نشكر كريستوف Bieniossek، سيمون Trowitzsch، دانيال فيتزجيرالد، يويشيرو تاكاجي، كريستيان Schaffitzel، تقول السيدة إيفون، تيموثي ريتشموند وجميع أعضاء سابقون وحاليون من المختبر بيرغر طلبا للمساعدة والمشورة. وكانت منصة MultiBac وتطوره والدعم السخي من قبل وكالات التمويل بما في ذلك المؤسسة السويسرية الوطنية للعلوم (SNSF)، ووكالة الوطني للبحوث (ANR) والمركز الوطني للبحوث العلمية (CNRS) والمفوضية الأوروبية (EC) في إطار برامج (FP) 6 و 7. يتم توفير الدعم من أجل الوصول عبر الوطنية من مشاريع FP7 EC-P CUBE ( <a href="http://www.p-cube.eu" target="_blank">www.p-cube.eu</a> ) وBioStruct-X ( <a href="http://www.biostruct-x.eu" target="_blank">www.biostruct-x.eu</a> ). واعترفت وزارة الفرنسية للعلوم وخاصة لدعم منصة MultiBac في EMBL من خلال INVESTISSEMENT D&#39;أفينير مشروع FRISBI.

1. جنبا إلى جنب Recombineering (TR) لإنشاء بنيات التعبير متعددة الجينات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التخطيط لاستراتيجية شاركت في التعبير. أسلوب التصميم لإدخال الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة والموافقون. ينبغي تجميع الوحدات الفرعية الفسيولوجية المحتملة للمجمع الخاص معا على الموافقون وجهات مانحة محددة. استخدام وحدة الضرب تتكون من نوكلياز داخلية الزاجل (HE) - أزواج BstXI على الجمع بين أشرطة الكاسيت التعبير على المانحة الفردية والبلازميدات القابل 7،8 إنشاء كافة البنى ذات الصلة في سيليكون والتحقق من صحة استراتيجية جيدا قبل الشروع في العمل التجريبي. على سبيل المثال، يجب فحص الجينات في المصالح لا يحتوي على سعادة أو تقييد مواقع أخرى ووجود الصحيح إطارات القراءة المفتوحة (ORFS) ينبغي التحقق من صحتها. تنظر في طلب الجينات الاصطناعية الأمثل لمكافحة الحشرات استخدام كودون الخلايا وهيكلها الثانوي مرنا لتحسين مستويات إنتاج البروتين وكذلك إزالة أي EXIاللدغة سعادة المواقع من الجينات في المصالح. النظر في وضع الكلمات تنقية استنادا إلى بيانات من الأدبيات حول N-أو مرنة أو يتعرض C-مصطلحات من البروتينات التي تختارها. النظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein التي تهدف إلى إنتاج عدة مفارز البروتين في مجمع الخاص بك إذا المبالغ النسبية للبروتينات الفردية تحتاج إلى رقابة بسبب قضايا رياضيات الكيمياء في المجمع. 4 إعداد مفصلة &quot;كيف ل&quot; وثيقة (ينصح الكتاب مختبر الإلكترونية) التي تحتوي على جميع الخطوات التجريبية المتوقعة من المشروع المؤدية إلى بناء متعددة الجينات كاملة (ق). إنشاء ملفات إلكترونية من البلازميدات جنة المساواة العرقية، LoxP تنصهر على سبيل المثال باستخدام برنامج جنة المساواة العرقية، ACEMBLER والتي يمكن تحميلها من الصفحة الرئيسية لمجموعة بيرجر ( <a href="http://www.embl.fr/multibac/%20multiexpression_technologies/cre-acembler" target="_blank">multiexpression_technologies www.embl.fr/multibac/ / لجنة المساواة العرقية-acembler</a> ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إدراج الجينات الخاصة بك من الاهتمام إلى الجهات المانحة مختارة ويقبلون باستخدام إنزيمات التقييد ويغاز، أو، بدلا من ذلك، باستخدام أساليب مستقلة ربط البروتوكولات نشرت بعد. 5،6،14 إذا كان لديك الوصول إلى مناولة السائل محطة العمل، وإذا كنت تخطط لعدد كبير من بنيات إلى أن تتولد ( على سبيل المثال لنهج اندماجي) النظر في استخدام الروبوتات البرامج النصية وضعها وتنفيذها من قبل مجموعة بيرجر (الشكل 2). 14،15 إذا كان التعامل مع السائل محطة العمل غير متوفرة، التشغيل اليدوي باستخدام أطباق التلازن يسمح الإدراج الجينات في HT مثل الموضة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> القيود التي تفرضها الحاجة إلى السيطرة على حساب العناصر المتفاعلة من مفارز أعربت قد تتحقق. في حالة stoichiometrically مستويات التعبير متوازن من مفارز الفردية للبروتين معقد، والنظر في تطبيق استراتيجيات polyprotein إلى فستؤدي عدة مفارز من مجمع الخاص والبروتيني محددة (على سبيل المثال التبغ حفر فيروس زين البروتيني) في ORFS واحدة كبيرة متباعدة من قبل قمواقع بروتين pecific. 4،8 النظر المشترك، معربا عن polyproteins واحد أو عدة أشرطة مع تعبير واحد إذا كان لديك مجمع كبير جدا مع العديد من مفارز وتتراوح الأوزان الجزيئية على نطاق واسع من مفارز الفردية. تنظر شارك في التعبير عن العديد من الجينات التي تكود لنفس البروتين في polyprotein أو عن العديد من أشرطة الكاسيت التعبير متطابقة إذا كان متميزا بطابع أن البروتين منخفض العائد الإنتاج. 4،13 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من صحة كافة بنيات المانحة ومتقبل المستنسخة عن طريق تعيين قيود (اختياريا في الإنتاجية العالية) والتسلسل. انتقل إلى دمج مجموعات المانحين ومتقبل من قبل لجنة المساواة العرقية-LoxP إعادة التركيب لتوليد بنيات التعبير متعددة الجينات من خيار. التحقق من صحة تنقية البلازميدات الانصهار القابل الجهات المانحة عن طريق تعيين تقييد، استخدام تسلسل الإلكترونية التي أنشأتها لجنة المساواة العرقية-ACEMBLER أو برامج مماثلة كمرجع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين المانحون تنقيته والتحقق من صحتها، يقبلون اندماج المانحين ومتقبل في -20 درجة مئوية أو -80 درجة مئوية. الأرشيف ررasmids وتسلسلها (مايكروسوفت إكسل، فايل ميكر، وغيرهم) بعناية للاستخدام في وقت لاحق. </li></ol> 2. مركب الجيل الفيروسة العصوية متعددة الجينات، والتضخيم، والتخزين <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دمج نواقل نقل متعددة الجينات في الجينوم baculoviral MultiBac بواسطة تحويل الى DH10 الخلايا إيواء الجينوم الفيروسي وظائف مطلوبة من أجل Tn7 تبديل. لاحظ أن الجينوم baculoviral Multibac يمكن تحميلها مسبقا مع جينات معينة من الفائدة (YFP علامة، المحرمين، الخ) في موقعها LoxP الخاصة (هندسيا في جينوم البعيدة إلى موقع المرفق Tn7) من قبل لجنة المساواة العرقية في الجسم الحي رد الفعل الذي يسبق Tn7 التكامل. 13 بعد Tn7 والتحول، ويتم اختيار الخلايا مع الفيروسة العصوية مركب يحتوي على جينات من الاهتمام من خلال فحص أزرق / أبيض (الناجحة Tn7 النتائج تبديل في فقدان α-تكامل من β-غالاكتوزيداز، وبالتالي، مع المستعمرات الصحيح Tn7 تبديل تبقى بيضاء على انتقائية علىلوحات غار تحتوي على X-غال) والجينوم هو أعدته تحلل القلوية والايثانول / هطول الأيزوبروبانول. 