلوك والشيخوخة. يلائمها ينبع في المقام الأول من السهولة التي يمكن التلاعب بها وراثيا ومن دورة حياة قصيرة. على الرغم يلائمها، C. ايليجانس لها حدودها. C. الخلايا ايليجانس ض...

انواع معينة ايليجانس (C. ايليجانس) هو كائن نموذج قوي للتحقيق الأسس الجزيئية وظيفة الخلوية، والتمايز، والسلوك. بينما في الجينوم، الأيض، المسارات البنائية تشبه الفقاريات &#39;، قابلية الإستطراق الوراثية والجزيئية التي هي أكبر بكثير 2. بين مزاياه وحجمها والتشريح بسيطة، ودورة الحياة السريع (3 أيام في 25 درجة مئوية)، فترة حياة قصيرة (2 أسابيع)، وعدد كبير من ذرية (&gt; 200). نظرا لطبيعتها خنثوي ودورة حياة قصيرة، التلاعب الجزيئية والجينية هي واضحة في C. ايليجانس، بما في ذلك جيل من الحيوانات المعدلة وراثيا 3،4 وتطبيق تقنيات الجينات تدق إلى أسفل مثل تدخل الحمض النووي الريبي 5. C. الجسم ايليجانس وقشر البيض هي شفافة. لذا الخلايا يمكن تصور بسهولة في كل من الكبار والجنين باستخدام المجهر القياسية. في السنوات ال 40 الماضية، وC. ايليجانس </م&gt; وقد خلق مجتمع الموارد لا تقدر بثمن لC. البحث ايليجانس بما في ذلك مجموعة كبيرة من المسوخ، وبالضربة القاضية المعدلة وراثيا، وصفا مفصلا لعلم التشريح والتنمية 6،7، بما في ذلك إعادة كاملة للجهاز العصبي 8، والجينوم التسلسل تماما وهو مشروح بشكل جيد ومتاحة للمجتمع بأكمله ( <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). على الرغم من العديد من المزايا، وبعض المناهج التجريبية تم تحدي في C. ايليجانس. وتشمل هذه تلك التي تتطلب الوصول إلى غشاء البلازما من الخلايا والأنسجة أو عزل أنواع الخلايا. في الواقع C. تقتصر الأنسجة ايليجانس داخل هيكل عظمي الهيدروستاتيكي الضغط، والتي لا يتم هضمها بسهولة عن طريق العلاج الأنزيمية أو المنظفات. في نهاية 1990s ميريام غودمان وجانيت ريتشموند رائدة أساليب التسجيلات الكهربية من C. ايليجانسالخلايا العصبية والخلايا العضلية في الموقع 9،10. في حين أن هذه الأساليب قدم لنا معلومات هامة عن العصبية وظيفة العضلات في الجسم الحي، فهي صعبة وانخفاض الإنتاجية. وقد وضعت وسائل بديلة لدراسة وظيفة الخلايا في الجسم الحي، ومعظمهم لا سيما في مجال التصوير الكالسيوم الجسم الحي باستخدام أجهزة استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا مثل GCamP وCAMELEON 11-13. على الرغم من هذه الأساليب، لا تسمح باستخدام أدوات الدوائية لأنها تطبق على الحيوانات الحية سليمة. المحاولة الأولى في زراعة C. وقدم الخلايا ايليجانس في المختبر في نطاق واسع من قبل ليرد بلوم أثناء إعداد أطروحة الدكتوراه 14. للأسف، واجه صعوبات مع التصاق الفقراء من الخلايا إلى الركيزة، وسوء تمايز الخلايا والبقاء على قيد الحياة حالت دون قيام هذا البروتوكول في وقت مبكر باعتبارها طريقة قوية ثقافة الخلية. في عام 1995 نشرت إدغار وزملاؤه إجراءللتحقيق في انقسام الخلايا والتشكل من خلال العزلة وثقافة C واحد. ايليجانس أجنة 15. الخلايا الجنينية التي حصل عليها الهضم من قشر البيض مع مزيج من العلاج الأنزيمية والتفكك دليل، واصلت لتتكاثر، وتنتج ما يصل الى 500 ~ 15 الخلايا. في وقت لاحق، ليونج وزملاء العمل مثقف أعداد صغيرة من لدراسة التشكل عن Blastomeres المعوية. أنها أظهرت أن واحدا في المختبر معزولة E قسيم أرومي إنتاج الخلايا المعوية الاستقطاب التي خلقت بنية مشابهة لمعة الأمعاء من خلال التفاعل مع بعضهم البعض من خلال تقاطعات الملتصقة القمي 16. كما ذكرت بخنر وزملاؤه طريقة مماثلة لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر 17. على أساس هذا العمل في وقت مبكر، وضعت كريستنسن وزملاؤه بروتوكول قوية لزراعة الجنينية C. ايليجانس الخلايا في المختبر 1. همأظهرت أن معزولة C. ايليجانس الخلايا يمكن أن تفرق في أنواع الخلايا المختلفة، والمحافظة على الميزات التي يمتلكها في الجسم الحي، بما في ذلك التعبير عن علامات خلية محددة. العديد من التقنيات التي تشكل تحديا في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على معزولة C. ايليجانس الخلايا الجنينية. وتشمل هذه الكهربية 1،18 19، والتصوير، وتقنيات immunochemical 20،21، وكذلك عزل أنواع معينة من الخلايا عن طريق خلية نيون المنشط الفرز (FACS) لبناء مكتبات [كدنا] خلية محددة 22،23. تقنيات الجينات ضربة قاضية مثل تدخل الحمض النووي الريبي (رني) يمكن تطبيقها على مثقف C. ايليجانس الخلايا 1 ورواية أسلوب وضع العلامات الأيضية باستخدام Azido السكر كأداة لاكتشاف بروتين سكري تم تطويرها مؤخرا للمثقف في المختبر C. ايليجانس الخلايا 24. في الختام، يوسع طريقة زراعة الخلايا المصفوفة ستقنيات و التي يمكن تطبيقها على C. ايليجانس نموذج في محاولة فك وظيفة الجين في سياق كائن حي. نحن هنا وصف بروتوكول لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في المختبر، والتي تقوم أساسا على البروتوكول وصف لأول مرة من قبل كريستيانسن و1 الزملاء.

