The authors thank Dr. P.L. Hordijk for critically reading the manuscript. AED is supported by a Landsteiner Foundation for Blood Transfusion Research (LSBR) fellowship (grant #1028). JK is supported by the Dutch Heart Foundation (2005T3901). JDvB is a NHS Dekker fellow (grant #2005T039).

Nötrofiller bir bilgilendirilmiş onam imzaladı sağlıklı gönüllülerden izole edilmiştir. Araştırma, insan refahı için kurumsal ve ulusal rehberlere uygun olarak gerçekleştirilmiştir. 1. Kaplama ve İnsan Göbek Daman Endotel Hücrelerinde bakımı <ol><li> Üreticinin talimatlarına göre Kültürü İnsan Umbilikal Ven Endotelyal Hücrelerinde (HUVECler). Fıbronektin üzerinde büyümeye HUVECler (FN) ortam kullanılarak (demineralize su içinde çözülmüş 10 mg / ml) yemekler -kaplı (Endotel Büyüme Ortamı (EGM-2) ile takviye edilmiş endotel singlequots Bazal Ortam (EBM-2) ortamı). Deneyler için 4-8 geçişleri arasında hücre kültür kullanın. </li><li> Gün 1: 37 ° C&#39;de en az 2 saat boyunca 100 ul fibronektin (PBS içinde 10 ug / ml) ve% 5 CO2 ile kaplayın akış odaları. </li><li> 2. Gün: hücreleri% 80-90 ulaştığında, OS fosfat tamponlu tuzlu su ile yıkandıktan sonra dikkatli Hücreleri tripsinize edin (pBS), pH 7.4, medyayı kullanarak 800.000 hücre / ml 800 xg santrifüj ve tekrar süspansiyon. Plaka 80000 FN-kaplanmış akış odalarından her kanal için hücreler yavaşça yukarı ve aşağı hücre süspansiyonu pipetle. Bir 37 ° C&#39;de inkübatör ve% 5 CO2 içinde kültür göre O / N. </li><li> 3. Gün: yavaşça 45 ° açıyla slayt eğerek akış slaytı medyayı yenileyin. (Şekil 1A bakınız). NOT: Sadece rezervuarlarda değil kanalında kendisi ortamı kaldırmak için tavsiye edilir. Kanallardaki ortam çıkarılması nedeniyle pipetleme neden ortamın sürükleme kuvveti endotel hücre kaybına ve ölüme yol açabilir. </li><li> Endotel hücreler, bir tek tabaka (yani,% 100 ortak akışlı) meydana varsa faz kontrast mikroskobu ile kontrol edin. Hücreler% 100 birleşik değilse onlar% 100 izdiham ulaşana kadar, bir gün Ortamı iki kez değiştirin. </li><li> Hücrelerin birleşik hale gelmesinden sonra, (yukandaki adım ortam ile hücrelerini uyarır1.1), iltihabi aracı madde (TNF-α (10 ng / ml) ihtiva etmektedir). , Endotel iltihabik bir fenotipe, TNF-α sonuçlarla HUVECler O / N (örneğin, 12 saat), yani teşvik., Üst-düzenlemenin, örneğin ICAM-1 ve VCAM-1 13 gibi hücre yapışma moleküllerinin. </li></ol> Perkol Degradeleri kullanma 2. Polimorfonükleer Lökosit izolasyonu <ol><li> Polimorfonükleer lökositler (PMN) izole önce N-2-hidroksietilpiperazin-N&#39;-2-etansülfonik asit (akış tamponu bundan sonra da adlandırılır) (HEPES) Tampon hazırlayın. Akış tamponu izole PMN yıkamak için kullanılır ve bu akış deneyinde tampon olarak. Akış tamponu hazırlamak için: 7.72 g NaCl (132 mM), 4.76 g HEPES (20 mM), 0.45 g KCl (6 mM), 0.25 gr MgSO 4 • 7H H2O (1 mM), K 2 HPO 4 • 3H seyreltik 2 O minerali giderilmiş su, 1 L (1.2 mM) ve (bu stok birkaç hafta boyunca 4 ° C de muhafaza edilebilir), pH 7.4 ayarlanır. </li><li> Taze 100 ul 1 M CaCl2 &amp; # ekle160 (1 mM), 2.5 mi, 200 g / L&#39;stok konsantrasyonu, 100 ml (0.5% h / h), ve 0.1 g glikoz, insan albümini (% 0.1 a / ​​h) akış tamponu. Daha sonra, bir 0.45 um filtre kullanılarak, akış tamponu filtre. NOT: Bu akış-tampon her bir deney için taze olarak hazırlanması gerekir. </li><li> Önceki PMN izolasyonu, PBS, pH 7.4 içinde% 10 trisodyum sitrat (TNC) solüsyon hazırlanır. </li><li> Sağlıklı bir gönüllüden sodyum heparin vacuettes tüm kanın 20 ml toplayın. 50 ml tüpler içinde% 10, PBS / TNC 1 ve pipet 20 mi ((gr / ml 1,130 bir yoğunluğu olan su içinde bir koloidal çözelti) bir a / a% 23) 12.5 ml Percoll üzerine dikkatli bir şekilde kan seyreltildi: Tam kan 1 seyreltin Yeni bir 50 ml tüp içinde. Dikkatlice santrifüj tüpleri ve 800, düşük bir ivme ile xg ve oda sıcaklığında belirlenen kırılma yok, 20 dakika boyunca dönerler. Not: Percoll seyreltilmiş kan eklerken, bir 45 ° açıda Percoll içeren tüp eğme ve yavaşça tüp wit seyreltilmiş kan pipetleh yavaş pipet çocuk ayarı. </li><li> Tüm sıvı çıkarın ve daha sonra, 500 ml buz soğukluğunda eritrosit lizis tamponu (4.15 g NH4CI [0.155 M], 0.5 gr 3 KHCO [0.01 M] ve 18.5 mg EDTA (üç katlı III) [0.1 mm] tüpün doldurulması ) buz soğukluğunda H2O eritrositleri lizise uğratmak üzere. Süspansiyon etkin sonları ile, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x santrifüj, ardından koyu kırmızı, olana kadar, bazen Tersine tüp, tüp buz üzerinde bırakın. Not: topak parçası eritrositleri ile birlikte PMN (nötrofiller, eozinofiller, bazofiller) içerir. </li><li> Süpernatantı ve 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 x g&#39;de, buz sıcaklığında lizis tamponu içinde iki kez yıkayın pelet. </li><li> RT&#39;de akış tamponu ile pelet ve hemositometer ya da otomatik hücre sayıcı kullanarak PMN konsantrasyonunu belirlemek. 1 x 10 6 hücre / ml akış tamponu içinde askıya alma PMN ve oda sıcaklığında tutun. </li></ol> Endotel Junction 3. EtiketlemeEl VE-kaderin ve PECAM-1 <ol><li> 1 de PECAM Alexa Fluor 647 antikoru (klon WM59) ekleyin: 1:50 seyreltme HUVEC kültür ortamı 100 seyreltme ile kalsiyuma bağlı VE-kaderin-FITC antikoru (klon 55-7H1), (adım 1.1) ve önceki fizyolojik akış koşulları altında nötrofil trans sırasında endotel hücre birleşim dinamiklerini görselleştirmek için akış deney başlamadan 30 dakika inkübe edilir. NOT: akış odalarına doğrudan etiketli antikorlar eklemeden önce, her bir kanal hacim 100 ul aşmamasını sağlamak. Bu, mümkün olduğunca düşük antikor giderleri tutmanıza yardımcı olur. </li></ol> 4. PMN Deney TEM altında Akış <ol><li> Önce akış sistem içine enjekte edilmesinden 37 ° C&#39;de 15 dakika boyunca bir su banyosu içine PMN yerleştirin. </li><li> Th kurarken boş bir akış odasına boru bağlayın ve oluşumunu engellemek için (örneğin, 37 ° C) akış tampon sıcak (bkz adım 4.3) ile doldurun hava-kabarcıklarE akış sistemi. </li><li> 20 ml&#39;lik bir şırınga ihtiva eden silikon tüp kullanılarak şırınga pompası akış sistemine boş bir akış odasının bir tarafında bağlayın ve mikroskop kademesine akış odasına koyun. </li><li> 37 ° C akış tamponu (Şekil 1B) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının diğer tarafını ve akış tamponu ile her borunun doldurmak için şırınga pompası başlar. Pompa şırıngaya akış bölmesi boyunca rezervuardan akış-tampon çeker. Not: Bu boru da akışının kesilmesi ve hava kabarcıkları oluşturmadan PMN çalışan bir deneye bir iğne ile enjekte edilmesi için izin veren bir hat-içi enjeksiyon ağzının luer içerir. </li><li> TNF-α-muamele edilmiş HUVECler içeren akış bölmesi ile boş akış bölmesi yerine, akış tamponu ihtiva eden boru bağlantı ve bir mikroskop kademesine (Şekil 1C) içine yerleştirin. Çıkarmadan ve tekrar bağlamadan önce tüplerini çimdikkapalı kısma değil, HUVECler içeren odalarına m boru ve / veya akış odası içinde hava kabarcıklarının oluşmasına neden olabilir. </li><li> Sonraki kılcal venüllerin fizyolojik akış hızına uygun olarak, 1 dyn / cm 2 akış hızını ayarlamak (1-5 din / cm 2). </li><li> Tutanak Diferansiyel Girişim Kontrast (DIC), FITC (488 nm) ve Alexa Fluor 647 (647 nm) aynı anda odaklı lazer tarama mikroskobu kullanılarak. </li><li> PMN 1 mi şırıngalar kullanılarak hat-içi luer enjeksiyon ağzından (Şekil 1D) ile yavaş yavaş akış sistemi (adım 4.1) enjekte edilir. </li><li> Bir kaç dakika sonra, lökositler yapışan ve göçmek, görünür. Akış odasına akış odasının ve pipetleme fiksatif (PBS içerisinde% 3.7 formaldehit) boruların sökülmesini tarafından arzu edilen herhangi bir an deney durdurun. 10 dakika boyunca tespit Veren, PBS ile yıkanması işlemi uygulanır. Veri görüntüleme yazılımı (malzeme ve ekipman tabloya bakınız) kullanılarak analiz edilmektedir. NOT: 37 ° C,% 5 CO2 olan bir sabit sıcaklığa sahip bir klima kabini ile teçhiz edilmiş bir odaklı lazer tarama mikroskopu ve 63X ile de deneme amaçlı yağ gerçekleştirin. </li></ol>