5،6 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترنسفكأيشن وإنتاج فيروس الأولي. مكان 6 جيدا لوحة زراعة الأنسجة في غطاء العقيمة. من مراحل سجل Sf21 الحشرات خلية ثقافة، والبذور من aliquots من الخلايا في الآبار وبالنقل عن طريق إضافة الجينوم baculoviral تنقيته وكاشف ترنسفكأيشن مختلطة في وسائل الإعلام والثقافة كما هو موضح. 6 الحصاد فيروس الأولي بعد 48-60 ساعة عن طريق إزالة وسائل الإعلام ( جودة عالية، وانخفاض عيار الفيروس V 0، عادة 3 مل لكل بئر). تكملة وسائل الإعلام الجديدة، واختبار لإنتاج البروتين (وإذا كان موجود علامة YFP، لمضان) بعد 2-3 أيام إضافية. 6،7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضخيم من الفيروس، وانخفاض وزارة الداخلية نظام. استخدام V 0 الفيروس لنقل العدوى 25-50 مل من الخلايا في مرحلة السجل (كثافة الخلية &lt;1X10 6 خلايا لكل مل) في الصغيرة (100-250 مل) مخروطي شاكر قوارير المهتاجعلى الهزازات منصة مدارية (الشكل 3). عد الخلايا وتقسيم كل ساعة 24 حتى تتوقف الخلايا عن مضاعفة (اعتقال الانتشار). وأضاف خلايا يجب مضاعفة (على الأقل) مرة واحدة (وزارة الداخلية &lt;1)، وإلا تكرار التجربة مع حجم أصغر من V 0: اتباع نظام منخفضة وزارة الداخلية (تعدد عدوى أي عدد جزيئات الفيروس في الخلية). عادة، يتم استخدام 3 مل من V 0 لتصيب 25 مل من Sf21 خلايا الحشرات في مناطق ذات كثافة من 0.5x10 6 خلية / مل. وهذا أمر ضروري لمنع ضار على التضخيم والسيارات حذف الفيروس الذي يمكن أن يؤدي إلى فقدان الجينات مغاير من الفائدة. الحصاد V 1 فيروس (25-50 مل) بعد 48-60 ساعة من قبل التكوير الخلايا وإزالة وسائل الإعلام التي تحتوي على الفيروس. تكملة مع وسائل الإعلام الجديدة واختبار لYFP وإنتاج البروتين عن طريق إزالة الخلايا 6 1X10 كل 12 أو 24 ساعة، التكوير والتحقق من صحة إنتاج البروتين والبروتين علامة (YFP) إشارة. 6، أسهب فيروس (إلىV 2) مرة أخرى إذا وتهدف كميات أكبر في التعبير عن طريق إصابة ما يصل الى 400 مل الخلايا في 2 L شاكر قوارير مع V 1 فيروس احترام فوق أدنى مستوى وزارة الداخلية نظام (خلايا يجب مضاعفة مرة واحدة على الأقل بعد الإصابة مع V 1). اختبار صارم إنتاج البروتين والبروتين إشارة علامة خلال التضخيم لتجنب تراكم الفيروسات معيبة لم تعد تحتوي على الجينات الخاصة بك من الفائدة. 5-7 استخدام الكريات الخلية تتراكم في كل خطوة التكبير بالفعل لإقامة بروتوكولات تنقية للمجمع البروتين المعبر عنه من الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخزين BIIC من فيروس الإنتاج. ونحن نوصي بشدة لتخزين V 2 فيروس مثل فيروس الإنتاج باستخدام BIIC (B-I aculovirus nfected أنا nsect ج ells) طريقة، لمنع تعديلات (على سبيل المثال فقدان الجينات في المصالح) من الفيروس المؤتلف والحفاظ على التعبير عالية مستوىق 16 بيليه الخلايا المصابة لوحظ 24 ساعة بعد إلقاء القبض الانتشار - في هذه المرحلة خلايا تحتوي على جزيئات فيروسية كاملة قبل أن يتم الإفراج عنهم (عن طريق الناشئين) في وسائل الإعلام. إزالة وسائل الاعلام ومأخوذة تجميد الخلية بيليه في النيتروجين السائل وتخزينه إلى أجل غير مسمى. 7،16 </li></ol> 3. إنتاج البروتين والتجهيز النهائي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اصابة (ص) الثقافات كبيرة والرصد YFP. استخدام V 1، V 2 أو مأخوذة BIIC المجمدة لتصيب مزارع الخلايا أكبر للأشواط الإنتاج (عادة 400 مل في 2 L قوارير). الانضمام إلى الأقل زارة الداخلية نظام (ضبط حجم الفيروس المستخدمة للعدوى مثل تلك الثقافة المصابة الزوجي مرة واحدة على الأقل). تكبير حجم ثقافة المصابة إذا لزم الأمر عن طريق ضرب عدد من قوارير. إذا البروتين علامة YFP هو الحاضر، سحب على فترات 1X10 6 خلايا محددة، بيليه وليز الخلايا ورصد تطور إشارة YFP حتى يتم التوصل إلى هضبة دائرة الهجرة والجنسيةicating أقصى إنتاج البروتين المؤتلف. ويمكن قياس مستويات YFP في مستوى جيد 96 قارئ لوحة قادرة على تسجيل إشارات مضان (على سبيل المثال TECAN SPECTRAFluor). حصاد الخلايا في هذه المرحلة. الكريات خلية تخزينها في -20 درجة مئوية (قصيرة الأجل) أو -80 ° C (طويل الأجل). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحلل الخلايا وتجزئة. ليز الخلايا عن طريق الأسلوب المفضل لديك من خيار، مصممة خصيصا لمتطلبات البروتين الخاص (تجميد ذوبان الجليد، صوتنة، الصحافة الفرنسية، وغيرهم). 5-7 العصارة الخلوية يجزئ ونوى واختبار لوجود البروتينات اهتمامك. وضع بروتوكولات تنقية استنادا إلى نتائج لتبسيط تنقية البروتين. النظر في تطبيق إجراءات تمرغ لاستخراج البروتين الخاص بك من الكسر النووية في ظل ظروف بوكل عالية إذا البروتينات الخاصة بك الموجودة في النواة. 7،18 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنقية البروتين (الصغيرة الحجم، وعلى نطاق واسع). لاحظ أن كميات صغيرة في كثير من الأحيان (10 أو 25 مل) من زراعة الخلايا هي سوfficient للحصول على الكريات خلية لتنقية كميات كبيرة من البروتينات اهتمامك نظرا لارتفاع مستويات الإنتاج عادة أو عالية جدا من البروتينات مغايرة في نظم خلايا الفيروسة العصوية / حشرة (غالبا 10-100 ملغ من البروتين لكل L ثقافة وأكثر من ذلك). بالتزامن مع الدقيقة تنقية (لوحات multiwell، طرق microtip، GE للرعاية الصحية نظام ÄKTAmicro، وغيرهم) فمن الممكن الحصول على بيانات البيوكيميائية والنشاط وغالبا أيضا كمية كافية من البروتينات والمجمعات المطلوب على نطاق ونانولتر تبلور عالية الإنتاجية (HTX ). النظر في استخدام المعادن تنقية تقارب (Clonetech تاكارا تالون، QIAGEN NiNTA معدنية راتنجات خالب) وبنسبة ضئيلة من الحامض الاميني (6-10 بقايا) علامة على مفارز المكشوفة من البروتين الخاص المعقدة لتسهيل تنقية، بالتزامن مع التبادل الأيوني وحجم الاستبعاد اللوني في الصغيرة وحدات التخزين باستخدام على سبيل المثال ÄKTAmicro أو صغيرة الحجم آلة مماثلة تنقية (الشكل 4 </stرونغ&gt;). غيرها من خطوات تنقية تقارب وتبادل (IEX) الخطوات أيون بالإضافة إلى تنقية تقارب مع به بنسبة ضئيلة من الحامض الاميني أو العلامات الأخرى (الاختيار من ضريبة السلع والخدمات، MBP، CBP، وغيرهم) يمكن وينبغي النظر فيها، وفقا للخصائص الكيميائية الحيوية للبروتينات المصالح والتفضيلات الفردية. النظر في وضع علامات الوحيدات أكثر من واحد مع تقارب به لتعزيز كفاءة تنقية. تركز المجمعات البروتين النقي الخاص ووضع بروتوكولات تخزين مثل تجميد مع أو بدون الجلسرين. وضع معايير لمراقبة الجودة التي يمكن تطبيقها standardly (المقايسات النشاط، اختبارات الكيمياء الحيوية والفيزياء الحيوية) لتقييم دفعة إلى دفعة الاختلاف من البروتينات الخاصة بك تنقيته. </li></ol>

