The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Os neutrófilos foram isolados de voluntários saudáveis ​​que tenham assinado o termo de consentimento. A pesquisa foi realizada em conformidade com as diretrizes institucionais e nacionais para o bem-estar humano. 1. chapeamento e Manutenção de veia umbilical humana células endoteliais <ol><li> Células Cultura Cordão Veia endoteliais (HUVEC) de acordo com as instruções do fabricante. As HUVECs crescem em fibronectina (FN) -Revestido pratos (10 ug / ml, dissolvidos em água desmineralizada) utilizando meios (Meio Basal Endotelial (EBM-2) meio suplementado com Meio de Crescimento Endotelial (EGM-2) singlequots). Use cultura celular entre 4-8 passagens para os experimentos. </li><li> Dia 1: O revestimento de fluxo de câmaras com 100 mL de fibronectina (10 ug / ml em PBS), durante pelo menos 2 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Dia 2: Quando as células atingem 80-90% de confluência, as células trypsinize após lavagem cuidadosa com solução salina tamponada com fosfato temperatura ambiente (PBS) pH 7,4, centrifugar a 800 xg e ressuspender em 800 mil células / ml, utilizando meios de comunicação. Placa de 80.000 células em cada canal do fluxo de câmaras FN-revestidos e Pipeta suavemente a suspensão de células para cima e para baixo. Cultura O / N em uma incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2. </li><li> Dia 3: Atualizar a mídia no slide fluxo câmara inclinando ligeiramente as lâminas em um ângulo de 45 °. (Ver Figura 1A). NOTA: Recomenda-se apenas remova a mídia nos reservatórios e não no próprio canal. Remoção dos meios de comunicação nos canais pode resultar em perda de células endoteliais e morte devido à força arrastando da média causada por pipetagem. </li><li> Verificar por microscopia de contraste de fase, se as células endoteliais formam uma monocamada (isto é, 100% confluente). Se as células não são 100% confluentes, alterar a mídia duas vezes por dia até atingirem 100% de confluência. </li><li> Uma vez que as células atingiram a confluência, estimular as células com meios de comunicação (ver passo1,1) contendo mediador inflamatório (TNF-α (10 ng / ml)). Estimular HUVECs S / N (isto é, 12 horas) com os resultados de TNF-α num fenótipo inflamatória do endotélio, por exemplo., A sobre-regulação de moléculas de adesão celular, tais como ICAM-1 e VCAM-1 13. </li></ol> 2 de leucócitos polimorfonucleares isolamento utilizando gradientes de Percoll <ol><li> Preparar N-2-hidroxietilpiperazina-N&#39;-2-etanossulfónico (HEPES) -buffer (daqui em diante chamado de: fluxo de tampão), antes do isolamento de leucócitos polimorfonucleares (PMN). Flow-tampão é usado para lavar os PMNs isolados e como tampão no ensaio de fluxo. Para preparar o fluxo de tampão: diluir 7,72 g de NaCl (132 mM), 4,76 g de HEPES (20 mM), 0,45 g de KCl (6 mM), 0,25 g de MgSO 4 7H 2 O • (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H 2 O (1,2 mM) em 1 L de água desmineralizada e ajusta-se até pH 7,4 (esta unidade pode ser mantida a 4 ° C, durante várias semanas). </li><li> Adicionar 100 ul fresco 1 M CaCl2 &amp; #160, (1 mM), 2,5 ml de albumina humana a partir de uma concentração de 200 g / l de estoque (0,5% v / v) e 0,1 g de glicose a 100 ml (0,1% w / v) de tampão de fluxo. Em seguida, filtra-se o tampão de fluxo utilizando um filtro de 0,45 um. NOTA: Este buffer fluxo precisa ser preparada para cada experimento. </li><li> Antes do isolamento do PMN, preparar uma solução a 10% de citrato trissódico (TNC) em PBS, pH 7,4. </li><li> Recolher 20 ml de sangue total em vacuettes heparina sódica de um voluntário saudável. Dilui-se o sangue total de 1: 1 com 10% de PBS / TNC em tubos de 50 ml e 20 ml de sangue diluído de pipeta cuidadosamente em 12,5 ml de Percoll (a 23% (w / w) de solução coloidal em água com uma densidade de 1,130 g / ml) em um novo tubo de 50 ml. Cuidadosamente coloque os tubos em centrífuga e girar durante 20 minutos a 800 xg, com aceleração e baixa sem pausa ajustado à temperatura ambiente. NOTA: Ao adicionar o sangue diluído ao Percoll, incline o tubo Percoll contendo em um