<ol>
	<li>Ross, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atherosclerosis--an+inflammatory+disease.">Atherosclerosis--an inflammatory disease.</a> N. Engl. J. Med. 340, 115-126 (1999).</li><li>Luster, A. D., Alon, R., von Andrian, U. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+migration+in+inflammation:+present+and+future+therapeutic+targets.">Immune cell migration in inflammation: present and future therapeutic targets.</a> Nat. Immunol. 6, 1182-1190 (2005).</li><li>Szekanecz, Z., Koch, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+involvement+in+rheumatic+diseases:+'+vascular+rheumatology.">Vascular involvement in rheumatic diseases: ' vascular rheumatology.</a> Arthritis Res. Ther. 10, 224 (2008).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67, 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76, 301-314 (1994).</li><li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat. Rev. Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Cinamon, G., Shinder, V., Shamri, R., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemoattractant+signals+and+beta+2+integrin+occupancy+at+apical+endothelial+contacts+combine+with+shear+stress+signals+to+promote+transendothelial+neutrophil+migration.">Chemoattractant signals and beta 2 integrin occupancy at apical endothelial contacts combine with shear stress signals to promote transendothelial neutrophil migration.</a> J. Immunol. 173, 7282-7291 (2004).</li><li>Shulman, Z., Cohen, S. J., Roediger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transendothelial+migration+of+lymphocytes+mediated+by+intraendothelial+vesicle+stores+rather+than+by+extracellular+chemokine+depots.">Transendothelial migration of lymphocytes mediated by intraendothelial vesicle stores rather than by extracellular chemokine depots.</a> Nat. Immunol. 13, 67-76 (2012).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trans-cellular+migration:+cell-cell+contacts+get+intimate.">Trans-cellular migration: cell-cell contacts get intimate.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 20, 533-540 (2008).</li><li>Carman, C. V., Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transmigratory+cup+in+leukocyte+diapedesis+both+through+individual+vascular+endothelial+cells+and+between+them.">A transmigratory cup in leukocyte diapedesis both through individual vascular endothelial cells and between them.</a> J. Cell Biol. 167, 377-388 (2004).</li><li>Millan, J., Hewlett, L., Glyn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+transcellular+migration+occurs+through+recruitment+of+endothelial+ICAM-1+to+caveola-+and+F-actin-rich+domains.">Lymphocyte transcellular migration occurs through recruitment of endothelial ICAM-1 to caveola- and F-actin-rich domains.</a> Nat. Cell Biol. 8, 113-123 (2006).</li><li>Schulte, D., Kuppers, V., Dartsch, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stabilizing+the+VE-cadherin-catenin+complex+blocks+leukocyte+extravasation+and+vascular+permeability.">Stabilizing the VE-cadherin-catenin complex blocks leukocyte extravasation and vascular permeability.</a> EMBO J. 30, 4157-4170 (2011).</li><li>Buul, J. D., Mul, F. P., van der Schoot, C. E., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICAM-3+activation+modulates+cell-cell+contacts+of+human+bone+marrow+endothelial+cells.">ICAM-3 activation modulates cell-cell contacts of human bone marrow endothelial cells.</a> J. Vasc. Res. 41, 28-37 (2004).</li><li>Shaw, S. K., Bamba, P. S., Perkins, B. N., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+vascular+endothelial-cadherin+during+leukocyte+transmigration+across+endothelium.">Real-time imaging of vascular endothelial-cadherin during leukocyte transmigration across endothelium.</a> J. Immunol. 167, 2323-2330 (2001).</li><li>Su, W. H., Chen, H., Jen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+movements+of+VE-cadherin+and+PECAM-1+during+transmigration+of+polymorphonuclear+leukocytes+through+human+umbilical+vein+endothelium.">Differential movements of VE-cadherin and PECAM-1 during transmigration of polymorphonuclear leukocytes through human umbilical vein endothelium.</a> Blood. 100, 3597-3603 (2002).</li><li>Paulsson, J. M., Jacobson, S. H., Lundahl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+activation+during+transmigration+in+vivo+and+in+vitro:+A+translational+study+using+the+skin+chamber+model.">Neutrophil activation during transmigration in vivo and in vitro: A translational study using the skin chamber model.</a> J. Immunol. Methods. 361, 82-88 (2010).</li><li>Williams, M. R., Azcutia, V., Newton, G., Alcaide, P., Luscinskas, F. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+mechanisms+of+neutrophil+recruitment+across+endothelium.">Emerging mechanisms of neutrophil recruitment across endothelium.</a> Trends Immunol. 32, 461-469 (2011).</li></ol>