<ol>
	<li>Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+a+Grip+on+Complexes.">Getting a Grip on Complexes.</a> Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).</li><li>Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+sociology+of+the+cell.">The molecular sociology of the cell.</a> Nature. 450 (7172), 973-982 (2007).</li><li>Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+as+versatile+vectors+for+protein+expression+in+insect+and+mammalian+cells.">Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells.</a> Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).</li><li>Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+expanding+the+research+toolbox+for+multiprotein+complexes.">MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).</li><li>Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+complex+expression+by+using+multigene+baculoviral+vectors.">Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors.</a> Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).</li><li>Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MultiBac:+multigene+baculovirus-based+eukaryotic+protein+complex+production.">MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production.</a> Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).</li><li>Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+baculovirus+expression+tools+for+recombinant+protein+complex+production.">New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production.</a> J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).</li><li>Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Robots,+pipelines,+polyproteins:+enabling+multiprotein+expression+in+prokaryotic+and+eukaryotic+cells.">Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells.</a> J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).</li><li>Thomas, M. C., Chiang, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+general+transcription+machinery+and+general+cofactors.">The general transcription machinery and general cofactors.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).</li><li>Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+structures+of+the+eukaryotic+ribosome.">Atomic structures of the eukaryotic ribosome.</a> Trends Biochem. Sci. 37 (5), 189-198 (2012).</li><li>Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+core,+two+shells:+bacterial+and+eukaryotic+ribosomes.">One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes.</a> Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).</li><li>Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Architecture+of+RNA+polymerase+II+and+implications+for+the+transcription+mechanism.">Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism.</a> Science. 288 (5466), 640-649 (2000).</li><li>Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Baculovirus+expression+system+for+heterologous+multiprotein+complexes.">Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes.</a> Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).</li><li>Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+unrestricted+multigene+recombineering+for+multiprotein+complex+production.">Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production.</a> Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).</li><li>Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACEMBLing+multigene+expression+constructs+by+recombineering.">ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering.</a> Nat. Protocols. , (2009).</li><li>Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=H.D.+titerless+infected-cells+preservation+and+scale-up+(TIPS)+method+for+large-scale+production+of+NO-sensitive+human+soluble+guanylate+cyclase+(sGC)+from+insect+cells+infected+with+recombinant+baculovirus.">H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus.</a> Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).</li><li>Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+mitotic+checkpoint+complex.">Structure of the mitotic checkpoint complex.</a> Nature. 484 (7393), 208-213 (2012).</li><li>Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+mechanism+of+the+chromatin+remodelling+factor+ISW1a.">Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a.</a> Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).</li></ol>