ângulo de 45 ° e pipeta suavemente o sangue diluído na sagacidade tuboh a configuração mais lenta pipeta menino. </li><li> Remover todo o líquido e subsequentemente encher o tubo com a lise de eritrócitos-tampão gelado (4,15 g NH 4 Cl [0,155 M], 0,5 g de KHCO3 [0,01 M] e 18,5 mg de EDTA (triplex III) [0,1 mM] a 500 ml de gelado de H 2 O) para lisar os eritrócitos. Deixar o tubo em gelo, ocasionalmente, invertendo o tubo, até a suspensão torna-se vermelho escuro, seguido por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C com intervalos activado. NOTA: A fracção de sedimento contem os PMNs (neutrófilos, eosinófilos, basófilos) em conjunto com os eritrócitos. </li><li> Remover o sobrenadante e lave o peletizado duas vezes em lise-tampão gelado a 500 xg durante 5 min a 4 ° C. </li><li> Ressuspender o sedimento com tampão de fluxo à TA e determinar a concentração de PMN utilizando um hemocitómetro ou contador de células automatizado. Suspender as PMNs em fluxo tampão a 1 x 10 6 células / ml e manter à temperatura ambiente. </li></ol> 3. Rotulagem de junção endotelialai VE-caderina e PECAM-1 <ol><li> Adicionar o PECAM Alexa Fluor 647 anticorpo (clone WM59) a uma diluição 1: 100 e o anticorpo de VE-caderina-FITC independente de cálcio (clone 55-7H1) a uma diluição de 1:50 para meio de cultura de HUVEC (ver passo 1.1), e incubar durante 30 min antes de se iniciar a experiência de fluxo de visualizar dinâmica de junção de células endoteliais durante a transmigração de neutrófilos sob condições de fluxo fisiológico. NOTA: Antes de adicionar os anticorpos diretamente rotulados ao fluxo câmaras, que o volume de cada canal não exceda 100 l. Isto ajuda a manter as despesas de anticorpo tão baixo quanto possível. </li></ol> 4. PMN TEM Ensaio Sob Fluxo <ol><li> Coloque as PMNs em banho-maria durante 15 min a 37 ° C antes de injectar-los para o sistema de fluxo. </li><li> Conecte o tubo de um fluxo-câmara vazia e encha com água morna (por exemplo, 37 ° C) Fluxo-buffer (veja o passo 4.3) para evitar a formação de bolhas de ar quando a criação de thsistema de e fluxo. </li><li> Conectar um lado de uma câmara vazia de fluxo para o sistema de fluxo da bomba de seringa, o uso de tubos de silicone contendo uma seringa de 20 ml, e colocar a câmara de fluxo para a fase de microscópio. </li><li> Ligue o outro lado de um fluxo-câmara vazia para o frasco reservatório enchido com 37 ° C, o fluxo de tampão (Figura 1B) e ligar a bomba de seringa, de modo a encher todo o tubo de escoamento tampão. A bomba vai puxar o fluxo tampão do reservatório, através da câmara de fluxo para dentro da seringa. NOTA: Este tubo também contém uma porta de injecção na linha de Luer, o que permite que os PMN a ser injectada com uma agulha na experiência de marcha, sem interromper o fluxo e criando as bolhas de ar. </li><li> Substituir o fluxo da câmara de vazio com a câmara de fluxo contendo tratados com TNF-α HUVECs, ligar o tubo de fluxo contendo tampão e colocá-lo na fase de microscópio (Figura 1C). Beliscar fora dos tubos antes de desligar e voltar a ligar om para as câmaras que contêm a HUVEC, como não beliscar fora pode resultar na formação de bolhas de ar no interior do tubo e / ou de fluxo de câmaras. </li><li> Ajustar a velocidade do fluxo de 1 dyn / cm 2, de acordo com a velocidade de fluxo fisiológico em vénulas pós-capilares (1-5 dyn / cm 2). </li><li> Grave contraste de interferência diferencial (DIC), FITC (488 nm) e Alexa Fluor 647 (647 nm) simultaneamente, utilizando um microscópio de varredura a laser confocal. </li><li> Injectar as PMNs (passo 4.1) lentamente no sistema de fluxo, através do em-linha Luer porta de injecção (Figura 1D) utilizando seringas de 1 ml. </li><li> Depois de alguns minutos, os leucócitos aparecem, aderir, e transmigrate. Parar a experiência em qualquer momento desejado, desligando o tubo a partir da câmara de escoamento e a pipetagem fixador (formaldeído a 3,7% em PBS), na câmara de fluxo. Permitir fixação durante 10 minutos, seguido de lavagem com PBS. Os dados são analisados ​​por meio de software de imagem (ver materiais e equipamentos de mesa). NOTA: Execute o que experimento utilizando um microscópio de varredura a laser confocal equipado com uma câmara climática com temperatura constante a 37 ° C, 5% de CO2, e um óleo de 63X-objetivo. