وأيد هذا العمل من قبل على جائزة الابتكار النسور (ترتيب الشقيق النسور) ، ومؤسسة مايو كلينيك.

** يعتمد هذا البروتوكول على نشر الفيديو المرتبطين بها 1 : حساسية عالية الكشف والتحليل الكمي للتفاعلات البروتينات والبروتين والمجمعات multiprotein الأصلية بواسطة التدفق الخلوي. آدم زاي Schrum ، ديانا جيل ، P. Dopfer الين ، ديفيد ويست إل ، لورانس ألف Turka ، وولفغانغ WA Schamel ، إد بالمر. STKE العلم في 2007 (389) : PL2 ، 5 حزيران 2007 ، [DOI : 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">الرجاء النقر هنا لرؤية هذا المنشور</a> . قبل البدء ، وبعد تحضير ألبوم الحلول المائية : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MES توصيلات الاحتياطي : </td><td> تخزين في درجة حرارة 25 مئوية </td></tr><tr><td> MES ، ودرجة الحموضة 6.0 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> تبريد / حظر / التخزين (QBS) العازلة : </td><td> المحل في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1 ٪ </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> 0.02 ٪ </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FCM الاحتياطي : </td><td> المحل في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 100 ملي </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> 0.02 ٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5 ٪ </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table> إعداد مباشرة قبل الاستعمال : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EDAC - MES : </td><td> حل 50 ملغ / مل مسحوق EDAC في مخزن توصيلات MES </td></tr><tr><td> ديجيتونين حل (2 ٪ وزن / V) : </td><td> مسحوق يذوب في ديجيتونين درهم 2 O عن طريق التسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة 5min التبريد ثم على الجليد </td></tr><tr><td> تحلل الاحتياطي : </td><td></td></tr><tr><td> تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150 ملم </td></tr><tr><td> ديجيتونين الحل </td><td> 1 ٪ </td></tr><tr><td> مثبطات الأنزيم البروتيني </td><td> 1X </td></tr><tr><td> تبقي على الجليد </td><td></td></tr></tbody></table> 1. اقتران خريطة موقع لالخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز حبات من الأسهم المشتراة من قبل تمييع في برنامج تلفزيوني والفرز مع عدادة الكريات. تبدأ 1:10000 التخفيف من الخرز لفرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 18 × 10 6 حبات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 2 إلى 3 مرات في 0،5-1،0 مل الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط مجموعات الكربوكسيل على الخرز بإضافة 20 ميكرولتر من الطازجة MES - EDAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج برفق لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 25 مئوية بحلول pipetting يدويا صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات تنشيط 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حبات تنشيط برنامج تلفزيوني في 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من خريطة موقع IP (0،2-1،0 في تركيز الأسهم ملغ / مل) إلى الحل حبة تفعيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج لمدة 3 إلى 4 ساعات عند درجة 25 عن طريق وضع أنبوب على شاكر تهتز. بما فيه الكفاية لمنع زعزعة الاستقرار من الخرز على الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات خريطة موقع ، إضافة 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 100 مخزن QBS ميكرولتر. ويمكن تخزين هذه في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخرز جيدا ، وتمييع 1:200-1:10،000 في برنامج تلفزيوني والعد مع عدادة الكريات. يجب أن يكون قياس تركيز كل دفعة إعدادي ، بحيث يمكن لعدد من الخرز المستخدمة في كل تجربة أو IP المنسدلة التي تسيطر عليها بدقة. </li></ol> 2. آخر الحائزة إعداد Lysate والملكية الفكرية والأسلوب وتحلل الأوضاع تحلل الأمثل تعتمد على