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>REAGENTS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Peptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-382</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco Agar Granulated</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-784</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-284</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast Extract</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>90000-724</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leibovitz's L-15 Medium (1x) Liquid</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11415-064</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16140-063</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-streptomycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4333-100ML</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chitinase from Streptomyces Griseus</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6137-25UN</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NA22 Escherichia coli</td>
			<td>Caenorhabditis Genetics Center</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peanut Lectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0881-10MG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57903-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-(+)Glucose</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>67528-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene glycol-bis (2-aminoethylether), N,N,N',N'- tetraacidic acid (EGTA)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E0396-25G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hepes</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H3375-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>57653-1KG</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KCl</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9333-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CaCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C1016-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgCl2</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M8266-100G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MgSO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M2643-500 g</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>K2HPO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P2222-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KH2PO4</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9791-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S8045-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>KOH</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P1767-500G</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclaved distilled H2O</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>EQUIPMENT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>101-1000 &mu;l Blue Graduated Pipet Tips</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1111-2821</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 ml Sterilized Pipet Individually Wrapped</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1071-0810</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ergonomic Variable Volume (100-1000 &mu;l) Pipettor with tip ejector</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Portable Pipet Aid, Drummond</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>53498-103</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer Plastic Pipet Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>14670-114</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1475-1611</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Conical Tube</td>
			<td>USA Scentific</td>
			<td>1500-1811</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 18 gauge Needles</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305196</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 10 ml Syringes</td>
			<td>Becton, Dickinson and Co.</td>
			<td>305482</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Syringe Filters Corning 0,20 &mu;m pore size</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431224</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acrodic 25 mm Syringe filter w/5 &mu;m versapor Membrane</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>28144-095</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>60x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-548</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100x15 mm Petri Dish Sterile</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>82050-912</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 mm Diameter Glass Coverslips</td>
			<td>VWR International Inc.</td>
			<td>48300-560</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear Cell Culture Plates 24 Well Flat Bottom w/lid</td>
			<td>Thomas scientific</td>
			<td>6902A09</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dumont #5- Fine Forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5702</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022629883</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laminar Flow Hood</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope with x10 objective</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ambient air humidified Incubator</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a method for culturing embryonic c. elegans cells