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. 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Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Por este protocolo, é crítica para impedir a formação de bolhas de ar nas câmaras de fluxo, uma vez que isto irá resultar na apoptose de células e uma monocamada interrompido. Para evitar isso, queremos salientar que pagar particular interesse para os passos 4.2 e 4.5, onde os tubos estão ligados à câmara de fluxo. Um outro passo crucial no protocolo é a iniciação das PMNs que são mantidos à temperatura ambiente através da sua incubação durante 15-30 minutos a 37 ° C antes de injectar-los para a câmara de fluxo (passo 4.1). Isto resulta na iniciação das integrinas de leucócitos, permitindo-lhes aderir às moléculas de adesão tais como ICAM-1 ou VCAM-1 no endotélio. Este protocolo não está restrito para estudar a transmigração de neutrófilos. Também podem ser utilizados outros tipos de leucócitos tais como monócitos ou linfócitos. Note-se que o passo 4.1, isto é, os leucócitos priming pode ser diferente entre os tipos de leucócitos. Além disso, outros tipos de células endoteliais pode ser utilizado. Por isso, continua a ser críticopara estimular as células endoteliais a estímulos inflamatórios adequados, tais como TNF-α ou IL-1β. Se os neutrófilos não respondem em transmigração, pode-se pensar em tratar o brevemente neutrófilos (5 min) com N-formil-L-metionil-L-leucil-L-fenilalanina (fMLP), péptido 16. Isso vai estimular os neutrófilos, em particular as suas integrinas, ainda mais, tornando-os mais propensos a aderir ao endotélio. Normalmente 1 dyn / cm 2 velocidade de fluxo é utilizado. Esta velocidade de fluxo é medido em vênulas pós-capilares, locais onde a maior migração de leucócitos transendotelial ocorre 17. Usando as câmaras de fluxo descritas, é possível aumentar a velocidade de fluxo de até 10 dines / cm 2. No entanto, não é recomendado para aumentar o cisalhamento adicional. Isso pode provocar uma fuga indesejada do tubo e descolamento das células a partir da câmara de fluxo. Os resultados descritos na Figura 3 indicam que estesOs anticorpos podem ser utilizados para visualizar e estudar a dinâmica das junções endoteliais célula-célula durante a diapedese de leucócitos. Em particular, para além dos ensaios de transmigração existentes este protocolo permite discriminar paracelular de migração transcelular em condições de fluxo fisiológicas em tempo real. Uma vez que os anticorpos manchar as junções célula-célula, pode-se marcar o número de leucócitos que atravessar VE-caderina / entroncamentos PECAM-1 positivos contra não positivo VE-caderina / PECAM-1 locais. Desta forma, a migração intracelular pode ser discriminada da migração paracellular. É importante salientar que estes anticorpos não interferem com a função das proteínas que se ligam ao anticorpo a: PECAM-1 utilizados neste estudo é dirigido contra o segundo domínio extracelular. As células endoteliais foram plaqueadas na presença de anticorpo não apresentaram quaisquer defeitos de propagação ou formação de uma monocamada, sugerindo que o anticorpo, pelo menos não o fezinterfere com as interacções homotípicas entre as células endoteliais. para além disso, ambos os anticorpos não prejudica a capacidade dos neutrófilos para migrar através da monocamada endotelial. Além disso, o número de neutrófilos que transmigrar através da monocamada endotelial na ausência ou na presença de anticorpos não é alterada (dados não apresentados). É importante salientar, a microscopia confocal a laser nos dá a possibilidade de gravar diversos canais fluorescentes e DIC simultaneamente. Assim, este ensaio permite estudar a dinâmica da VE-caderina e PECAM-1, ao mesmo tempo, quando um dos neutrófilos atravessa a junção célula-célula endotelial e irá ajudar a entender por leucócitos escolher um percurso sobre o outro, isto é, contra paracelular transcelular.

