The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

好中球は、インフォームドコンセントに署名した人の健康なボランティアから単離した。研究が人類の福祉のための制度や国のガイドラインを遵守して行われている。 ヒト臍帯静脈内皮細胞の1めっきとメンテナンス<ol><li>製造業者の指示に従って培養ヒト臍帯静脈内皮細胞（HUVECを）。フィブロネクチン上のHUVECを育てる（FN）がメディアを使用して（脱イオン水に溶解した10μg/ mlの）料理がコーティングされ（内皮増殖培地（EGM-2）singlequotsを加えた内皮基本培地（EBM-2）培地）。実験のために4-8の通路の間に細胞培養を使用してください。 </li><li> 1日目：37℃で少なくとも2時間、5％CO 2のためにフィブロネクチンを100μl（PBS中10μg/ ml）を有するコート、フローチャンバー。 </li><li> 2日目：細胞を、80〜90％コンフルエンスに達し、RTリン酸緩衝生理食塩水（で慎重に洗浄した後、細胞をトリプシン処理PBS）pH7.4のメディアを使用して、800,000細胞/ mlで800×gで遠心分離し、再懸濁。プレートFNでコーティングされたフローチャンバーのすべての単一のチャネル80,000細胞、ゆっくり上下細胞懸濁液をピペット。 37℃のインキュベーター中、5％CO 2で培養O / N。 </li><li> 3日目：優しく45°の角度でスライドを傾けてフローチャンバースライドでメディアを更新します。 （ 図1Aを参照）。 メモ：のみ貯水池ではなく、チャネル自体のメディアを削除することを推奨します。チャンネル内のメディアの除去が原因ペッティングによって引き起こされるメディアのドラッグ力に内皮細胞の損失と死に至ることがある。 </li><li>内皮細胞単層（ すなわち、100％コンフルエント）を形成した場合、位相差顕微鏡により確認してください。細胞が100％コンフルエントでない場合、彼らは100％のコンフルエンスに達するまで、メディアを2回日を変更する。 </li><li>細胞がコンフルエントに達したら、培地で細胞を刺激する（ステップを参照1.1）炎症性メディエーター（TNF-α（10 ngの個/ ml）を含有する）。 、内皮の炎症性表現型をTNF-αの結果とHUVECをO / N（ すなわち、12時間）刺激すなわち 、アップレギュレーションなどのICAM-1およびVCAM-1の13のような細胞接着分子。 </li></ol>パーコール勾配を使用した2。多形核白血球の単離<ol><li>多形核白血球（PMN）を単離する前に：（フローバッファー以下と呼ばれる）、N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N&#39;-2-エタンスルホン酸（HEPES）を調製-buffer。フローバッファを単離したPMN及びフローアッセイにおけるバッファとしての洗浄に使用される。フローバッファを準備するには：7.72グラムのNaCl（132 mM）を、4.76グラムのHEPES（20 mM）を、0.45グラムのKCl（6 mM）を、0.25グラムの硫酸マグネシウム•7H 2 O（1 mM）を、K 2 HPO 4•3Hを希釈脱イオン水1L中2 O（1.2ミリモル）と（この在庫が数週間、4℃で保持することができる）pH7.4に調整します。 </li><li>新鮮な100μlの1Mの塩化カルシウム＆＃を追加します。160;が​​200g / Lのストック濃度から（1 mM）を2.5 mlのヒトアルブミン（0.5％v / v）およびフロー緩衝液100ml（w / vの0.1％）、0.1グラムのグルコース。次に、0.45μmのフィルターを用いて、フローのバッファをフィルタリングします。注：このフローバッファは、すべての実験のために新たに調製する必要があります。 </li><li> PMNの単離の前に、10％のクエン酸三ナトリウム（TNC）PBS、pH7.4中の溶液を調製。 </li><li>健康なボランティアからのナトリウムヘパリンのvacuettes全血を20mlを収集します。パーコールの12.5ミリリットル（1.130グラム/ mlの密度で、水中の23％（w / w）のコロイド溶液）の上に慎重に、血液を希釈して50mlチューブとピペット20mlの10％PBS / TNCで1：全血の1に希釈新しい50mlチューブ中。慎重に遠心機でチューブを配置し、低加速し、RTで設定されていないブレークで800×gで20分間スピン。 