IB هو المخترع على براءة اختراع وطلبات براءات الاختراع بالتفصيل أجزاء من التكنولوجيا وصفها هنا.

فيديو الأداة الإضافية طلقات في الشكلين 2 و 3 توضيح العملية برمتها من جيل الروبوت بمساعدة من [كدنا] التعبير متعددة الجينات يبني كل وسيلة لإصابة مزارع الخلايا الحشرات لإنتاج البروتين. وقد تم تطوير الكواشف الجديدة (البلازميدات والفيروسات) والبروتوكول?...

يتم التحكم النشاط البيولوجي من قبل جمعيات البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى التي تعمل في تناسق لتحفيز الوظائف الخلوية. ومن بين الأمثلة البارزة للآلية التي المحاضر المعلومات الوراثية الموجودة في الحمض النووي RNA إلى رسول. في البشر، وأكثر من 100 البروتينات معا في عملية تحديد وتنظيم لنسخ الجينات، وتشكيل المجمعات multiprotein كبيرة مع 10 وأكثر الوحدات الصغرى بما في ذلك الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني وعوامل النسخ العامة مثل TFIID، TFIIH وغيرها. 9 أمثلة أخرى هي الريبوسوم، تتكون من العديد من البروتينات وجزيئات الحمض النووي الريبي، وهذا يحفز تخليق البروتين، أو مجمع المسام النووية التي هي المسؤولة عن رحلات مكوكية الجزيئات الحيوية من خلال الغلاف النووي في حقيقيات النوى. A تشريح المعمارية والكيميائية الحيوية مفصل أساسا كافة الأجهزة المتعددة المكونات في الخلية هو أمر حيوي لفهم وظيفتها. استجلاء بنية بدائية النواة وeukarريبوسوم yotic، على سبيل المثال، شكلت الأحداث السمة المميزة الرضوخ البصيرة لم يسبق لها مثيل في كيفية هذه الآلات الجزيئات الاضطلاع بوظائفها المحددة لها في الخلية. 10،11 ويمكن الحصول على ريبوسوم في نوعية وكمية كافية لدراسة مفصلة من قبل تنقية المواد الذاتية من الخلايا المستزرعة، ويرجع ذلك إلى حقيقة أن ما يصل إلى 30٪ من كتلة الخلوية تتكون من الريبوسومات. الحمض النووي الريبي بوليميراز الثاني هو بالفعل أقل وفرة من حيث الحجم، والعديد من ألف لتر من الخميرة الثقافة كان لا بد من معالجتها للحصول على عرض مفصل الذرية من هذا المجمع الأساسية المركزية لنسخ 12 والغالبية العظمى من المجمعات الأساسية الأخرى هي إلا موجودة في كميات أقل من ذلك بكثير في الخلايا الأم، وبالتالي لا يمكن تنقيته بشكل كاف من مصدر المواد الأصلية. لتقديم مثل هذه المجمعات في متناول التحليل البنيوي والوظيفي مفصلة يتطلب إنتاج مغاير باستخدام المؤتلف الشركة المصرية للاتصالاتchniques. كان إنتاج البروتين المؤتلف لها تأثير كبير على بحوث علوم الحياة. تم إنتاج العديد من البروتينات recombinantly، وهيكلها وظيفة تشريح بدقة عالية. وقد اتخذت برامج الجينوميات الهيكلية الاستفادة من توضيح من الجينوم للعديد من الكائنات الحية لمعالجة ذخيرة منتج الجين من الكائنات بأكملها في وضع الإنتاجية العالية (HT). وهكذا فقد تم تحديد الآلاف من هياكل البروتين. حتى الآن، كان النظام الأكثر استخداما بغزارة لإنتاج البروتين المؤتلف E. وقد وضعت القولونية، وكثير من النظم التعبير وصقلها على مر السنين لإنتاج مغاير في هذا المضيف. البلازميدات بإيواء عدد كبير من الوظائف لتمكين إنتاج البروتين في E. القولونية ملء كتالوجات كامل من مقدمي الخدمات التجارية. ومع ذلك، E. القولونية ديه بعض القيود التي تجعل من غير مناسبة لإنتاج العديد من البروتينات وحقيقية النواة في عمجمعات البروتين مفصلي مع العديد من الوحدات الصغرى. ولذلك، أصبح إنتاج البروتين في المضيفين حقيقية النواة على نحو متزايد الأسلوب المفضل في السنوات الأخيرة. A مناسبة بصفة خاصة نظام لإنتاج بروتينات حقيقية النواة هو تعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) التي تعتمد على باكولوفيروس المؤتلف تحمل الجينات مغاير لتصيب مزارع الخلايا الحشرات المزروعة في المختبر. نظام MultiBac هو BEVS وضعت في الآونة الأخيرة والتي يتم تفصيلها بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة مع العديد من الوحدات الصغرى (الشكل 1). وقدم MultiBac الأولى في عام 2004. 13 منذ إطلاقها، وقد MultiBac تم صقلها باستمرار، ومبطنة تيار لتبسيط التعامل مع، وتحسين نوعية الهدف البروتين، وجعل النظام عموما الوصول إلى المستخدمين غير المتخصصين من خلال تصميم إجراءات التشغيل القياسية كفاءة (إجراءات العمل الموحدة). وقد تم تنفيذ 4 MultiBac في العديد من المختبرات في جميع أنحاء العالم، في ميلانademia والصناعة. في EMBL في غرونوبل، وضعت برامج الوصول عبر الوطنية في المكان من قبل المفوضية الأوروبية لتوفير التدريب الخبير في منصة MultiBac للعلماء الذين يرغبون في استخدام هذا النظام لدفع عجلة الإنتاج أبحاثهم. تم توضيح بنية ووظيفة عدة مجمعات البروتين التي كانت حتى الآن لا يمكن الوصول إليها باستخدام عينات المنتجة مع MultiBac. 4 في ما يلي، وتتلخص الخطوات الأساسية لإنتاج MultiBac في البروتوكولات كما هي الحال في عملية في منشأة MultiBac في EMBL غرونوبل.