C. ايليجانس هو نظام نموذجي قوية، حيث التقنيات الوراثية الجزيئية وقابلة للتطبيق بسهولة. حتى وقت قريب على الرغم من التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا وعزل أنواع معينة من الخلايا، لا يمكن تطبيقها في C. ايليجانس. وكان يرجع ذلك إلى حقيقة أن تقتصر الأنسجة داخل بشرة الضغط الذي لا يهضم بسهولة عن طريق العلاج مع الانزيمات و / أو المنظفات هذا القيد. على أساس العمل الرائد في وقت مبكر عن طريق ليرد بلوم، كريستنسن وزملاؤه 1 وضعت طريقة قوية لزراعة C. ايليجانس الخلايا الجنينية في نطاق واسع. يتم عزل البيض من البالغين حامل عن طريق العلاج مع التبييض / هيدروكسيد الصوديوم وعلاجها في وقت لاحق مع كيتيناز لإزالة قشر البيض. ثم يتم فصل الخلايا الجنينية من قبل pipetting اليدوي ومطلي على الزجاج المغطاة الركيزة في وسائل الإعلام التخصيب المصل. في غضون 24 ساعة من زنازين العزل تبدأ في التفريق عن طريق تغيير التشكل وبالإعراب عن MARKE خلية معينةروبية. C. ايليجانس الخلايا مثقف باستخدام هذا الأسلوب البقاء على قيد الحياة لمدة تصل 2 أسابيع في المختبر، وكانت تستخدم للالكهربية، immunochemical، ويحلل التصوير، فضلا عن أنها تم فرزها واستخدامها لالتنميط ميكروأري.

C. ايليجانس الخلايا المستزرعة والتفريق خلية صريحة علامات محددة أظهرت كريستنسن وزملاؤه باستخدام تلطيخ التريبان الأزرق أن&gt; 99٪ من الجنينية C. الخلايا ايليجانس تنجو من إجراء العزل. في يوم 9 و 22 بعد الطلاء، 85٪ و 65٪ على الت...

Watch this Scientific Journal Video about A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells at JoVE.com

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. التقنيات التي تتطلب الوصول المباشر إلى الخلايا أو عزل أنواع معينة من الخلايا من الأنسجة الأخرى يمكن تطبيقها على C. ايليجانس الخلايا المستزرعة.

منهج في التثقيف الجنينية<em&gt; C. ايليجانس</em&gt; خلايا

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

15.5K Views.  University of Miami.  نحن هنا وصف البروتوكول المنقح للثقافة واسعة النطاق من الجنينية C. ايليجانس الخلايا. الجنينية C. ايليجانس الخلايا المستزرعة في المختبر باستخدام هذا الأسلوب، ويبدو أن التفريق وألخص التعبير عن الجينات بطريقة معينة من الخلايا. ا...

Video: A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

Generation of Stable Transgenic C. elegans Using Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1. The plasmid DNA rearranges to form extrachromosomal concatamers that are stably inherited, though not with the same efficiency as actual chromosomes 2. A gene of interest is co-injected with an obvious phenotypic marker, such as rol-6 or GFP, to allow selection of transgenic animals under a dissecting microscope. The exogenous gene may be expressed from its native promoter for cellular localization studies. Alternatively, the transgene can be driven by a different tissue-specific promoter to assess the role of the gene product in that particular cell or tissue. This technique efficiently drives gene expression in all tissues of C. elegans except for the germline or early embryo 3. Creation of transgenic animals is widely utilized for a range of experimental paradigms. This video demonstrates the microinjection procedure to generate transgenic worms. Furthermore, selection and maintenance of stable transgenic C. elegans lines is described.