注：パーコールに希釈した血液を追加する場合は、45度の角度でパーコール含有チューブを傾け、静かにチューブのウィットに希釈血液をピペットH最も遅いピペット男の子の設定。 </li><li>すべての液体を除去し、続いて500ミリリットルに氷冷した赤血球溶解バッファー（4.15グラムのNH 4 Clを[0.155 M]、0.5gのKHCO 3 [0.01 M]及び18.5ミリグラムEDTA（三重III）[0.1 mm]としたチューブを埋める赤血球を溶解するための氷冷H 2 O）である。サスペンションが有効になって休憩して、4℃で5分間の遠心分離500×gで、続いて暗赤色に変わるまで、時折転倒、氷上でチューブのままにしておきます。 注：ペレット画分を一​​緒に赤血球とのPMN（好中球、好酸球、好塩基球）が含まれています。 </li><li>上清を除去し、4℃で5分間500×gで氷冷溶解 - 緩衝液中で2回ペレットを洗浄。 </li><li> RTで流れバッファーでペレットを再懸濁し、血球計または自動細胞カウンターのいずれかを使用してPMNの濃度を決定する。 1×10 6細胞/ mlで、フローバッファ内のPMNをサスペンドし、室温で保管してください。 </li></ol>内皮ジャンクショ​​ンの3ラベリングアルは、VE-カドヘリンおよびPECAM-1 <ol><li> 1でPECAMアレクサフルオロ647抗体（クローンWM59）を追加します。1:50希釈HUVECに、培地で100倍希釈し、カルシウム非依存VE-カドヘリン-FITC抗体（クローン55-7H1）、（ステップ1.1参照）前生理的流れの条件下で好中球遊走の間に内皮細胞の接合動態を可視化するために、フロー実験を開始する30分間インキュベートする。 注：フローチャンバーに直接標識抗体を追加する前に、各チャネルのボリュームは100μLを超えていないことを確認してください。これは、可能な限り低い抗体費を維持するのに役立ちます。 </li></ol> 4 PMN TEMアッセイで流動<ol><li>前のフローシステムにそれらを注入する37℃で15分間水浴中にPMNを配置してください。 </li><li>目を設定する際の気泡の形成を防止する（ステップ4.3参照）、空のフローチャンバーにチューブを接続し、暖かいでいっぱいに（ 例えば、37℃）、フローバッファ電子フローシステム。 </li><li> 20ミリリットルの注射器を含むシリコーンチューブを使用して、シリンジポンプフローシステムに空のフローチャンバーの一方の側を接続し、顕微鏡のステージへの流れチャンバを置く。 </li><li> 37°Cフロー緩衝液（ 図1B）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバの反対側を接続し、フローバッファーですべてのチューブを充填するために、シリンジポンプを起動する。ポンプは、注射器に流動室を通ってリザーバから流れバッファを引っ張ってくる。注：このチューブはまた、PMNの流れを停止させ、気泡を作成せずに実行している実験に針を注入することを可能にする、インラインルアー注入ポートが含まれています。 </li><li>フローチャンバーを含むTNF-αで処理したHUVECを持つ空のフローチャンバーを交換し、フローバッファーを含むチューブを接続し、顕微鏡ステージ（ 図1C）に置きます。切断して再接続する前に、チューブを切っピンチピンチオフしないように、HUVECを含有するチャンバーmは、チューブおよび/またはフローチャンバ内の気泡の形成をもたらすことができる。 </li><li>ポスト毛細管細静脈において生理的流れ速度に応じて、1ダイン/ cm 2の流速を調整する（1-5ダイン/ cm 2）であった。 </li><li>レコード微分干渉コントラスト（DIC）、FITC（488nmの）およびアレクサフルオロ647（647 nm）を同時に共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて。 </li><li> 1ミリリットルの注射器を使用して、インラインルアー注入口（ 図1D） を介して 、フローシステム内にゆっくりのPMN（ステップ4.1）を注入する。 </li><li>数分後、白血球が付着現れ、転生。フローチャンバー内にフローチャンバー及びピペッティング固定液（PBS中3.7％ホルムアルデヒド）からチューブを外して、任意の瞬間に実験を停止します。 10分間の固定を可能にし、PBSで洗浄した。データは、（材料および機器の表を参照）画像ソフトウェアを用いて分析される。 NOTE：37°C、5％CO 2の恒温及び63X油を目的とした人工気象室を備えた共焦点レーザー走査顕微鏡を用いて彼の実験を実行する。 </li></ol>