Eficiente e rigidamente controlado migração de leucócitos transendotelial (TEM) é de importância fundamental em processos fisiológicos como a vigilância imunológica e inflamação aguda. No entanto, sob certas condições fisiopatológicas, TEM descontrolada e excessiva resultante é observado em doenças inflamatórias crónicas (por exemplo, artrite reumatóide, aterosclerose, asma). Também durante a metástase de células tumorais, o processo de migração transendotelial é instrumental para células tumorais para deixar a circulação de metástase 1-3. A fim de interferir especificamente com leucócitos excessiva ou MET de células de tumor, é necessário um conhecimento detalhado da regulação deste processo. Acredita-se que o processo ocorre através de MET diferentes etapas. Estudos seminais, avaliação, há duas décadas por Butcher e Springer, levou ao modelo de várias etapas que descreve o processo de TEM 4,5. Este modelo ainda é válido, embora alguns anúncioetapas nal foram incluídas 6. Alon et ai. Descrito a necessidade da presença de quimiocinas imobilizadas na superfície do endotélio 7. Recentemente, eles mostraram que o próprio endotélio gera quimiocinas que são apresentados na superfície apical endotelial 8. Além disso, o mesmo grupo apresentou a importância das condições de fluxo durante TEM 7. Recentemente, várias publicações voltadas para as duas rotas diferentes leucócitos pode tomar na fase final da diapedese TEM. Eles podem ir através da junção célula-célula, isto é, o percurso de migração paracelular, ou atravessam o corpo da célula endotelial, conhecido como o percurso de migração transcelular 9. Carman e seus colegas estudaram estes percursos em detalhe e concluiu que os leucócitos, preferencialmente, escolher a rota de migração paracellular (90%) ao longo da via transcelular (10%) ao atravessar uma monocamada endotelial da veia umbilical 10.No entanto, quando foram utilizadas células endoteliais de outras origens, por exemplo, cérebro ou microvasculatura, mais leucócitos utilizada a via transcelular (30%) 11. O grupo Vestweber mostraram recentemente que quando as junções célula-célula foram incapazes de se dissociam umas das outras por meio de um bate-em modelo animal, a substituição endógena VE-caderina para uma VE-caderina-alfa-catenina quimera, leucócitos MET foi totalmente bloqueada 12 . Surpreendentemente, os autores verificaram que TEM foi bloqueado em vários, mas não todos, os tecidos. Em geral, estas experiências indicaram que os leucócitos elegantes preferidas via paracelular através da via transcelular, embora os sinais reguladores que desencadeiam esta decisão ainda são desconhecidos. Embora a maioria dos leucócitos preferência o percurso de migração paracelular, ainda é difícil discriminar entre as duas vias. Além de que, apesar de vários estudos focalizando o papel do Junct célula-célula endotelialíons, a dinâmica desses cruzamentos, em especial, as proteínas juncionais VE-caderina e PECAM-1, durante a travessia de leucócitos ainda está em debate. Foi desenvolvido um ensaio relativamente simples, no qual estas moléculas de junção pode ser monitorado em tempo real durante a diapedese de leucócitos em condições de fluxo fisiológicas, utilizando anticorpos marcados fluorescentemente. Estes anticorpos não interferir ou bloquear integridade juncional ou mobilidade das proteínas-alvo. Este ensaio nos permite acompanhar a dinâmica das proteínas juncionais durante o processo de paracellular TEM. Além disso, este ensaio também permite discriminar entre os parágrafos e transcelulares rotas de migração.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Durante a inflamação, leucócitos deixam a circulação e atravessar o endotélio para combater patógenos invasores nos tecidos subjacentes. Este processo é conhecido como a migração de leucócitos transendotelial. Duas vias de leucócitos para atravessar a monocamada endotelial foram descritos: a via paracelular, ou seja, através da junção célula-célula e da via intracelular, isto é, através do corpo da célula endotelial. No entanto, tem sido tecnicamente difícil discriminar entre o pará- e via transcelular. Foi desenvolvido um ensaio in vitro simples para estudar a distribuição dos endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de neutrófilos sob condições de fluxo fisiológico. Antes da perfusão de neutrófilos, células endoteliais foram tratados brevemente com anticorpos marcados com fluorescência contra VE-caderina e PECAM-1. Estes anticorpos não interferem com a função de ambas proteínas, tal como foi determinado pela célula-substra eléctricoste de detecção da impedância e FRAP medições. Utilizando este ensaio, foi possível seguir a distribuição da endógena VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial sob condições de fluxo e discriminar entre os parágrafos e migração transcelular rotas dos leucócitos através do endotélio.