نوع من الخلايا والبروتين البروتين التفاعلات يجري فحصها. وهناك عدد من البروتوكولات موجودة ويمكن تعديلها لطلبك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز 20 × 10 6 &#39;الصغيرة&#39; الخلايا ، مثل الخلايا اللمفية ، أو 5 × 10 6 &#39;كبيرة&#39; الخلايا ، مثل الخلايا البلعمية الكبيرة أو الخلايا السرطانية ، في 100 ميكرولتر تحلل عازلة جديدة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ل20min على الجليد. مقياس حجم تحلل حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة النوى والحطام الخلوية غير قابلة للذوبان ، وأجهزة الطرد المركزي في lysate ز 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وطاف الاحتفاظ تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 × 10 5-2،5 X - 10 5 خريطة موقع يقترن الخرز lysate إلى توضيح ، pipetting برفق لالمزيج. حجم الحد الأدنى الذي نستخدمه لأداء IP واحد هو 5 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على رأسي 4 ساعات بالتناوب العجلة ليلة وضحاها في غرفة باردة. لتعيين سرعة كافية للحيلولة دون تسوية من الخرز. فمن المقبول بالنسبة للسيولة منخفضة حجم الشرطة العراقية أن تبقى في قاع الأنبوب أثناء الدوران. </li></ol> 3. تحقق من الخرزة التي تم الاستيلاء عليها ملون تألقي مع البروتين ، مترافق الأضداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات IP مرتين في 0،2-1،0 مل الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر FCM 20 ميكرولتر العازلة وقسامة في كل من خمسة أو أكثر أنابيب microcentrifuge 1.5 مل أو الآبار لوحة مدخنة القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ملون تألقي ، مترافق MABS للعينات. نفذ FCM صمة عار وفقا لتعليمات للبائع أو وفقا لتركيزات تحدد تجريبيا. كنقطة انطلاق ، إضافة 0،2-1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأسهم (في 0،2-1،0 ملغ / مل) في أنبوب أو جيدا ، واحتضان لمدة 40 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث تغسل حبات في 1.5 مل مرتين في أنابيب 1.0 مل الاحتياطي FCM الجليد الباردة ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. طاف إزالة بلطف بعد كل غسل ، مع الحرص على عدم تعكير صفو الخرز. لوحة مدخنة القاع ، ويغسل مرتين مع 0.2 مل من الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 1000g لمدة 5 دقائق حتى 4 بعد كل غسل درجة مئوية. A pipettor الأقنية مفيد لهذه الخطوة. لإزالة طاف من الخرز في صفيحة مدخنة القاع ، &#39;نفض الغبار&quot; لوحة واحدة ، ثم ، في حين لا تزال مقلوبة ، أي لطخة تقطر من حواف الآبار. حجم المتبقية في كل بئر ، الذي يحتوي على حبات ، وسوف تكون حوالي 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 200 مخزن FCM ميكرولتر لكل عينة. لأنابيب نقل FACS المسمى. نماذج جاهزة الآن لFCM. </li></ol> 4. FCM اقتناء حبات CML الموصوفة في هذا البروتوكول 3 إلى 5 ميكرون في القطر ، ما يقرب من نصف قطرها من اللمفاويات الماوس هادئة. لذلك ، قد يكون من الضروري زيادة يدويا مبعثر إلى الأمام (FSC) أمبير وكسب مبعثر الجانبية (SSC) الجهد من أجل سكان حبة لتسجيل الأحداث على نطاق واسع. ينبغي الخرز IP فردية تشكل احد سكان مجمع بإحكام. وينبغي تعديل الإعدادات وبوابة لاستبعاد doublets حبة والحطام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تشغيل أو معايير الخرز حبة ، إزالة الأكمام الاحتواء الحبرية التي تحيط مدخل عينة على بعض cytometers. تسمح السائل إلى غمد بالتنقيط بين العينات ، لأن هذا سيؤدي إلى مسح المدخل ، ومنع من الخرز يجري ترحيلها من عينة واحدة إلى أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخرز غير المسماة ، والسيطرة السلبية لمضان ، والجسيمات معايرة قوس قزح (عمليات التشاور الإقليمي) ، والسيطرة الإيجابية لمضان ، لضبط الإعدادات بحيث أن كلا من النهايات السلبية والإيجابية مضان تظهر في نفس الوقت على محور س تسجيل النطاق. هذا يضمن أن مضان من العينات التجريبية ستكون أيضا على نطاق واسع. علما بأن عمليات التشاور الإقليمي هي أصغر من حبات