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H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

このプロトコルについては、これは、細胞アポトーシスおよび破壊単層をもたらすので、フローチャンバー内の気泡の形成を防止することが重要である。これを避けるために、私たちは、チューブをフローチャンバーに接続されている手順4.2および4.5、特に関心を払うように強調したい。プロトコルにおけるもう一つの重要なステップは、前のフローチャンバー（ステップ4.1）にそれらを注入する、37℃で15〜30分間、それらをインキュベートすることにより、室温に保たれているPMNのプライミングである。これは、彼らがそのような内皮でのICAM-1またはVCAM-1などの接着分子に付着させ、白血球インテグリンのプライミングになる。 このプロトコルは、好中球の遊走を研​​究するために限定されるものではない。また、単球またはリンパ球のような他の白血球の型を使用することができる。そのステップ4.1に注意して、 すなわち、白血球をプライミングすると、白血球の型の間で異なる場合があります。また、内皮細胞の他のタイプを使用することができる。このためには、臨界のままで例えば、TNF-αまたはIL-1βのような適切な炎症性刺激による内皮細胞を刺激する。好中球遊出に応答しない場合、人はN-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン（fMLPの）ペプチド16での好中球の短時間（5分）の治療を検討してもよい。これは内皮に付着し、それらをより受けやすいこと、さらに、それらのインテグリン、特に、好中球を刺激する。 典型的には、1ダイン/ cm 2の流速が用いられる。この流速は、後毛細血管細静脈、大部分の白血球経内皮遊走17を発生する部位で測定される。説明したフローチャンバーを使用して、10ダイン/ cm 2の流速を高めることができる。しかし、さらに剪断力を高めるためにはお勧めしません。これは、フローチャンバーからの細胞のチューブと剥離の不要な漏れの原因となります。 図3に記載した結果は、これらのことを示している抗体を視覚化し、白血球血管外遊出の際に、内皮細胞間結合の動力学を研究するために使用することができる。具体的には、既存のトランスマイグレーションアッセイに加えて、このプロトコルは、リアルタイムでの生理的な流れの条件の下で経移行から傍細胞を識別することができます。抗体は細胞間結合を染色するので、人は/ PECAM-1のサイトカドヘリンVE非正対VE-カドヘリン/ PECAM-1陽性接合を横切る白血球数を獲得することができます。このように、細胞間移行が傍細胞遊走識別することができる。 これは、これらの抗体は、それらが結合するタンパク質の機能を妨害しないことを強調することが重要である：本研究で使用PECAM-1抗体は、第二の細胞外ドメインに対して向けられる。抗体は、少なくともなかったことを示唆して拡散または単分子層を形成する際の欠陥を示さなかった抗体の存在下で播種した内皮細胞は、内皮細胞間同型相互作用を妨害。それに加えて、両方の抗体は、内皮単層を通って移動する好中球の能力を損なわない。さらに、抗体の非存在下または存在下で内皮単層を横切って遊出する好中球の数は変化しない（データは示さず）。重要なことは、共焦点レーザー走査顕微鏡は私たちに、同時に異なる蛍光チャネルおよびDICを記録する可能性を与えます。 好中球は、内皮細胞間の接合部を横断し、白血球が経細胞に対する他の、 すなわち、傍細胞上の1つの経路を選択する理由を理解するのに役立ちますときこのように、このアッセイは、同時に、VE-カドヘリンおよびPECAM-1のダイナミクスを研究することができます。