This video demonstrates the technique of microinjection into the gonad of C. elegans to create transgenic animals.

توليد مستقرة ايليجانس جيم المعدلة وراثيا عن طريق Microinjection

Transgenic Caenorhabditis elegans can be readily created via microinjection of a DNA plasmid solution into the gonad 1.  The plasmid DNA rearranges to ...

Application of a C. elegans Dopamine Neuron Degeneration Assay for the Validation of Potential Parkinson's Disease Genes

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations at risk. In the process of attempting to identify novel genetic factors associated with PD, scientists have generated many lists of candidate genes, polymorphisms, and proteins that represent important advances, but these leads remain mechanistically undefined. Our work is aimed toward significantly narrowing such lists by exploiting the advantages of a simple animal model system. While humans have billions of neurons, the microscopic roundworm Caenorhabditis elegans has precisely 302, of which only eight produce dopamine (DA) in hemaphrodites. Expression of a human gene encoding the PD-associated protein, alpha-synuclein, in C. elegans DA neurons results in dosage and age-dependent neurodegeneration.
Worms expressing human alpha-synuclein in DA neurons are isogenic and express both GFP and human alpha-synuclein under the DA transporter promoter (Pdat-1). The presence of GFP serves as a readily visualized marker for following DA neurodegeneration in these animals. We initially demonstrated that alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration could be rescued in these animals by torsinA, a protein with molecular chaperone activity 1. Further, candidate PD-related genes identified in our lab via large-scale RNAi screening efforts using an alpha-synuclein misfolding assay were then over-expressed in C. elegans DA neurons. We determined that five of seven genes tested represented significant candidate modulators of PD as they rescued alpha-synuclein-induced DA neurodegeneration 2. Additionally, the Lindquist Lab (this issue of JoVE) has performed yeast screens whereby alpha-synuclein-dependent toxicity is used as a readout for genes that can enhance or suppress cytotoxicity. We subsequently examined the yeast candidate genes in our C. elegans alpha-synuclein-induced neurodegeneration assay and successfully validated many of these targets 3, 4.
Our methodology involves generation of a C. elegans DA neuron-specific expression vector using recombinational cloning of candidate gene cDNAs under control of the Pdat-1 promoter. These plasmids are then microinjected in wild-type (N2) worms, along with a selectable marker for successful transformation. Multiple stable transgenic lines producing the candidate protein in DA neurons are obtained and then independently crossed into the alpha-synuclein degenerative strain and assessed for neurodegeneration, at both the animal and individual neuron level, over the course of aging.

This video demonstrates how to use C. elegans to assess dopaminergic neuron neurodegeneration as a model for Parkinson's disease. Furthermore, genetic screens are used to identify factors that either enhance degeneration or are neuroprotective.

تطبيق الفحص جيم ايليجانس الدوبامين العصبية للتحلل من التحقق من صحة جينات مرض باركنسون المحتملة

Improvements to the diagnosis and treatment of Parkinson's disease (PD) are dependent upon knowledge about susceptibility factors that render populations ...

Chromosomal Spread Preparation of Human Embryonic Stem Cells for Karyotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture conditions they become prone to acquire chromosomal anomalies such as addition of whole or parts of chromosomes. Indeed, during long-term culture, karyotypic alterations are observed when enzymatic or chemical dissociation are used 2,3,4, while manual dissection of colonies for passaging retains a stable karyotype 5. Besides, changes in the environment such as the removal of feeder cells also seem to compromise the genetic integrity of hESC 3,6. Once chromosomal alterations could affect cellular physiology, the characterization of the genetic integrity of hESC in vitro is crucial considering hESC as an essential tool in embryogenesis studies and drug testing. Furthermore, for future therapeutic purposes chromosomal changes are a real concern as it is frequently associated to carcinogenesis.
Here we show a simple and useful method to obtain high quality chromosome spreads for subsequent analysis of chromosome set by G-banding, FISH, SKY or CGH techniques 7,8. We recommend checking the chromosomal status routinely with intervals of 5 passages in order to monitor the appearance of translocations and aneuploidies
Priscila Britto and Rafaela Sartore contributed equally to the paper.