The authors have no competing financial interests.

Bu, hücre apoptozu ve bir tek tabaka kesintiye neden olacağından, bu protokol için, bu akış odalarına hava kabarcıklarının oluşumunu önlemek için çok önemlidir. Bunu önlemek için, tüpler akış odasının bağlı adımlar 4.2 ve 4.5, özellikle faiz ödemek için vurgulamak istiyorum. Protokolde Diğer önemli adım önce akış odasının (aşama 4,1) injekte için 37 ° C&#39;de 15-30 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilerek bunları tutulur PMNs astarlı. Bu da onları, endotel de ICAM-1 ya da VCAM-1 gibi yapışma molekülü uygun sağlayan lökosit bütünleyicilerinin astarlanması ile sonuçlanır. Bu protokol, nötrofil göçü incelemek için sınırlı değildir. , Monositler veya lenfositler gibi diğer lökosit tipleri kullanılabilir. Lökosit tipleri arasında farklılık olabilir lökositler emişli, yani bu adımı 4.1, unutmayın. Aynı zamanda, endotelyal hücrelerin diğer tür de kullanılabilir. Bunun için kritik kalırTNF-α ya da IL-1β gibi uygun, enflamatuar uyarılara ile endotelyal hücrelerini uyarmak için. Nötrofiller transmigrating yanıt yoksa, bir N-formil-L-metionil-L-leusil-L-fenilalanin (fMLP) ile peptit 16 ile nötrofiller kısa bir süre (5 dakika) muamele edilmesi düşünülebilir. Bu endotele uymak için onları daha eğilimli hale daha da, özellikle kendi integrinler de, nötrofiller teşvik edecek. Tipik olarak 1 din / cm 2 akış hızı kullanılır. Bu akış hızı post-kapiller venüllerin, en lökosit transendoteliyal göç 17 oluşur sitelerinde ölçülür. Tarif edilen akış odaları kullanılarak, 10 din / cm 2 akış hızı kadar artırmak mümkündür. Bununla birlikte, daha da geliştirmek için kesme tavsiye edilmez. Bu akış odasından hücrelerin tüp ve dekolmanı istenmeyen sızıntısına neden olabilir. Şekil 3 içinde tarif edilen sonuçlar, bu göstermektedirantikorlar görselleştirmek ve lökosit diyapedezin sırasında endotel hücre-hücre birleşme bölgesinin dinamikleri üzerinde çalışmak için de kullanılabilir. Özellikle, mevcut göçü deneylerinde ek olarak, bu iletişim kuralı, gerçek zamanlı olarak fizyolojik akış şartları altında hücre üzerinden taşıma arası paraselüler ayırt sağlar. Antikorlar, hücre-hücre kavşaklar leke dolayı, bir / PECAM-1-kaderin the VE pozitif olmayan karşı VE-cadherin / PECAM-1 ile pozitif bağlantı yerlerine çapraz lökosit sayısı tam olabilir. Bu şekilde, transselüler göç paraselüler göç ayırt edilebilir. Bu çalışmada kullanılan PECAM-1 antikoru, ikinci hücre-dışı domenine karşı yöneliktir: Bu antikorlar bağlanan proteinlerin işlevine müdahale etmeyen olduğunu vurgulamak önemlidir. Antikor en az vermediği anlamına yayma veya bir tek tabaka oluşturan herhangi bir bozukluğun göstermedi antikorun mevcudiyetinde kaplandı Endotel hücreleri,endotel hücreleri arasındaki homotipik etkileşimleri ile müdahale. buna ek olarak, her iki antikorun endotel tek tabaka boyunca göç etme yeteneği nötrofillerin bozmamaktadır. Buna ek olarak, ya da yokluğunda, antikorların varlığında endotel tek tabaka üzerinde göç etmek nötrofil sayısının (veriler gösterilmemiştir) değişmez. Önemlisi, odaklı lazer tarama mikroskopisi bize aynı anda farklı floresan kanalları ve DIC kayıt imkanı verir. Bir nötrofil endotel hücre-hücre birleşme yerini geçer ve lökosit hücre üzerinden karşı, diğer, yani paraselüler üzerinden bir yol tercih anlamak yardımcı olacaktır Dolayısıyla, bu deney aynı zamanda VE-cadherin ve PECAM-1 dinamiğini çalışmak sağlar.