効率的かつ厳密に制御された白血球経内皮遊走（TEM）は、免疫監視および急性炎症などの生理学的プロセスに極めて重要である。しかし、特定の病態生理学的条件の下で、制御されない過度のTEMは、慢性炎症性疾患（ 例えば、関節リウマチ、アテローム性動脈硬化症、喘息）、その結果が観察される。また、腫瘍細胞の転移の間に、経内皮移動の過程は、腫瘍細胞が1-3転移する循環を残すための器械である。具体的には、過剰な白血球または腫瘍細胞TEMを妨害するために、このプロセスの調節の詳細な理解が必要とされる。 これは、TEMプロセスは、異なる工程を経て生じると考えられる。ブッチャーとスプリンガーによって20年前にレビュー精液の研究では、TEM 4,5の処理を説明する多段階モデルにつながった。このモデルは、まだいくつかの広告が、当てはまるditionalの手順は、6が含まれています。アロンらは、内皮7の表面上に固定化されたケモカインの存在の必要性を説明した。最近では、それらは内皮自体が内皮頂端面8に提示されたケモカインを生成することを示した。また、同じグループは、TEM 7時の流れの状態の重要性を提唱。最近、2つの異なるルート白血球に焦点を当てたいくつかの出版物は、TEMの最終漏出段階で取ることができます。彼らは、すなわち 、細胞-細胞間結合を通じて傍細胞移動ルートを行くか、経細胞移動ルート9として知られている内皮細胞体を介して交差することができます。カーマンらは詳細にこれらの経路を研究し、臍帯静脈内皮単層10を横断するときに白血球が優先的に経細胞経路（10％）以上の傍細胞移動ルート（90％）を選択することを結論した。しかし、他の起源からの内皮細胞を用いた場合、 例えば、脳または微小血管系、より白血球は経細胞経路（30％）の11を使用した。 Vestweberグループは、最近、内因性の交換、細胞-細胞間結合は、ノックイン動物モデルを使用して、互いから解離することができなかったときことを示したVE-カドヘリン、VE-カドヘリン、α-カテニンキメラのために、白血球のTEMは、完全に12を遮断した。驚くべきことに、著者は、TEMは、いくつかのすべてではなく、組織において、ブロックされたことに気づいた。全体的に、これらのエレガントな実験は、この決定をトリガー調節シグナルは依然として不明であるが、白血球は、経細胞経路での傍細胞経路を優先することを示した。 白血球の大部分が傍細胞移動ルートを好むにもかかわらず、それは両方の経路を区別することは困難である。それに加えて、いくつかの研究にもかかわらず、内皮細胞 - 細胞JUNCTの役割に焦点を当てイオンは、これらの接合部の力学は、特に接合部のタンパク質は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1、白血球の交差が論争中である時に。私たちは、これら接合分子は蛍光標識された抗体を用いて、生理的流れの条件下で、白血球の血管外遊出中にリアルタイムで監視することができる比較的簡単なアッセイを開発した。これらの抗体は、妨害または標的とするタンパク質の接合部の完全性や移動性を阻害しなかった。このアッセイは、私たちは、傍細胞TEMの過程接合部タンパク質の動態を追跡することができます。さらに、このアッセイはまた、パラ及び経細胞移動ルートとの間の識別を可能にする。

<table><tbody><tr><td>&amp;mu;-Slide VI</td><td>IBIDI</td><td>80606</td><td>Flow-chamber</td></tr><tr><td>0.45 &amp;mu;m filter&amp;nbsp;</td><td>Whatman/GE Lifesciences</td><td>10462100</td><td></td></tr><tr><td>1 ml Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>20 ml Syringe&amp;nbsp;</td><td>BD Discardit II</td><td>366296</td><td></td></tr><tr><td>21 G Needle&amp;nbsp;</td><td>BD Microlance</td><td>301155</td><td></td></tr><tr><td>Albumin&amp;nbsp;</td><td>Sanquin</td><td>15522644</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium chloride (NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl)</td><td>Merck</td><td>1009245000</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride (CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>449709</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &amp;amp; Growth Factors</td><td>Lonza</td><td>CC-3156 + CC-4176</td><td>media</td></tr><tr><td>EDTA (Titriplex III)</td><td>Merck</td><td>1370041000</td><td></td></tr><tr><td>Falcon tubes&amp;nbsp;</td><td>Corning Life Sciences</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1141-2MG</td><td>FN</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>In-line Luer injection port&amp;nbsp;</td><td>IBIDI</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>PECAM-1-ALEXA-647&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>561654</td><td>clone WM59</td></tr><tr><td>Percoll&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-09</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline</td><td>Fresenius Kabi&amp;nbsp; Nederland</td><td>M090001/01NL</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Potassium chloride (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Potassium hydrogen carbonate (KHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;)</td><td>Merck</td><td>1048540500</td><td></td></tr><tr><td>Potassium phosphate dibasic trihydrate (K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5504</td><td></td></tr><tr><td>Silicone Tygon 3350 tubing</td><td>VWR</td><td>228-4331</td><td>tubing</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>Calbiochem (Millipore)</td><td>567441</td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump&amp;nbsp;</td><td>Harvard Apparatus</td><td>model number 55-5920</td><td></td></tr><tr><td>TNF-&amp;alpha;&amp;nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td>tumor necrosis factor</td></tr><tr><td>Trisodium citrate&amp;nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.06447.5000</td><td>TNC</td></tr><tr><td>Vacuettes</td><td>Greiner, Germany</td><td>980044</td><td></td></tr><tr><td>VE-Cadherin-FITC&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen</td><td>560411</td><td>clone 55-7H1</td></tr><tr><td>Zeiss LSM510 META&amp;nbsp;</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zen Software 2008</td><td>Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