<table border="1">
 <tbody>
 <tr>
 <td>Name of Reagent/Material</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalog Number</td>
 <td>Comments</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Bluo-Gal</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>15519-028 (1 g)</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tetracycline</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>UT2965-B (25 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Kanamycine</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0420 (25 g)</td>
 <td>1,000X at 50 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gentamycine</td>
 <td>SIGMA</td>
 <td>G3632 (5 g)</td>
 <td>1,000X at 10 mg/ml</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>IPTG</td>
 <td>Euromedex</td>
 <td>EU0008-B (5 g)</td>
 <td>1,000X at 1M</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Cre-recombinase</td>
 <td>New England BioLabs</td>
 <td>M0298</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>X-Treme GENE HP transfection reagent</td>
 <td>Roche</td>
 <td>06 366 236 001</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hyclone SFM4 Insect</td>
 <td>Thermo Scientific</td>
 <td>SH 30913.02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>6-well plate Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>353046</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357507</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>5 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357543</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357551</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>25 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357535</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml pipette Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>357550</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>50 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352070</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>15 ml tube Falcon</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>352096</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>1.8 ml cryotube Nunc</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>55005</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>100 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211917</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>250 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211918</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>500 ml shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211919</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2 L shaker flasks Pyrex</td>
 <td>Dominique Dutscher</td>
 <td>211921</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Certomat Orbital Shaker + plateau</td>
 <td>Sartorius</td>
 <td>4445110, 4445233</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Liquid nitrogen tank dewar 35 L</td>
 <td>Fisher Scientific</td>
 <td>M76801</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Biological Safety Cabinet Faster</td>
 <td>Sodipro</td>
 <td>FASV20000606</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Optical Microscope</td>
 <td>Zeiss</td>
 <td>451207</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Sf21 Insect cells</td>
 <td></td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Hi5 Insect cells</td>
 <td>Invitrogen</td>
 <td>B855-02</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Tecan freedom EVO running Evoware plus</td>
 <td>TECAN</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>10 &mu;l conductive tips (black),</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 516</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>200 &mu;l conductive tips (black)</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 612 510</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>disposable trough for reagents, 100 ml</td>
 <td>TECAN</td>
 <td>10 613 049</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>twin.tec PCR plate 96, skirted</td>
 <td>Eppendorf</td>
 <td>0030 128.648</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 well V bottom, non sterile</td>
 <td>BD falcon</td>
 <td>353263</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate color natural, PP)</td>
 <td>Fisher</td>
 <td>M3752M</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PS microplate, 96 well flat bottom</td>
 <td>Greiner</td>
 <td>655101</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>96 deepwell plate</td>
 <td>Thermo scientific</td>
 <td>AB-0932</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>24 well blocks RB</td>
 <td>Qiagen</td>
 <td>19583</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DpnI restriction enzyme</td>
 <td>NEB</td>
 <td>R0176L</td>
 <td>20 U/uL</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>NEBuffer 4 10X</td>
 <td>NEB</td>
 <td>B7004S</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix HF</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-531L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>2X phusion mastermix GC</td>
 <td>Finnzyme</td>
 <td>ref F-532L</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DGLB 1.5X</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td>7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF</td>
 </tr>
 <tr>
 <td>High DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10496-016</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Low DNA Mass Ladder for e-gel</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>10068-013</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>E-gel 48 1% agarose GP</td>
 <td>Life Technologies</td>
 <td>G8008-01</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 708.24</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract</td>
 <td>Macherey Nagel</td>
 <td>740 707.2</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Gotaq green master mix</td>
 <td>Promega</td>
 <td>M7113</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>T4 DNA polymerase, LIC-qualified</td>
 <td>Novagen</td>
 <td>70099-3</td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>DTT 100 mM</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>Urea 2 M</td>
 <td>homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>EDTA 500 mM pH 8.0</td>
 <td>Homemade</td>
 <td></td>
 <td></td>
 </tr>
 <tr>
 <td>LB broth (Miller) 500 g</td>
 <td>Athena ES</td>
 <td>103</td>
 <td></td>
 </tr>
 </tbody>
</table>