Karyotyping is a simple and useful technique widely used for detecting genetic alterations. Here we describe a step by step protocol for chromosome spread preparation of human embryonic stem cells for monitoring the chromosomal status of these cells maintained in culture.

الكروموسومات التحضير انتشار الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لKaryotyping

Although human embryonic stem cells (hESC) have been shown to present a stable diploid karyotype 1, many studies have reported that depending on culture ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

جيل المعدلة وراثيا C. ايليجانس عن طريق تحويل Biolistic

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and expression pattern of genes of interest or generation of tandem affinity purification (TAP) tagged versions of specific genes to facilitate their purification. Typically transgenes are generated by placing a promoter upstream of a GFP reporter gene or cDNA of interest, and this often produces a representative expression pattern. However, critical elements of gene regulation, such as control elements in the 3' untranslated region or alternative promoters, could be missed by this approach. Further only a single splice variant can be usually studied by this means. In contrast, the use of worm genomic DNA carried by fosmid DNA clones likely includes most if not all elements involved in gene regulation in vivo which permits the greater ability to capture the genuine expression pattern and timing. To facilitate the generation of transgenes using fosmid DNA, we describe an E. coli based recombineering procedure to insert GFP, a TAP-tag, or other sequences of interest into any location in the gene. The procedure uses the galK gene as the selection marker for both the positive and negative selection steps in recombineering which results in obtaining the desired modification with high efficiency. Further, plasmids containing the galK gene flanked by homology arms to commonly used GFP and TAP fusion genes are available which reduce the cost of oligos by 50% when generating a GFP or TAP fusion protein. These plasmids use the R6K replication origin which precludes the need for extensive PCR product purification. Finally, we also demonstrate a technique to integrate the unc-119 marker on to the fosmid backbone which allows the fosmid to be directly injected or bombarded into worms to generate transgenic animals. This video demonstrates the procedures involved in generating a transgene via recombineering using this method.

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

The ability to produce transgenes for Caenorhabditis elegans using genomic DNA carried by fosmids is particularly attractive as all of the native regulatory elements are retained. Described is a simple and robust procedure for the production of transgenes via recombineering with the galK selectable marker.

لإنتاج C. ايليجانس الجينات المحورة عبر Recombineering مع galK إختيار ماركر

The creation of transgenic animals is widely utilized in C. elegans research including the use of GFP fusion proteins to study the regulation and ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

قوية من الجيل الكبدية مثل خلايا الجنينية البشرية من السكان الخلايا الجذعية

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated tools and resources for studies in this system are facilitating continued discovery of genes with more subtle phenotypes or roles. 
Here we present a generalized protocol we adapted for identifying C. elegans genes with postembryonic phenotypes of interest using RNAi2. This procedure is easily modified to assay the phenotype of choice, whether by light or fluorescence optics on a dissecting or compound microscope. This screening protocol capitalizes on the physical assets of the organism and molecular tools the C. elegans research community has produced. As an example, we demonstrate the use of an integrated transgene that expresses a fluorescent product in an RNAi screen to identify genes required for the normal localization of this product in late stage larvae and adults. First, we used a commercially available genomic RNAi library with full-length cDNA inserts. This library facilitates the rapid identification of multiple candidates by RNAi reduction of the candidate gene product. Second, we generated an integrated transgene that expresses our fluorecently tagged protein of interest in an RNAi-sensitive background. Third, by exposing hatched animals to RNAi, this screen permits identification of gene products that have a vital embryonic role that would otherwise mask a post-embryonic role in regulating the protein of interest. Lastly, this screen uses a compound microscope equipped for single cell resolution.