炎症時には、白血球が循環を離れ、下にある組織に侵入する病原体と戦うために内皮を横切る。このプロセスは、白血球の経内皮遊走として知られている。内皮単層を横切る白血球のための2つのルートが記載されている： すなわち 、細胞-細胞間結合および経細胞経路を介して傍細胞経路、 すなわち、内皮細胞体を介し。しかし、パラ - 及び経細胞経路を区別することは技術的に困難であった。私たちは、生理的な流れの条件の下で好中球経内皮移動中およびPECAM-1-カドヘリン、VE内因性の分布を調べるための簡単なin vitroアッセイを開発しました。好中球灌流の前に、内皮細胞は、短時間VE-カドヘリンおよびPECAM-1に対する蛍光標識抗体で処理した。電気細胞substraによって決定したように、これらの抗体は、両方のタンパク質の機能を妨害しなかったTEインピーダンス検出およびFRAP測定。このアッセイを用いて、流動条件下で経内皮移動中およびPECAM-1 VEカドヘリンと内皮を通過する白血球のパラ - 及び経細胞遊走のルートを区別し、内因性の分布に従うことができました。

抗体は、内皮のバリア機能を妨害しなかった場合には、まず試験した。私たちは、電気細胞 - 基質インピーダンスセンシング（ECIS）を使用して、内皮単層の抵抗を測定した。詳細については、ヴァンBuul らを参照してください。抗VE-カドヘリン蛍光標識抗体は細胞（ 図2A）に添加した場合の抵抗13全く変化が見られなかった。 VE-カドヘリン機能をブロックすることが十分に認識されている抗VE-カドヘリン抗体は、抵抗を劇的（ 図2A）を減少させた。また、のダイナミクスを変化させないイメージングのために使用される抗体は、VE-カドヘリンの光退色（FRAP）後の蛍光回復を測定することによって評価したように（ 図2B）カドヘリン-GFPをVE。 1-2分後、好中球はDICチャンネル（ 図3A）で可視化することができるように活性化内皮単層に付着した。 5-30 SEのクロール後、C、好中球の大半はPECAM-1に対する抗体で標識し、VE-カドヘリンをした細胞間結合を介して内皮単層を通って遊出。漏出の過程の分布は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、リアルタイム（ 図3B）に従った。好中球の血管外遊出の部位に、VE-カドヘリンが局所的に破壊し、PECAM-1以上のリング状の構造を示した。漏出が完了した後、閉じて、接合部は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1は明らかに漏出部位（ 図3C）に移転しました。好中球は、内皮のBASO-側面に到達したら、抗PECAM-1抗体の部分が好中球の表面上で検出されたことに注意してください。しかし、これは内皮を横切るから好中球を防ぐことはできませんでした。の観察されたダイナミクスは、好中球経内皮移動中にリアルタイムでカドヘリンをVEショウらが仕事と一致した共焦点顕微鏡を用いて、示し、VE-カドヘリン-GFP-トランスフェクトVE-カドヘリン-GFPは、白血球が内皮細胞間結合14を横切った際に横方向拡散内皮細胞を、。また蘇によって動作し、共同研究者は、PECAM-1の私たちの観察を強調した。彼らは次の横方向への白血球の通過時に拡散カドヘリンVEは、ことを示した、PECAM-1はローカルに転生好中球15の周りにリングに再配布されました。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> 体外フローチャンバーで 、図1（A）の矢印は、媒体を更新する必要がある、そこからリザーバを示している。 （B）チューブ（矢印）を切断することなくPMNのを注入するために用いたインラインルアー注入ポートとフローチャンバーを接続するシリコンチューブ。 （C）コーン37°Cフローバッファー（矢頭）で満たされたリザーバフラスコに空のフローチャンバーのと接続。 （D）フローバッファーを含むチューブに、TNF-αで処理したHUVECを有するフロー· ​​チャンバーの接続および顕微鏡ステージ（矢頭）に入れた。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> 図2は、VE-カドヘリン接合ダイナミクスまたは機能を妨害しない抗体。（A）内皮細胞単層のインピーダンスは、ECISを用いて測定される。 Y軸は、オームにインピーダンスを表し、x軸は、時間単位の時間を表す。インクルード抗体CL75（黒線）をブロックカドヘリン、VEのに対し、Alexa647の（青線）またはアイソタイプのIgG-Alexa647の制御で標識された抗体クローン55-7H1、（赤線）は、内皮細胞単層インピーダンスを変化させないカドヘリンは、VEのインピーダンスを減少させた。 （B </stro&gt;）、共焦点顕微鏡を用いてHUVECおよびFRAP分析において発現させたカドヘリン-GFPはVE ngのは、VE-カドヘリン55-7H1抗体の存在下または非存在下で蛍光回復の変化を示さなかった。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> 図3は、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の分布をリアルタイムで好中球のTEM中に（A）好中球が内皮に付着したとの分布に影響を与えることなく、細胞間の接合部を横切る（白線でマーク）VE-カドヘリンおよびPECAM -1。 （B）好中球は、細胞-細胞間結合を介して内皮単層を横切る。好中球は、細胞 - 細胞接合部を通って突出するとき、VE-カドヘリンおよびPECAM-1の局所分散を観察することができる。白線は内皮の上にまだ好中球の存在感を示している。黄色の線は、好中球膜THAを示していますtは内皮の下に既にある。 （C）好中球が完全に内皮単層を超えました。 VE-カドヘリンおよびPECAM-1は、漏出部位に再配置されます。黄色のラインが遊出し、好中球の境界を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