Verimli ve sıkı bir şekilde kontrol lökosit transendotelyal göç (TEM) gibi bağışıklık gözetim ve akut inflamasyon gibi fizyolojik süreçlerde önemli bir yer tutmaktadır. Bununla birlikte, bazı pato-fizyolojik koşullar altında, kontrol edilemeyen ve aşırı TEM kronik iltihaplı hastalıklar (örneğin, romatoid artrit, ateroskleroz, astım) elde görülmektedir. Tümör hücreleri 1-3 metastaz için kan dolaşımını bırakmak için aynı zamanda, tümör hücre metastazı sırasında transendoteliyal taşınması işleminde etkili olduğunu. Özellikle aşırı lökosit ya da tümör hücresi TEM müdahale etmek için, bu işlemin düzenlenmesinde ayrıntılı bir anlaşılması gerekmektedir. TEM sürecinin farklı adımlarda meydana geldiğine inanılır. Butcher ve Springer tarafından iki yıl önce yorumlanan Seminal çalışmaları, TEM 4,5 sürecini anlatan çok basamaklı modeline yol açtı. Bu model, her ne kadar hala bazı reklamdan, geçerlidirditional adımlar 6 dahil edilmiştir. Alon ve diğ. Endotel 7 yüzeyi üzerinde hareketsiz kemokinlerin yer alması ihtiyacı tanımlamışlardır. Son zamanlarda, onlar endotel kendisi endotel apikal yüzeyinde 8&#39;de sunulmaktadır kemokinlerle üretir olduğunu gösterdi. Ayrıca, aynı grup TEM sırasında 7 akış koşullarının önemini ortaya koymak. Son zamanlarda, iki farklı güzergahlar lökositler odaklanan çeşitli yayınlar TEM son diyapedez aşamada alabilir. Onlar, yani, hücre-hücre kavşaklarda aracılığıyla paraselüler göç rota gitmek, ya da transselüler göç rotası 9 olarak bilinen endotel hücre gövdesi aracılığıyla geçebilir ya. Carman ve meslektaşları detaylı olarak bu yolları okudu ve göbek ven endotel tektabaka 10 geçerken lökositler tercihen transselüler rota (% 10) üzerinde paraselüler göç güzergahı (% 90) tercih sonucuna varmıştır.Bununla birlikte, diğer kaynaklardan gelen endotel hücreleri kullanıldığı zaman, örneğin, beyin ya da kılcal daha lökositler transsellüler yol (% 30) 11 kullanılır. Bir VE-kaderin-alfa-katenin için şimeri Vestweber grup son hücre-hücre kavşaklar endojen yerine, bir darbe-hayvan modeli kullanarak birbirinden ayırmak koyamadık o zaman VE-kaderin gösterdi, lökosit TEM tam 12 engellendi . Şaşırtıcı, yazarlar TEM birkaç engellendi ama hepsi değil, dokular olduğunu fark ettim. Genel olarak, bu zarif deneyler bu kararı tetikleyen düzenleyici sinyaller hala bilinmiyor olsa da lökositler, transselüler güzergahın üzerinde paraselüler rotayı tercih ettiğini belirtti. Lökositlerin çoğunluğu paraselüler göç yolu tercih olsa da, her iki yollar arasında ayrım hala zordur. Endotel hücre-hücre ayr rolü üzerine odaklanan bazı çalışmalarda rağmen bu ek olarak,iyonlar, bu kavşak dinamikleri, özellikle kavşak proteinler VE-kaderin ve PECAM-1, lökosit geçiş tartışma halen sırasında. Biz, bu birleşim moleküller flüoresan etiketli antikorlar kullanılarak akış koşulları altında, fizyolojik lökosit diyapedezin boyunca gerçek zamanlı olarak izlenmesini mümkün kılan nispeten basit bir deney geliştirildi. Bu antikorlar müdahale veya hedeflenen proteinlerin kavşak bütünlüğü veya hareketlilik bloke etmedi. Bu deney, bize paraselüler TEM sürecinde kavşak proteinlerin dinamiklerini takip etmesini sağlar. Ayrıca, bu testte de para- ve transselüler göç yolları arasında ayrımcılık verir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1251">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:471px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:365px;">Company</td>
			<td style="width:184px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#956;-Slide VI</td>
			<td style="width:365px;">IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">80606</td>
			<td>Flow-chamber</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.45 &#956;m filter&#160;</td>
			<td>Whatman/GE Lifesciences</td>
			<td style="width:184px;">10462100</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">1 mL syringe&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Plastipak</td>
			<td style="width:184px;">300013</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">20 mL syringe&#160;</td>
			<td>BD Discardit II</td>
			<td style="width:184px;">366296</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">21G needle&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Microlance</td>
			<td style="width:184px;">301155</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Albumin&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Sanquin</td>
			<td style="width:184px;">15522644</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Ammunium chloride (NH4Cl)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1009245000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Calcium chloride (CaCl2)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">449709</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:471px;">EBM-2 Basal medium + EGM-2 SingleQuot Kit Suppl. &#38; Growth Factors</td>
			<td style="width:365px;">Lonza</td>
			<td style="width:184px;">CC-3156 + CC-4176</td>
			<td>media</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">EDTA (Titriplex III)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1370041000</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon tubes&#160;</td>
			<td>Corning Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">352096</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Fibronectin</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">F1141-2MG</td>
			<td>FN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Glucose</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">G7528</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">HEPES</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">H3375</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">In-line Luer Injection port&#160;</td>
			<td>IBIDI</td>
			<td style="width:184px;">10820</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4.7H2O)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">105886</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PECAM-1-ALEXA-647&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">561654</td>
			<td>clone WM59 
			stock concentration 0.1mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Percoll&#160;</td>
			<td>GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:184px;">17-0891-09</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:365px;">Fresenius Kabi&#160; Nederland</td>
			<td style="width:184px;">M090001/01NL</td>
			<td>PBS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Potassium chloride (KCl)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P9541</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium hydrogen carbonate (KHCO3)</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1048540500</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:471px;">Potassium phosphate dibasic trihydrate (K2HPO4)</td>
			<td style="width:365px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:184px;">P5504</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Silicone Tygon 3350 tubing</td>
			<td style="width:365px;">VWR</td>
			<td style="width:184px;">228-4331</td>
			<td>tubing</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td style="width:365px;">Calbiochem (Millipore)</td>
			<td style="width:184px;">567441</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Syringe pump&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Harvard Apparatus</td>
			<td>model number 55-5920</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TNF&#945;&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Peprotech</td>
			<td style="width:184px;">300-01A</td>
			<td>tumor necrosis factor</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">trisodium citrate&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Merck</td>
			<td style="width:184px;">1.06447.5000</td>
			<td>TNC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vacuettes</td>
			<td style="width:365px;">Greiner, Germany</td>
			<td style="width:184px;">980044</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VE-Cadherin-FITC&#160;</td>
			<td style="width:365px;">BD Pharmingen</td>
			<td style="width:184px;">560411</td>
			<td>clone 55-7H1</td>
			<td>stock concentration 0.5mg/mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Zeiss LSM510 META&#160;</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:471px;">Zen Software 2008</td>
			<td style="width:365px;">Carl Zeiss MicroImaging, Jena, Germany</td>
			<td style="width:184px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