RNAi Screening to Identify Postembryonic Phenotypes in C. elegans

We describe a sensitized method to identify postembryonic regulators of protein expression and localization in C. elegans using an RNAi-based genomic screen and an integrated transgene that expresses a functional, fluorescently tagged protein.

[رني الفرز لتحديد الظواهر تال للمرحلة الجنينية في C. ايليجانس</em

C. elegans has proven to be a valuable model system for the discovery and functional characterization of many genes and gene pathways1. More sophisticated ...

Preparation of Mouse Embryonic Fibroblast Cells Suitable for Culturing Human Embryonic and Induced Pluripotent Stem Cells

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it is not easy to establish an effective system for culturing these cells. Since the culture conditions can influence gene expression that confers pluripotency in hESCs and hiPSCs, the optimization and standardization of the culture method is crucial.
The establishment of hESC lines was first described by using MEFs as feeder cells and fetal bovine serum (FBS)-containing culture medium2. Next, FBS was replaced with knockout serum replacement (KSR) and FGF2, which enhances proliferation of hESCs3. Finally, feeder-free culture systems enable culturing cells on Matrigel-coated plates in KSR-containing conditioned medium (medium conditioned by MEFs)4. Subsequently, hESCs culture conditions have moved towards feeder-free culture in chemically defined conditions5-7. Moreover, to avoid the potential contamination by pathogens and animal proteins culture methods using xeno-free components have been established8.
To obtain improved conditions mouse feeder cells have been replaced with human cell lines (e.g. fetal muscle and skin cells9, adult skin cells10, foreskin fibroblasts11-12, amniotic mesenchymal cells13). However, the efficiency of maintaining undifferentiated hESCs using human foreskin fibroblast-derived feeder layers is not as high as that from mouse feeder cells due to the lower level of secretion of Activin A14. Obviously, there is an evident difference in growth factor production by mouse and human feeder cells.
Analyses of the transcriptomes of mouse and human feeder cells revealed significant differences between supportive and non-supportive cells. Exogenous FGF2 is crucial for maintaining self-renewal of hESCs and hiPSCs, and has been identified as a key factor regulating the expression of Tgf&beta;1, Activin A and Gremlin (a BMP antagonist) in feeder cells. Activin A has been shown to induce the expression of OCT4, SOX2, and NANOG in hESCs15-16.
For long-term culture, hESCs and hiPSCs can be grown on mitotically inactivated MEFs or under feeder-free conditions in MEF-CM (MEF-Conditioned Medium) on Matrigel-coated plates to maintain their undifferentiated state. Success of both culture conditions fully depends on the quality of the feeder cells, since they directly affect the growth of hESCs.
Here, we present an optimized method for the isolation and culture of mouse embryonic fibroblasts (MEFs), preparation of conditioned medium (CM) and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the levels of Activin A within the media.

The quality of mouse embryonic fibroblasts (MEFs) is dictated by the right strain of mouse such as CF-1. Pluripotency-supportive MEFs and conditioned media (CM) obtained from these should contain optimal concentrations of Activin A, Gremlin and Tgf&beta;1 needed for the Activin/Nodal and FGF pathways to co-operatively maintain self-renewal and pluripotency.

إعداد خلايا الفأر الجنينية الخلايا الليفية مناسبة للالإنسان التثقيف الجنينية والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة

In general, human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs)1 can be cultured under variable conditions. However, it ...