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Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

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19.5K ビュー.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam. 白血球は、傍細胞または経細胞経路を用いて内皮単層を横切る。私たちは、内因性の接合部の分布がVE-カドヘリンおよびPECAM-1を白血球経内皮移行中に生理的な流れの下2移住ルートを区別するために従うように、単純なアッセイを開発した。 

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

フローの状況下で好中球移住研究におけるヒト臍帯静脈内皮細胞とそれらの使用の分離

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

An Endothelial Planar Cell Model for Imaging Immunological Synapse Dynamics

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological synapses&#39;. Within these intimate cell-cell interfaces discrete sub-cellular clusters of MHC/Ag-TCR, F-actin, adhesion and signaling molecules form and remodel rapidly. These dynamics are thought to be critical determinants of both the efficiency and quality of the immune responses that develop and therefore of protective versus pathologic immunity. Current understanding of immunological synapses with physiologic APCs is limited by the inadequacy of the obtainable imaging resolution. Though artificial substrate models (e.g., planar lipid bilayers) offer excellent resolution and have been extremely valuable tools, they are inherently non-physiologic and oversimplified. Vascular and lymphatic endothelial cells have emerged as an important peripheral tissue (or stromal) compartment of &#39;semi-professional APCs&#39;. These APCs (which express most of the molecular machinery of professional APCs) have the unique feature of forming virtually planar cell surface and are readily transfectable (e.g., with fluorescent protein reporters). Herein a basic approach to implement endothelial cells as a novel and physiologic &#39;planar cellular APC model&#39; for improved imaging and interrogation of fundamental antigenic signaling processes will be described.

Adaptive immunity is controlled by dynamic 'immunological synapses' formed between T cells and antigen presenting cells. This protocol describes methods for investigating endothelial cells both as understudied physiologic APCs and as a novel type of 'planar cellular APC model'.