Primeiro, testamos se os anticorpos não interferiu com a função de barreira do endotélio. Medimos a resistência de monocamadas endoteliais usando célula-substrato impedância detecção elétrica (ECIS). Para mais detalhes, ver Van Buul et al. 13 Nenhuma mudança na resistência foi observada quando o anticorpo anti-VE-caderina fluorescentemente marcada foi adicionada às células (Figura 2A). Um anticorpo anti-VE-caderina, que é bem conhecida para bloquear a VE-caderina função reduzida a resistência dramaticamente (Figura 2A). Além disso, os anticorpos utilizados para imagiologia de não alterar a dinâmica de VE-caderina, como foi avaliado através da medição de fluorescência a recuperação após foto-branqueamento (FRAP) de VE-caderina-GFP (Figura 2B). Após 1-2 minutos, os neutrófilos aderida à monocamada endotelial activado como poderia ser visualizado no canal de DIC (Figura 3A). Depois de rastejar para 5-30 sec, a grande maioria dos neutrófilos transmigrou através da monocamada endotelial através da junção célula-célula que foram marcadas com os anticorpos dirigidos contra PECAM-1 e VE-caderina. Durante o processo de diapedese, a distribuição da VE-caderina e PECAM-1 foi seguida em tempo real (Figura 3B). Nos locais de neutrófilos diapedese, VE-caderina foi interrompida localmente e PECAM-1 mostrou uma estrutura mais em forma de anel. Depois de se completar a diapedese, as junções estreitas e VE-caderina e PECAM-1 claramente realocados nos locais de diapedese (Figura 3C). Note-se que as partes do anticorpo anti-PECAM-1 foram detectados na superfície de neutrófilos quando os neutrófilos atingiram o lado baso-lateral do endotélio. No entanto, isso não impediu que os neutrófilos de atravessar o endotélio. As dinâmicas observadas de VE-caderina em tempo real durante a migração de neutrófilos transendotelial estavam de acordo com o trabalho de Shaw e colegas quemostrou, através de microscopia confocal e VE-caderina-GFP-transfectadas células endoteliais, que VE-caderina-GFP difundida lateralmente quando leucócitos cruzou as junções célula-célula endotelial 14. Trabalhar também por Su e colaboradores ressaltaram as nossas observações de PECAM-1. Eles mostraram que, ao lado de lateral do VE-caderina difusão sobre passagem de leucócitos, PECAM-1 foi redistribuído localmente em um anel em torno dos neutrófilos transmigrando 15. <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> Figura 1 Na câmara de fluxo in vitro. (A) A seta indica o reservatório a partir do qual o meio necessita de ser actualizada. (B) tubo de silicone que liga a câmara de fluxo com o in-line porta de injeção Luer usado para injetar PMNs sem desconectar o tubo (seta). (C) Connexão de um fluxo-câmara vazia para o frasco reservatório enchido com 37 ° C, o fluxo de tampão (ponta de seta). (D) de ligação da câmara de fluxo com as HUVEC tratadas com TNF-α para o tubo de fluxo contendo tampão e colocada na platina do microscópio (ponta de seta). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 VE-caderina anticorpos não interferem na dinâmica ou função juncional. (A) monocamada de células endoteliais impedância é medida usando ECIS. Eixo Y expressa impedância em Ohms e o eixo x representa o tempo em horas. VE-caderina de murganho, clone 55-7H1, marcado com ALEXA647 (linha azul) ou IgG de controlo isotipo-ALEXA647 (linha vermelha) não alteram impedância monocamada de células endoteliais, enquanto que a VE-caderina de bloqueio CL75 anticorpo (linha preta) fez reduzir a impedância . (B </strong&gt;) VE-caderina-GFP foi expressa em HUVEC e análise FRAP usando microscopia confocal revelou nenhuma mudança na recuperação de fluorescência na presença ou ausência da VE-caderina 55-7H1 anticorpo. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. VE-caderina e PECAM-1 de distribuição durante TEM neutrófilos em tempo real. (A) Neutrófilos (marcada com linha branca) aderindo sobre o endotélio e atravessando a junção célula-célula, sem afectar a distribuição de VE-caderina e PECAM -1. (B) de Neutrófilos de atravessar a monocamada endotelial através da junção célula-célula. Uma dispersão de locais de VE-caderina e PECAM-1 podem ser observadas quando um neutrófilo sobressai através da junção célula-célula. A linha branca ilustra a presença de neutrófilos ainda na parte superior do endotélio. Linha amarela mostra tha membrana de neutrófilost já está debaixo de endotélio. (C) de neutrófilos foi totalmente cruzou a monocamada endotelial. VE-caderina e PECAM-1 são realocados em locais de diapedese. Linha amarela ilustra fronteiras do neutrófilo transmigrou. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração.