real-time imaging of endothelial cell-cell junctions during neutrophil transmigration under physiological flow

Inflamasyon sırasında, lökositler dolaşımını bırakın ve alttaki dokularda işgalci patojenlere mücadele endotelyumu çapraz. Bu süreç lökosit transendotelyal göç olarak bilinir. Endotel tek tabaka geçmeye lökositler için iki yol tarif edilmiştir: yani hücre-hücre kavşaklarda ve transselüler rota aracılığıyla paraselüler rota, yani, endotel hücre vücuda. Bununla birlikte, para- ve transsellüler yol arasında ayrım yapmak teknik olarak zor olmuştur. Biz endojen dağılımı VE-kaderin ve PECAM-1 fizyolojik akış koşulları altında nötrofil transendotelyal göç sırasında incelemek için basit in vitro testi geliştirdi. Nötrofil perfüzyon önce, endotel hücreleri kısa bir süre için VE-cadherin ve PECAM-1 karşı floresan ile etiketlenmiş antikorlar ile tedavi edilmiştir. Elektrik hücre substra ile saptandığı gibi, bu antikorlar hem proteinlerin işlevine müdahale etmedite empedans algılama ve sıkı bağlamak ölçümleri. Bu analizi kullanarak, endojen dağılımı akış koşulları altında transendotelyal göç sırasında ve PECAM-1-kaderin VE ve endotelyumda lökositlerin para- ve transselüler göç yolları ayırt takip başardık.

Antikorlar endotel bariyer fonksiyonu ile müdahale etmedi eğer ilk test. Biz elektrik hücre alt-tabaka empedans algılama (ECIS) ile endotel tek katmanlarının direnci ölçüldü. Ayrıntılar için, Van Buul ve diğ. 13 anti-VE-cadherin floresan etiketli antikor hücreleri (Şekil 2A) ilave edildi, dirençli herhangi bir değişiklik gözlenmedi bkz. Engellemek için çok iyi bilinen bir anti-VE-cadherin antikor fonksiyonu önemli ölçüde (Şekil 2A) direncini azaltır VE-cadherin. Aynı zamanda, dinamiklerini değiştirmeyen, görüntüleme için kullanılan antikorlar, VE-cadherin, foto-ağartıcı (sıkı bağlamak) sonra flüoresan iyileşme ölçülerek değerlendirildi (Şekil 2B)-kaderin-GFP VE. 1-2 dakika sonra, nötrofiller DIC kanalı (Şekil 3A) olarak sunulacak bir görüntü olarak aktive edilmiş endotel tabakasına yapıştırılır. 5-30 se için tarama sonrac nötrofillerin büyük çoğunluğu PECAM-1 a&#39;ya karşı yönlendirilen antikorlar ile etiketlenmiş ve VE-cadherin olan hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka ile transmigrant. Diyapedezin sürecinde, dağıtım VE-cadherin ve PECAM-1 ile gerçek zamanlı (Şekil 3B) olarak izlenmiştir. Nötrofil diyapedezin sahalarında, VE-kaderin yerel bozulur ve PECAM-1, daha halka benzeri bir yapı gösterdi. Diyapedezin tamamlanmasından sonra, kapat ve bir kam VE-cadherin ve PECAM-1 açıkça diyapedezin sahalara (Şekil 3C) yeri değiştirilir. Nötrofil endotelinin baso-yan kenar ulaştıktan sonra, anti-PECAM-1 antikor parçaları nötrofil yüzeyinde tespit edilmiştir unutmayın. Bununla birlikte, bu, endoteli geçmesini nötrofiller engellemedi. Nötrofil transendotelyal göç sırasında gerçek zamanlı olarak gözlenen dinamikleri VE-kaderin Shaw ve arkadaşları tarafından çalışmaları ile anlaşmaya vardı kimkonfokal mikroskopi kullanılarak, gösterdi ve VE-kaderin-GFP-transfekte VE-kaderin-GFP lökositler endotel hücre-hücre kavşakları 14 geçtiklerinde yanal dağınık endotel hücreleri,. Su ve arkadaşları PECAM-1 bizim gözlemlerini vurguladı tarafından da çalışırlar. Onlar lökosit geçişi üzerine yanal yanında, bu VE-kaderin difüzyon gösterdi, PECAM-1 lokal transmigrating nötrofil 15 etrafında bir halka içine dağıtıldı. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig1highres.jpg" width="400" /> In vitro akış odasında Şekil 1. (A). Ok orta yenilenmesi gerekiyor hangi depoyu gösterir. Boru sistemi (ok başı) bağlantısını kesmeden PMN enjekte etmek için kullanılan aynı doğrultuda luer enjeksiyon ağzı ile akış odacığına bağlayan (B) Silikon boru. (C), Conn37 ° C akış tamponu (ok başı) ile dolu hazne şişeye boş bir akış odasının ection. (D) akış tamponu ihtiva eden boru TNF-α-muamele edilmiş HUVECler ile akış odasının bağlanması ve bir mikroskop kademesine (ok başı) içine yerleştirilmiştir. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2. VE-cadherin birleşim dinamikleri ya da işlev ile karışmaz antikor (A). Endotelyal hücre tek empedans ECIS kullanılarak ölçülür. Y-ekseni Ohm empedansı ifade ve x-ekseni saat zamanı gösterir. Antikor, CL75 (siyah çizgi) bloke VE-cadherin ise VE-cadherin antikor Alexa647 (mavi çizgi) ile etiketlenmiş klon 55-7H1 veya empedansını azaltmak, endotelyal hücre tek empedansını değiştirebilir olmayan IgG Alexa647 kontrol (kırmızı çizgi) ki izotipini . (B </strong&gt;) HUVEC ifade edildi kaderin-GFP-VE konfokal mikroskopi kullanılarak sıkı bağlamak analizi, varlığında veya yokluğunda, floresan kurtarma değişiklik görülmemiştir VE-cadherin 55-7H1 antikor. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. VE-cadherin ve PECAM-1 dağılımı gerçek zamanlı olarak nötrofil TEM sırasında (A). Nötrofil endotelyum üzerinde yapışma ve dağılımını etkilemeden hücre-hücre birleşme yerini geçen (beyaz çizgi ile işaretlenmiştir) VE-cadherin ve PECAM -1. (B), nötrofil hücre-hücre birleşme yoluyla endotel tek tabaka kapısı. Yerel bir dispersiyon VE-cadherin nötrofil hücre-hücre birleşme sayesinde çıkıntı yaptığında ve PECAM-1 ile gözlenebilir. Beyaz çizgi endotel üstüne hala nötrofil varlığını göstermektedir. Sarı çizgi nötrofil membran tha gösterirt endoteline altında zaten. (C) Nötrofil tamamen endotel tek tabaka geçti. VE-kaderin ve PECAM-1 diyapedezin bölgelerinde taşındı. Sarı çizgi transmigrant nötrofil sınırlarını göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51766/51766fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow at JoVE.com