イメージング免疫学的シナプスダイナミクス内皮平面内細胞モデル

Adaptive immunity is regulated by dynamic interactions between T cells and antigen presenting cells (&#39;APCs&#39;) referred to as &#39;immunological ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Study of the Actin Cytoskeleton in Live Endothelial Cells Expressing GFP-Actin

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial cells regulate permeability of the endothelium, and many studies have indicated the important contribution of the actin cytoskeleton to determining junctional integrity1-5. A cortical actin belt is thought to be important for the maintenance of stable junctions1, 2, 4, 5. In contrast, actin stress fibers are thought to generate centripetal tension within endothelial cells that weakens junctions2-5. Much of this theory has been based on studies in which endothelial cells are treated with inflammatory mediators known to increase endothelial permeability, and then fixing the cells and labeling F-actin for microscopic observation. However, these studies provide a very limited understanding of the role of the actin cytoskeleton because images of fixed cells provide only snapshots in time with no information about the dynamics of actin structures5. 
Live-cell imaging allows incorporation of the dynamic nature of the actin cytoskeleton into the studies of the mechanisms determining endothelial barrier integrity. A major advantage of this method is that the impact of various inflammatory stimuli on actin structures in endothelial cells can be assessed in the same set of living cells before and after treatment, removing potential bias that may occur when observing fixed specimens. Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are transfected with a GFP-&beta;-actin plasmid and grown to confluence on glass coverslips. Time-lapse images of GFP-actin in confluent HUVEC are captured before and after the addition of inflammatory mediators that elicit time-dependent changes in endothelial barrier integrity. These studies enable visual observation of the fluid sequence of changes in the actin cytoskeleton that contribute to endothelial barrier disruption and restoration. 
Our results consistently show local, actin-rich lamellipodia formation and turnover in endothelial cells. The formation and movement of actin stress fibers can also be observed. An analysis of the frequency of formation and turnover of the local lamellipodia, before and after treatment with inflammatory stimuli can be documented by kymograph analyses. These studies provide important information on the dynamic nature of the actin cytoskeleton in endothelial cells that can used to discover previously unidentified molecular mechanisms important for the maintenance of endothelial barrier integrity.

Microscopic imaging of live endothelial cells expressing GFP-actin allows characterization of dynamic changes in cytoskeletal structures. Unlike techniques that use fixed specimens, this method provides a detailed assessment of temporal changes in the actin cytoskeleton in the same cells before, during, and after various physical, pharmacological, or inflammatory stimuli.

GFP -アクチンを発現するライブ内皮細胞におけるアクチン細胞骨格の研究

The microvascular endothelium plays an important role as a selectively permeable barrier to fluids and solutes. The adhesive junctions between endothelial ...

生物学

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

A Microphysiological System to Study Leukocyte-Endothelial Cell Interaction during Inflammation

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of activated leukocytes across the vascular endothelium into key organs can lead to organ failure. A physiologically relevant biomimetic microfluidic assay (bMFA) has been developed and validated using several experimental and computational techniques, which can reproduce the entire leukocyte rolling/adhesion/migration cascade to study leukocyte-endothelial cell interactions. Microvascular networks obtained from in vivo images in rodents were digitized using a Geographic Information System (GIS) approach and microfabricated with polydimethylsiloxane (PDMS) on a microscope slide. To study the effect of shear rate and vascular topology on leukocyte-endothelial cell interactions, a Computational Fluid Dynamics (CFD) model was developed to generate a corresponding map of shear rates and velocities throughout the network. The bMFA enables the quantification of leukocyte-endothelial cells interactions, including rolling velocity, number of adhered leukocytes in response to different shear rates, number of migrated leukocytes, endothelial cell permeability, adhesion molecule expression and other important variables. Furthermore, by using human-related samples, such as human endothelial cells and leukocytes, bMFA provides a tool for rapid screening of potential therapeutics to increase their clinical translatability.

In this protocol, a biomimetic microfluid assay, which can reproduce a physiologically relevant microvascular environment and reproduce the entire leukocyte adhesion/migration cascade, is employed to study leukocyte-endothelial cell interactions in inflammatory disease.

炎症時の白血球-内皮細胞相互作用を研究するための微生理学的システム

Leukocyte-endothelial cell interactions play an important role in inflammatory diseases such as sepsis. During inflammation, excessive migration of ...