Imagens em tempo real de endoteliais junções célula-célula durante Neutrophil Transmigração Sob Fisiológica Fluxo

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

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Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K visualizações.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  Os leucócitos atravessam a monocamada endotelial utilizando o paracelular ou o percurso intracelular. Foi desenvolvido um ensaio simples para seguir a distribuição de juncional endógeno VE-caderina e PECAM-1 durante a migração transendotelial de leucócitos sob fluxo fisiológico para discriminar entre as duas vias de transmigração. 

Vídeo: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Em tempo real de imagens de leucotrienos B 4 Migração mediada por células e BLT1 Interações com β-arrestina

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

Imunologia e Infecção

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Isolamento de Células endoteliais da veia umbilical humana e sua utilização no estudo de transmigração de Neutrófilos sob condições de fluxo

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Detecção de MicroRNAs em Microglia por PCR em tempo real no SNC normal e durante Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

Em tempo real de imagens ao vivo de células T Sinalização de Formação de Complexos

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Imagens em tempo real de heterotípica plaquetas neutrófilos Interações sobre o endotélio ativado durante a inflamação vascular e formação de trombos em camundongos vivos

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Quantitativo<em&gt; In vitro</em&gt; Ensaio medir a adesão de neutrófilos ativados primárias células humanas endoteliais microvasculares em condições estáticas

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

Fluxo de Neutrófilos Humanos Secção Ensaio de Adesão

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Imagens em tempo real de células mielóides em Dynamics<em&gt; Apc<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Intestinal Tumores girando Disk microscopia confocal

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Imagem em tempo real e quantificação de fungos biofilme desenvolvimento usando um sistema bifásico de fluxo de recirculação

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...