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

The pancreas controls vital functions of our body, including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar levels1. Although in the past decade many studies have contributed to a solid foundation for understanding pancreatic organogenesis, important gaps persist in our knowledge of early pancreas formation2. A complete understanding of these early events will provide insight into the development of this organ, but also into incurable diseases that target the pancreas, such as diabetes or pancreatic cancer. Finally, this information will generate a blueprint for developing cell-replacement therapies in the context of diabetes.
 During embryogenesis, the pancreas originates from distinct embryonic outgrowths of the dorsal and ventral foregut endoderm at embryonic day (E) 9.5 in the mouse embryo3,4. Both outgrowths evaginate into the surrounding mesenchyme as solid epithelial buds, which undergo proliferation, branching and differentiation to generate a fully mature organ2,5,6. Recent evidences have suggested that growth and differentiation of pancreatic cell lineages, including the insulin-producing &beta;-cells, depends on proper tissue-architecture, epithelial remodeling and cell positioning within the branching pancreatic epithelium7,8. However, how branching morphogenesis occurs and is coordinated with proliferation and differentiation in the pancreas is largely unknown. This is in part due to the fact that current knowledge about these developmental processes has relied almost exclusively on analysis of fixed specimens, while morphogenetic events are highly dynamic.
 Here, we report a method for dissecting and culturing mouse embryonic pancreatic buds ex vivo on glass bottom dishes, which allow direct visualization of the developing pancreas (Figure 1). This culture system is ideally devised for confocal laser scanning microscopy and, in particular, live-cell imaging. Pancreatic explants can be prepared not only from wild-type mouse embryos, but also from genetically engineered mouse strains (e.g. transgenic or knockout), allowing real-time studies of mutant phenotypes. Moreover, this ex vivo culture system is valuable to study the effects of chemical compounds on pancreatic development, enabling to obtain quantitative data about proliferation and growth, elongation, branching, tubulogenesis and differentiation. In conclusion, the development of an ex vivo pancreatic explant culture method combined with high-resolution imaging provides a strong platform for observing morphogenetic and differentiation events as they occur within the developing mouse embryo.

A System for ex vivo Culturing of Embryonic Pancreas

Here, we describe a method for isolation, culture and manipulation of mouse embryonic pancreas. This represents an excellent ex vivo system for studying various aspects of pancreatic development, including morphogenesis, differentiation and growth. Pancreatic bud explants can be cultured for several days and used in a range of different applications, including whole-mount immunofluorescence and live imaging.

نظام ل<em&gt; خارج الجسم</em&gt; التثقيف البنكرياس الجنينية

The pancreas controls vital functions of our body,  including the production of digestive enzymes and regulation of blood sugar  levels1. Although in the ...

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has since been used extensively as a model organism 1. C. elegans possesses key attributes such as simplicity, transparency and short life cycle that have made it a suitable experimental system for fundamental biological studies for many years 2. Discoveries in this nematode have broad implications because many cellular and molecular processes that control animal development are evolutionary conserved 3.
C. elegans life cycle goes through an embryonic stage and four larval stages before animals reach adulthood. Development can take 2 to 4 days depending on the temperature. In each of the stages several characteristic traits can be observed. The knowledge of its complete cell lineage 4,5 together with the deep annotation of its genome turn this nematode into a great model in fields as diverse as the neurobiology 6, aging 7,8, stem cell biology 9 and germ line biology 10. 
An additional feature that makes C. elegans an attractive model to work with is the possibility of obtaining populations of worms synchronized at a specific stage through a relatively easy protocol. The ease of maintaining and propagating this nematode added to the possibility of synchronization provide a powerful tool to obtain large amounts of worms, which can be used for a wide variety of small or high-throughput experiments such as RNAi screens, microarrays, massive sequencing, immunoblot or in situ hybridization, among others. 
Because of its transparency, C. elegans structures can be distinguished under the microscope using Differential Interference Contrast microscopy, also known as Nomarski microscopy. The use of a fluorescent DNA binder, DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole), for instance, can lead to the specific identification and localization of individual cells, as well as subcellular structures/defects associated to them.

Basic Caenorhabditis elegans Methods: Synchronization and Observation

The easiness of maintaining and propagating the nematode C. elegans make it a nice model organism to work with. The possibility of synchronizing worms allows the work with a significant amount of subjects at the same developmental stage, what facilitates the study of one particular process in many animals.

الأساسية<em&gt; Caenorhabditis ايليجانس</em&gt; طرق: التزامن والمراقبة

Research into the molecular and developmental biology of the nematode Caenorhabditis elegans was begun in the early seventies by Sydney Brenner and it has ...

منهج في التثقيف الجنينية

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video