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi.

Nötrofil Hicret altında Fizyolojik Akış sırasında endotel hücre-hücre Eklemlerinin Gerçek zamanlı Görüntüleme

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

real-time-imaging-endothelial-cell-cell-junctions-during-neutrophil

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Immunology and Infection

Unit 1

Cell-Cell Interactions

SCIENTISTS IN ACTION

19.4K Görüntüleme.  Sanquin Research and Landsteiner Laboratory, AMC at University of Amsterdam.  Lökositler paraselüler veya transselüler yolu kullanarak endotel tek tabaka çapraz. Biz endojen junctional dağıtım VE-kaderin ve PECAM-1 lökosit transendotelyal göç sırasında fizyolojik akış altında iki âlemden yolları arasında ayrım için takip basit bir deney geliştirildi. 

Video: Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &beta;-arrestin

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to intracellular responses. GPCRs control diverse biological functions such as chemotaxis, intracellular calcium release, gene regulation in a ligand dependent manner via heterotrimeric G-proteins1-2. Ligand binding induces a series of conformational changes leading to activation of heterotrimeric G-proteins that modulate levels of second messengers such as cyclic adenosine monophosphate (cAMP), inositol triphosphate (IP3) and diacyl glycerol (DG). Concomitant with activation of the receptor ligand binding also initiates a series of events to attenuate the receptor signaling via desensitization, sequestration and/or internalization. The desensitization process of GPCRs occurs via receptor phosphorylation by G-protein receptor kinases (GRKs) and subsequent binding of &beta;-arrestins3. &beta;-arrestins are cytosolic proteins and translocate to membrane upon GPCR activation, binding to phosphorylated receptors (most cases) there by facilitating receptor internalization 4-6.
Leukotriene B4 (LTB4) is a pro-inflammatory lipid molecule derived from arachidonic acid pathway and mediates its actions via GPCRs, LTB4 receptor 1 (BLT1; a high affinity receptor) and LTB4 receptor 2 (BLT2; a low affinity receptor)7-9. The LTB4-BLT1 pathway has been shown to be critical in several inflammatory diseases including, asthma, arthritis and atherosclerosis10-17. The current paper describes the methodologies developed to monitor LTB4-induced leukocyte migration and the interactions of BLT1 with &beta;-arrestin and , receptor translocation in live cells using microscopy imaging techniques18-19.
Bone marrow derived dendritic cells from C57BL/6 mice were isolated and cultured as previously described 20-21. These cells were tested in live cell imaging methods to demonstrate LTB4 induced cell migration. The human BLT1 was tagged with red fluorescent protein (BLT1-RFP) at C-terminus and &beta;-arrestin1 tagged with green fluorescent protein (&beta;-arr-GFP) and transfected the both plasmids into Rat Basophilic Leukomia (RBL-2H3) cell lines18-19. The kinetics of interaction between these proteins and localization were monitored using live cell video microscopy. The methodologies in the current paper describe the use of microscopic techniques to investigate the functional responses of G-protein coupled receptors in live cells. The current paper also describes the use of Metamorph software to quantify the fluorescence intensities to determine the kinetics of receptor and cytosolic protein interactions.

Real-time Imaging of Leukotriene B4 Mediated Cell Migration and BLT1 Interactions with &amp;#946;-arrestin

This paper describes the methodology to determine the chemotactic response of leukocytes to specific ligands and identify interactions between the cell surface receptors and cytosolic proteins using live cell imaging techniques.

Lökotrien B Gerçek zamanlı görüntüleme 4 Hücre aracılığı ile Göç ve β-arrestin BLT1 Etkileşimleri

G-protein coupled receptors (GPCRs) belong to the seven transmembrane protein family and mediate the transduction of extracellular signals to ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, neutrophils are the first inflammatory cells to migrate to the site of injury. Recruitment of neutrophils to an injury site is a stepwise process that includes first, dilation of blood vessels to increase blood flow; second, microvascular structural changes and escape of plasma proteins from the bloodstream; third, rolling, adhesion and transmigration of the neutrophil across the endothelium; and fourth accumulation of neutrophils at the site of injury2,3. A wide array of in vivo and in vitro methods has evolved to enable the study of these processes4. This method focuses on neutrophil transmigration across human endothelial cells.
One popular method for examining the molecular processes involved in neutrophil transmigration utilizes human neutrophils interacting with primary human umbilical vein endothelial cells (HUVEC)5. Neutrophil isolation has been described visually elsewhere6; thus this article will show the method for isolation of HUVEC. Once isolated and grown to confluence, endothelial cells are activated resulting in the upregulation of adhesion and activation molecules. For example, activation of endothelial cells with cytokines like TNF-&alpha; results in increased E-selectin and IL-8 expression7. E-selectin mediates capture and rolling of neutrophils and IL-8 mediates activation and firm adhesion of neutrophils. After adhesion neutrophils transmigrate. Transmigration can occur paracellularly (through endothelial cell junctions) or transcellularly (through the endothelial cell itself). In most cases, these interactions occur under flow conditions found in the vasculature7,8.
The parallel plate flow chamber is a widely used system that mimics the hydrodynamic shear stresses found in vivo and enables the study of neutrophil recruitment under flow condition in vitro9,10. Several companies produce parallel plate flow chambers and each have advantages and disadvantages. If fluorescent imaging is needed, glass or an optically similar polymer needs to be used. Endothelial cells do not grow well on glass.
Here we present an easy and rapid method for phase-contrast, DIC and fluorescent imaging of neutrophil transmigration using a low volume ibidi channel slide made of a polymer that supports the rapid adhesion and growth of human endothelial cells and has optical qualities that are comparable to glass. In this method, endothelial cells were grown and stimulated in an ibidi &mu;slide. Neutrophils were introduced under flow conditions and transmigration was assessed. Fluorescent imaging of the junctions enabled real-time determination of the extent of paracellular versus transcellular transmigration.