the multibac protein complex production platform at the embl

أظهرت أبحاث البروتينات تعقيد رائعة من proteomes حقيقية النواة بالتفصيل لم يسبق لها مثيل. وهو الآن فكرة مقبولة عموما أن البروتينات في خلايا موجودة في الغالب لا ككيانات منعزلة، بل ممارسة النشاط البيولوجي في الجمعية مع العديد من البروتينات الأخرى، في البشر عشرة أو أكثر، وتشكيل خطوط التجميع في الخلية لمعظم إن لم يكن جميع الوظائف الحيوية. 1 ، يتطلب 2 معارف وظيفة والهندسة المعمارية لهذه الجمعيات multiprotein تقديمها في الجودة والكمية كافية لتحليل مفصل. قلة من العديد من مجمعات البروتين في الخلايا، ولا سيما في حقيقيات النوى، ويحظر استخراجها من مصادر الأم، ويتطلب إنتاج المؤتلف. وقد ثبت التعبير نظام ناقلات الفيروسة العصوية (BEVS) أن يكون مفيدا بشكل خاص لإنتاج بروتينات حقيقية النواة، النشاط الذي عادة ما يعتمد على معالجة ما بعد متعدية التي غالبا ما يمكن لنظم التعبير الأخرى المستخدمة بشكل شائعلا يدعم. 3 BEVS استخدام باكولوفيروس المؤتلف في التي تم إدراج الجينات في المصالح لتصيب مزارع الخلايا الحشرات التي بدورها تنتج البروتين في الاختيار. MultiBac هو BEVS التي تم مصممة بشكل خاص لإنتاج مجمعات البروتين حقيقية النواة التي تحتوي على العديد من الوحدات الصغرى. 4 شرط أساسي وحيوي لكفاءة الإنتاج من البروتينات والمجمعات هم بروتوكولات قوية لجميع الخطوات المتبعة في تجربة تعبير مثالي يمكن تنفيذها في إجراءات التشغيل القياسية (إجراءات العمل الموحدة) ويليه أيضا من قبل المستخدمين غير المتخصصين مع سهولة نسبية. منصة MultiBac في مختبر علم الأحياء الجزيئي الأوروبي (EMBL) يستخدم إجراءات العمل الموحدة لجميع الخطوات المتبعة في تجربة التعبير معقدة multiprotein، بدءا من الإدراج من الجينات إلى الجينوم baculoviral هندسيا الأمثل لخصائص إنتاج البروتين مغايرة للتحليل على نطاق صغير من البروتين العينات المنتجة. 5-8 المنصةيتم تثبيت في وضع الوصول مفتوحة في EMBL غرونوبل، ودعمت العديد من العلماء من الأوساط الأكاديمية والصناعة لتسريع المشاريع البحثية المعقدة البروتين.

يتم عرض قوي شارك في التعبير عن البروتينات مغاير من قبل النظام MultiBac المحرز في 1D الشكل (تحقيقات أخذ 48 ساعة بعد اصابة ثقافة الخلية تعليق). نطاقات البروتين بإفراط (overexpressed) بشكل واضح ملحوظ في استخراج خلية كاملة (SNP) والمحللة تطهيرها (SN). نوعية وكمية من المواد إنتاج ا...

Watch this Scientific Journal Video about The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL at JoVE.com

The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثابة منصة مفتوحة الوصول، وإجراءات التشغيل القياسية وضعت لتعظيم فائدتها.

على البروتين MultiBac مجمع منصة الإنتاج في EMBL

Proteomics  research revealed the impressive complexity of eukaryotic proteomes in  unprecedented detail. It is now a commonly accepted notion that ...

the-multibac-protein-complex-production-platform-at-the-embl

Research

JoVE Journal

Biology

15.8K Views.  EMBL Grenoble Outstation and Unit of Virus Host Cell Interactions (UVHCI) UMR5322. مجمعات البروتين تحفيز الوظائف الخلوية الرئيسية. مفصلة توصيف وظيفي وهيكلي للعديد من المجمعات الأساسية يتطلب إنتاج المؤتلف. MultiBac هو نظام خلية الفيروسة العصوية / الحشرات مصممة بشكل خاص للتعبير عن البروتينات حقيقية النواة والمجمعات الخاصة بهم. تم تنفيذ MultiBac بمثاب?...

Video: The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of the stomach is defined by the mouth opening and the posterior end by the bottom of the pylorus. Along the dorsal side of the stomach lies the stomatogastric nervous system (STNS). This nervous system, which contains rhythmic networks that underlie feeding behavior, is an established model system for studying rhythm generating networks and neuromodulation 1,2. While it is possible to study this system in vivo 3, the STNS continues to produce its rhythmic activity when isolated in vitro. In order to study this system in vitro the stomach must be removed from the animal. This video article describes how the stomach can be dissected from the American lobster. In an accompanying video article4 we demonstrate how the STNS can be isolated from the stomach.

Gross Dissection of the Stomach of the Lobster, Homarus Americanus

We describe the gross dissection of the stomach of the American lobster (Homarus americanus).

إجمالي تشريح المعدة من جراد البحر ، Homarus Americanus</em

The stomach of the American lobster (Homarus americanus) is located in the cephalothorax, between the rostrum and the cervical groove. The anterior end of ...

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents (Methanol, Ethanol or 2-Propanol) and acetic acid are used for fixation, staining and destaining of proteins in a gel after SDS-PAGE. To speed up the procedure, heating the staining solution in the microwave oven for a short time is frequently used. This usually results in evaporation of toxic or hazardous Methanol, Ethanol or 2-Propanol and a strong smell of acetic acid in the lab which should be avoided due to safety considerations. In a protocol originally published in two patent applications by E.M. Wondrak (US2001046709 (A1), US6319720 (B1)), an alternative composition of the staining solution is described in which no organic solvent or acid is used. The CBB is dissolved in bidistilled water (60-80mg of CBB G-250 per liter) and 35 mM HCl is added as the only other compound in the staining solution. The CBB staning of the gel is done after SDS-PAGE and thorough washing of the gel in bidistilled water. By heating the gel during the washing and staining steps, the process can be finished faster and no toxic or hazardous compunds are evaporating. The staining of proteins occurs already within 1 minute after heating the gel in staining solution and is fully developed after 15-30 min with a slightly blue background that is destained completely by prolonged washing of the stained gel in bidistilled water, without affecting the stained protein bands.

A short protocol for protein staining with Coomassie Brilliant Blue (CBB) G-250 in polyacrylamide gels is described without using organic solvents or acetic acid as in the classical staining procedures with CBB.

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based fractionation. The system is comprised of single-use, 8-sample capacity cartridges and a benchtop GELFREE Fractionation Instrument. During separation, a constant voltage is applied between the anode and cathode reservoirs, and each protein mixture is electrophoretically driven from a loading chamber into a specially designed gel column gel. Proteins are concentrated into a tight band in a stacking gel, and separated based on their respective electrophoretic mobilities in a resolving gel. As proteins elute from the column, they are trapped and concentrated in liquid phase in the collection chamber, free of the gel. The instrument is then paused at specific time intervals, and fractions are collected using a pipette. This process is repeated until all desired fractions have been collected. If fewer than 8 samples are run on a cartridge, any unused chambers can be used in subsequent separations.
This novel technology facilitates the quick and simple separation of up to 8 complex protein mixtures simultaneously, and offers several advantages when compared to previously available fractionation methods. This system is capable of fractionating up to 1mg of total protein per channel, for a total of 8mg per cartridge. Intact proteins over a broad mass range are separated on the basis of molecular weight, retaining important physiochemical properties of the analyte. The liquid phase entrapment provides for high recovery while eliminating the need for band or spot cutting, making the fractionation process highly reproducible1.

The accompanying video describes the use of the GELFREE 8100 Fractionation System, which partitions complex protein samples on the basis of molecular weight and recovers the fractions in liquid phase. The video describes how the technology works, how it is used, and provides resultant data, with polyacrylamide gel electrophoresis analysis of fractionated bovine liver homogenate.

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

إنتاج نسيج [ميكروأرس]، وتلطيخ المناعية والتكنولوجيا الرقمية وضمن أطلس البروتين البشري

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

A Convenient and General Expression Platform for the Production of Secreted Proteins from Human Cells

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. However, prokaryotic hosts are often not as appropriate for expression of human, viral or eukaryotic proteins due to toxicity of the foreign macromolecule, differences in the protein folding machinery, or due to the lack of particular co- or post-translational modifications in bacteria. Expression systems based on yeast (P. pastoris or S. cerevisiae) 1,2, baculovirus-infected insect (S. frugiperda or T. ni) cells 3, and cell-free in vitro translation systems 2,4 have been successfully used to produce mammalian proteins. Intuitively, the best match is to use a mammalian host to ensure the production of recombinant proteins that contain the proper post-translational modifications. A number of mammalian cell lines (Human Embryonic Kidney (HEK) 293, CV-1 cells in Origin carrying the SV40 larget T-antigen (COS), Chinese Hamster Ovary (CHO), and others) have been successfully utilized to overexpress milligram quantities of a number of human proteins 5-9. However, the advantages of using mammalian cells are often countered by higher costs, requirement of specialized laboratory equipment, lower protein yields, and lengthy times to develop stable expression cell lines. Increasing yield and producing proteins faster, while keeping costs low, are major factors for many academic and commercial laboratories.
Here, we describe a time- and cost-efficient, two-part procedure for the expression of secreted human proteins from adherent HEK 293T cells. This system is capable of producing microgram to milligram quantities of functional protein for structural, biophysical and biochemical studies. The first part, multiple constructs of the gene of interest are produced in parallel and transiently transfected into adherent HEK 293T cells in small scale. The detection and analysis of recombinant protein secreted into the cell culture medium is performed by western blot analysis using commercially available antibodies directed against a vector-encoded protein purification tag. Subsequently, suitable constructs for large-scale protein production are transiently transfected using polyethyleneimine (PEI) in 10-layer cell factories. Proteins secreted into litre-volumes of conditioned medium are concentrated into manageable amounts using tangential flow filtration, followed by purification by anti-HA affinity chromatography. The utility of this platform is proven by its ability to express milligram quantities of cytokines, cytokine receptors, cell surface receptors, intrinsic restriction factors, and viral glycoproteins. This method was also successfully used in the structural determination of the trimeric ebolavirus glycoprotein 5,10.
In conclusion, this platform offers ease of use, speed and scalability while maximizing protein quality and functionality. Moreover, no additional equipment, other than a standard humidified CO2 incubator, is required. This procedure may be rapidly expanded to systems of greater complexity, such as co-expression of protein complexes, antigens and antibodies, production of virus-like particles for vaccines, or production of adenoviruses or lentiviruses for transduction of difficult cell lines.

In the post-human genomics era, the availability of recombinant proteins in native conformations is crucial to structural, functional and therapeutic research and development. Here, we describe a test- and large-scale protein expression system in human embryonic kidney 293T cells that can be used to produce a variety of recombinant proteins.

ومنهاج عمل مريحة والتعبير العام لانتاج البروتينات يفرز من خلايا الإنسان

Recombinant protein expression in bacteria, typically E. coli, has been the most successful strategy for milligram quantity expression of proteins. ...