This article first describes a procedure for isolating human endothelial cells from umbilical veins and then shows how to use these cells to examine neutrophil transmigration under flow conditions. By using a low-volume flow chamber made from a polymer with the optical characteristics of glass, live-cell fluorescent imaging of rare cell populations is also possible.

Akış Koşullarında İnsan umbilikal ven endotel hücreleri ve nötrofil Transmigration Çalışmaları Kullanılması İzolasyonu

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

Detection of MicroRNAs in Microglia by Real-time PCR in Normal CNS and During Neuroinflammation

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many diseases associated with neuroinflammation such as multiple sclerosis (MS)2. Microglia in a normal CNS express macrophage marker CD11b and exhibit a resting phenotype by expressing low levels of activation markers such as CD45. During pathological events in the CNS, microglia become activated as determined by upregulation of CD45 and other markers3. The factors that affect microglia phenotype and functions in the CNS are not well studied. MicroRNAs (miRNAs) are a growing family of conserved molecules (~22 nucleotides long) that are involved in many normal physiological processes such as cell growth and differentiation4 and pathologies such as inflammation5. MiRNAs downregulate the expression of certain target genes by binding complementary sequences of their mRNAs and play an important role in the activation of innate immune cells including macrophages6 and microglia7. In order to investigate miRNA-mediated pathways that define the microglial phenotype, biological function, and to distinguish microglia from other types of macrophages, it is important to quantitatively assess the expression of particular microRNAs in distinct subsets of CNS-resident microglia. Common methods for measuring the expression of miRNAs in the CNS include quantitative PCR from whole neuronal tissue and in situ hybridization. However, quantitative PCR from whole tissue homogenate does not allow the assessment of the expression of miRNA in microglia, which represent only 5-15% of the cells of neuronal tissue. Hybridization in situ allows the assessment of the expression of microRNA in specific cell types in the tissue sections, but this method is not entirely quantitative. In this report we describe a quantitative and sensitive method for the detection of miRNA by real-time PCR in microglia isolated from normal CNS or during neuroinflammation using experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), a mouse model for MS. The described method will be useful to measure the level of expression of microRNAs in microglia in normal CNS or during neuroinflammation associated with various pathologies including MS, stroke, traumatic injury, Alzheimer's disease and brain tumors.

Microglia are resident macrophages that provide the first line of defense and immune surveillance of the central nervous system. MicroRNAs are regulatory molecules that play an important role in many physiological processes including activation and differentiation of macrophages. In this article, we describe the method for measurement of microRNAs in microglia.

Normal MSS Real-time PCR ve Nöro sırasında mikroglia içinde microRNA tespiti

Microglia are cells of the myeloid lineage that reside in the central nervous system (CNS)1. These cells play an important role in pathologies of many ...

Real-time Live Imaging of T-cell Signaling Complex Formation

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating the activation and responses of multiple immune cells 3,4. T-cell activation is dependent on the recognition of specific antigens displayed by antigen presenting cells (APCs). The T-cell antigen receptor (TCR) is specific to each T-cell clone and determines antigen specificity 5. The binding of the TCR to the antigen induces the phosphorylation of components of the TCR complex. In order to promote T-cell activation, this signal must be transduced from the membrane to the cytoplasm and the nucleus, initiating various crucial responses such as recruitment of signaling proteins to the TCR;APC site (the immune synapse), their molecular activation, cytoskeletal rearrangement, elevation of intracellular calcium concentration, and changes in gene expression 6,7. The correct initiation and termination of activating signals is crucial for appropriate T-cell responses. The activity of signaling proteins is dependent on the formation and termination of protein-protein interactions, post translational modifications such as protein phosphorylation, formation of protein complexes, protein ubiquitylation and the recruitment of proteins to various cellular sites 8. Understanding the inner workings of the T-cell activation process is crucial for both immunological research and clinical applications.
Various assays have been developed in order to investigate protein-protein interactions; however, biochemical assays, such as the widely used co-immunoprecipitation method, do not allow protein location to be discerned, thus precluding the observation of valuable insights into the dynamics of cellular mechanisms. Additionally, these bulk assays usually combine proteins from many different cells that might be at different stages of the investigated cellular process. This can have a detrimental effect on temporal resolution. The use of real-time imaging of live cells allows both the spatial tracking of proteins and the ability to temporally distinguish between signaling events, thus shedding light on the dynamics of the process 9,10. We present a method of real-time imaging of signaling-complex formation during T-cell activation. Primary T-cells or T-cell lines, such as Jurkat, are transfected with plasmids encoding for proteins of interest fused to monomeric fluorescent proteins, preventing non-physiological oligomerization 11. Live T cells are dropped over a coverslip pre-coated with T-cell activating antibody 8,9, which binds to the CD3/TCR complex, inducing T-cell activation while overcoming the need for specific activating antigens. Activated cells are constantly imaged with the use of confocal microscopy. Imaging data are analyzed to yield quantitative results, such as the colocalization coefficient of the signaling proteins.

We describe a live-cell imaging method that provides insight into protein dynamics during the T-cell activation process. We demonstrate the combined usage of the T-cell spreading assay, confocal microscopy and imaging analysis to yield quantitative results to follow signaling complex formation throughout T-cell activation.

T hücre gerçek zamanlı Canlı Görüntüleme Kompleks Oluşum Sinyal

Protection against infectious diseases is mediated by the immune system 1,2. T lymphocytes are the master coordinators of the immune system, regulating ...

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

Canlı Fare Damar İltihabı ve trombüs oluşumu sırasında Activated Endotel üzerinde heterotypic Trombosit nötrofil Etkileşimleri Gerçek zamanlı Görüntüleme

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

The vascular endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are activated by host mediators or directly by conserved microbial components or host-derived danger molecules. Activated ECs express cytokines, chemokines and adhesion molecules that mobilize, activate and retain leukocytes at the site of infection or injury. Neutrophils are the first leukocytes to arrive, and adhere to the endothelium through a variety of adhesion molecules present on the surfaces of both cells. The main functions of neutrophils are to directly eliminate microbial threats, promote the recruitment of other leukocytes through the release of additional factors, and initiate wound repair. Therefore, their recruitment and attachment to the endothelium is a critical step in the initiation of the inflammatory response. In this report, we describe an in vitro neutrophil adhesion assay using calcein AM-labeled primary human neutrophils to quantitate the extent of microvascular endothelial cell activation under static conditions. This method has the additional advantage that the same samples quantitated by fluorescence spectrophotometry can also be visualized directly using fluorescence microscopy for a more qualitative assessment of neutrophil binding.

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Neutrophil adherence to the activated endothelium at sites of infection is an integral component of the host's inflammatory response. Described in this report is a neutrophil binding assay that allows for the in vitro quantitation of primary human neutrophil binding to endothelial cells activated by inflammatory mediators under static conditions.

Nicel<em&gt; In vitro</emStatik Koşullarında Account İlköğretim İnsan mikrovasküler endotel hücreleri için Nötrofil yapışma Tedbir&gt; Testi

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion involves many different adhesion molecules including members of the &beta;2 integrin family and their counter-receptors of the ICAM family. Recently, naturally occurring genetic variants in both &beta;2 integrins and ICAMs are reported to be associated with autoimmune disease. Thus, the quantitative adhesive capacity of neutrophils from individuals with varying allelic forms of these adhesion molecules is important to study in relation to mechanisms underlying development of autoimmunity. Adhesion studies in flow chamber systems can create an environment with fluid shear stress similar to that observed in the blood vessel environment in vivo. Here, we present a method using a flow chamber assay system to study the quantitative adhesive properties of human peripheral blood neutrophils to human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and to purified ligand substrates. With this method, the neutrophil adhesive capacities from donors with different allelic variants in adhesion receptors can be assessed and compared. This method can also be modified to assess adhesion of other primary cell types or cell lines.

A method of quantitating neutrophil adhesion is reported. This method creates a dynamic flow environment similar to that encountered in a blood vessel. It allows the investigation of neutrophil adhesion to either purified adhesion molecules (ligand) or endothelial cell substrate (HUVEC) in a context similar to the in vivo environment with sheer stress.

İnsan nötrofil Akış odası Yapışma Deneyi

Neutrophil firm adhesion to endothelial cells plays a critical role in inflammation in both health and disease. The process of neutrophil firm adhesion ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

Miyeloid hücrelerin Dynamics Gerçek zamanlı Görüntüleme<em&gt; Süm<sup&gt; Min / +</sup</em&gt; Bağırsak Tümörleri Disk Eşodaklı Mikroskopi Spinning tarafından

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor response to insulin, local hypoxia, and inflammation. By stimulating the differentiation of functional white adipocytes from progenitors, radical hypertrophy of the adipocyte population can be prevented and, consequently, the metabolic health of adipose tissue can be improved along with a reduction of inflammation. Also, by stimulating a differentiation of beige/brown adipocytes, the total body energy expenditure can be increased, resulting in weight loss. This approach could prevent the development of obesity co-morbidities such as type 2 diabetes and cardiovascular disease.
This paper describes the isolation, expansion, and differentiation of white and beige adipocytes from a subset of human adipose tissue endothelial cells that co-express the CD31 and CD34 markers. The method is relatively cheap and is not labor-intensive. It requires access to human adipose tissue and the subcutaneous depot is suitable for sampling. For this protocol, fresh adipose tissue samples from morbidly obese subjects [body mass index (BMI) &#62;35] are collected during bariatric surgery procedures. Using a sequential immunoseparation from the stromal vascular fraction, enough cells are produced from as little as 2&#8211;3 g of fat. These cells can be expanded in culture over 10&#8211;14 days, can be cryopreserved, and retain their adipogenic properties with passaging up to passage 5&#8211;6. The cells are treated for 14 days with an adipogenic cocktail using a combination of human insulin and the PPAR&#947; agonist-rosiglitazone.
This methodology can be used for obtaining proof of concept experiments on molecular mechanisms that drive adipogenic responses in adipose endothelial cells, or for screening new drugs that can enhance the adipogenic response directed either towards white or beige/brown adipocyte differentiation. Using small subcutaneous biopsies, this methodology can be used to screen out non-responder subjects for clinical trials aimed to stimulate beige/brown and white adipocytes for the treatment of obesity and co-morbidities.

The differentiation of white and beige adipocytes from adipose tissue vascular progenitors bears potential for metabolic improvement in obesity. We describe protocols for a CD34+CD31+ endothelial cell isolation from human fat and for a subsequent in vitro expansion and differentiation into white and beige adipocytes. Several downstream applications are discussed.

Yalıtım, genişleme ve Adipojenik indüksiyon CD34 + CD31 + insan Omental ve deri altı yağ dokusu endotel hücrelerden

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Real-time Imaging and Quantification of Fungal Biofilm Development Using a Two-Phase Recirculating Flow System

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. While models for the growth under flow have been developed, many of these systems are expensive, or do not allow imaging while the cells are under flow. We have developed a novel apparatus that allows us to image the growth and development of Candida albicans cells under flow and in real-time. Here, we detail the protocol for the assembly and use of this flow apparatus, as well as the quantification of data that are generated. We are able to quantify the rates that the cells attach to and detach from the slide, as well as to determine a measure of the biomass on the slide over time. This system is both economical and versatile, working with many types of light microscopes, including inexpensive benchtop microscopes, and is capable of extended imaging times compared to other flow systems. Overall, this is a low-throughput system that can provide highly detailed real-time information on the biofilm growth of fungal species under flow.

We describe the assembly, operation, and cleaning of a flow apparatus designed to image fungal biofilm formation in real time while under flow. We also provide and discuss quantitative algorithms to be used on the acquired images.

Gerçek zamanlı görüntüleme ve miktar iki aşamalı dolaşım akış sistemi kullanarak mantar biyofilm gelişimi

In oropharyngeal candidiasis, members of the genus Candida must adhere to and grow on the oral mucosal surface while under the effects of salivary flow. ...