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities. It is particularly useful for those compounds which possess therapeutic value but cannot be sufficiently produced or would benefit from an improved form of production. The experimental procedures involved can be subdivided into three components: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each experimental component is under continual optimization to meet the challenges and anticipate the opportunities associated with this emerging approach.
Heterologous biosynthesis begins with the identification of a genetic sequence responsible for a valuable natural product. Transferring this sequence to a heterologous host is complicated by the biosynthetic pathway complexity responsible for product formation. The antibiotic erythromycin A is a good example. Twenty genes (totaling &gt;50 kb) are required for eventual biosynthesis. In addition, three of these genes encode megasynthases, multi-domain enzymes each ~300 kDa in size. This genetic material must be designed and transferred to E. coli for reconstituted biosynthesis. The use of PCR isolation, operon construction, multi-cystronic plasmids, and electro-transformation will be described in transferring the erythromycin A genetic cluster to E. coli.
Once transferred, the E. coli cell must support eventual biosynthesis. This process is also challenging given the substantial differences between E. coli and most original hosts responsible for complex natural product formation. The cell must provide necessary substrates to support biosynthesis and coordinately express the transferred genetic cluster to produce active enzymes. In the case of erythromycin A, the E. coli cell had to be engineered to provide the two precursors (propionyl-CoA and (2S)-methylmalonyl-CoA) required for biosynthesis. In addition, gene sequence modifications, plasmid copy number, chaperonin co-expression, post-translational enzymatic modification, and process temperature were also required to allow final erythromycin A formation.
Finally, successful production must be assessed. For the erythromycin A case, we will present two methods. The first is liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS) to confirm and quantify production. The bioactivity of erythromycin A will also be confirmed through use of a bioassay in which the antibiotic activity is tested against Bacillus subtilis. The assessment assays establish erythromycin A biosynthesis from E. coli and set the stage for future engineering efforts to improve or diversify production and for the production of new complex natural compounds using this approach.

The Logic, Experimental Steps, and Potential of Heterologous Natural Product Biosynthesis Featuring the Complex Antibiotic Erythromycin A Produced Through E. coli

The heterologous biosynthesis of erythromycin A through E. coli includes the following experimental steps: 1) genetic transfer; 2) heterologous reconstitution; and 3) product analysis. Each step will be explained in the context of the motivation, potential, and challenges in producing therapeutic natural products using E. coli as a surrogate host.

المنطق، خطوات التجريبية، وإمكانية البناء الحيوي المنتج من غيري الطبيعية وتتميز هذه الاريثروميسين مجمع المضادات الحيوية المنتجة من خلال A<em&gt; E. القولونية</em

The heterologous production of complex natural products is an approach designed to address current limitations and future possibilities.  It is ...

Protein Isolation from the Developing Embryonic Mouse Heart Valve Region

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis method may not be sufficiently sensitive to detect a protein of interest. To overcome these difficulties, we examined protocols for obtaining protein from adult human cardiac valves and modified these protocols for the developing early embryonic mouse counterparts. In brief, the mouse embryonic aortic valve regions, including the aortic valve and surrounding aortic wall, are collected in the minimal possible volume of a Tris-based lysis buffer with protease inhibitors. If required based on the breeding strategy, embryos are genotyped prior to pooling four embryonic aortic valve regions for homogenization. After homogenization, an SDS-based sample buffer is used to denature the sample for running on an SDS-PAGE gel and subsequent western blot analysis. Although the protein concentration remains too low to quantify using spectrophotometric protein quantification assays and have sample remaining for subsequent analyses, this technique can be used to successfully detect and semi-quantify phosphorylated proteins via western blot from pooled samples of four embryonic day 13.5 mouse aortic valve regions, each of which yields approximately 1 &#956;g of protein. This technique will be of benefit for studying cell signaling pathway activation and protein expression levels during early embryonic mouse valve development.

The analysis of protein expression in young embryonic mouse valves has been hampered by the limited tissue available. This manuscript provides a protocol for preparing protein from developing embryonic mouse valve regions for western blot analysis.

عزل بروتين من الفأر الجنينية القلب صمام منطقة نامية

Western blot analysis is a commonly employed technique for detecting and quantifying protein levels. However, for small tissue samples, this analysis ...

Quantitative Immunofluorescence Assay to Measure the Variation in Protein Levels at Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to facilitate sensory functions in cells. The level of a protein may be regulated differently at centrosomes than at other .cellular locations, and the variation in the centrosomal level of several proteins at different points of the cell cycle appears to be crucial for the proper regulation of centriole assembly. We developed a quantitative fluorescence microscopy assay that measures relative changes in the level of a protein at centrosomes in fixed cells from different samples, such as at different phases of the cell cycle or after treatment with various reagents. The principle of this assay lies in measuring the background corrected fluorescent intensity corresponding to a protein at a small region, and normalize that measurement against the same for another protein that does not vary under the chosen experimental condition. Utilizing this assay in combination with BrdU pulse and chase strategy to study unperturbed cell cycles, we have quantitatively validated our recent observation that the centrosomal pool of VDAC3 is regulated at centrosomes during the cell cycle, likely by proteasome-mediated degradation specifically at centrosomes.

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein&#8217;s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

الكمية المناعي الفحص لقياس التفاوت في مستويات البروتين في Centrosomes

Centrosomes are small but important organelles that serve as the poles of mitotic spindle to maintain genomic integrity or assemble primary cilia to ...

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

الأخضر الفلورسنت القائم على البروتين التعبير فحص غشاء البروتينات في<em&gt; الإشريكية القولونية</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

CUBIC Protocol Visualizes Protein Expression at Single Cell Resolution in Whole Mount Skin Preparations

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium covering most of our body, and epidermal appendages such as the hair follicles and sweat glands. The epidermis undergoes regeneration throughout life and in response to injury. This is enabled by K14-expressing basal epidermal stem/progenitor cell populations that are tightly regulated by multiple regulatory mechanisms active within the epidermis and between epidermis and dermis. This article describes a simple method to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize K14 protein expression patterns, Ki67 labeled proliferating cells, Nile Red labeled sebocytes, and DAPI nuclear labeling at single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment and quantification of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines. The CUBIC protocol is the best method available to date to investigate molecular and cellular interactions in full thickness skin biopsies at single cell resolution.

This report describes a CUBIC protocol to clarify full thickness mouse skin biopsies, and visualize protein expression patterns, proliferating cells, and sebocytes at the single cell resolution in 3D. This method enables accurate assessment of skin anatomy and pathology, and of abnormal epidermal phenotypes in genetically modified mouse lines.

بروتوكول CUBIC يتصور التعبير البروتين في قرار خلية واحدة في كامل الاستعدادات الجلد جبل

The skin is essential for our survival. The outer epidermal layer consists of the interfollicular epidermis, which is a stratified squamous epithelium ...