CML ، لذا FSC والمعلمات محكمة أمن الدولة ، فضلا عن موقف البوابة ، قد تحتاج إلى تغيير مؤقت لتلك العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى غير المسماة ، حبة الإعدادات مرة واحدة مع المعايرة اكتمال عمليات التشاور الإقليمي. إذا تم استخدام واحد فقط لكل عينة الفلورسنت التحقيق ، أي تعويض مضان ضروري. بشكل عام ، ونحن التحقيق مع المجمعات multiprotein خريطة موقع ملون تألقي ، مترافق عينة واحدة لكل FCM ، ونحن شركاء دراسة التفاعل تلطيخ عينات متعددة بواسطة حبة بالتوازي مع MABS محددة لمفارز مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب وحفظ ملفات البيانات مضان. ثم يمكن أن يؤديها باستخدام تحليل التدفق الخلوي البرمجيات مثل CellQuest ، FlowJo ، أو CFlow. </li></ol> 5. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="الشكل 1" /> الشكل 1. IP - FCM لمجمع multiprotein TCR/CD3. خلايا تي من سلالة الماوس وlysed BALB / ج في ديجيتونين 1 ٪ ، وتعرضت لlysate FCM - IP استخدام الألغام المضادة للCD3ε الخرز. الواردة في المجمعات استولت على كميات كبيرة من TCR - β (المنطقة الأرجواني) ، وشارك المرتبطة CD3 - ε (الأخضر) ، ولكن ، على مقربة من المستويات الخلفية (التي حددتها لجنة التحقيق المناعي لا صلة لها بالموضوع ، والوردي التتبع) من البروتينات الأخرى مثل Thy1.2 CD45 ، أو H - 2K (د) (البني والبرتقالي والأزرق وآثار ، على التوالي). انظر نتائج مماثلة نشرت سابقا 1-6.

<ol>
	<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry.">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains.">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li><li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8++memory+versus+effector+development.">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li><li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and/or+calcium+store+depletion.">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li><li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes.">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li></ol>

معلومات عن البروتين البروتين التفاعلات ذات الصلة للغاية لتحليل العديد من العمليات الخلوية مثل نقل الإشارة ، والنضج النسب ، تقدم دورة الخلية ، وشلالات موت الخلايا المبرمج. IP - FCM يوفر طريقة سريعة ، والكمية ، وحساسة لدراسة التفاعل بين البروتينات وتحديد أعضاء المجمعات multiprotein التشكل في وطنهم. ويمكن أن يترافق مع الخرز والمحتضنة lysates الخلية في يوم واحد ، ويمكن بحثها وتحليلها في اليوم التالي. تنسيق لوحة 96 - جيدا يسمح لأعداد كبيرة من عينات لتحليلها في وقت واحد لتوفير كفاءة جمع البيانات لأغراض إحصائية أو الفرز. باستخدام معايير حبة فلوري ، يمكن تقدير عدد من البروتينات التي استولت عليها في كل حبة. وهناك حاجة مادية ضئيلة للغاية من أجل القبض على مصدر والكشف ، وبالتالي لا تزال محدودة ، وعينات نادرة analytes يتم تحليلها لتفاعلات متعددة. على الرغم من أن الملكية الفكرية لا يتطلب FCM الهندسة الوراثية ، ووضع علامات حاتمة ، تمسخ ، أو في المختبر ، مزج البروتينات في بيئة غير فسيولوجية ، ويمكن أن يترافق مع هذه التقنيات وغيرها ، مما يجعلها أداة قيمة والوصول إلى تطبيق مع كثير من النظم البيولوجية. المشاكل : العديد من التجارب IP - FCM توليد بيانات مفيدة التفاعل البروتين المرة الأولى التي حاول فيها. ومع ذلك ، يمكن الاستفادة المثلى من FCM - IP تحسين تصريف الأجسام المضادة لالخرز ، والقبض على بروتين معقد ، والتحقيق الفلورسنت ملزمة. ويمكن تحديد كفاءة الاقتران الضد الملكية الفكرية من خلال التحقيق الخرز يقترن مباشرة مع الأضداد المضادة للالمناعي. إذا كان هذا هو الكفاءة المنخفضة ، ويمكن زيادة تركيز الأجسام المضادة خلال تفاعل الأضداد اقتران تسمح IP أكثر لنعلق على كل حبة. وهذا يمكن أن يزيد من قدرة ربط الدفعة حبة الملكية الفكرية ، مما أدى إلى القبض على تعزيز والكشف من analytes. ينبغي الأولية الأخرى التي تحتوي على جزيئات الأمينات (على سبيل المثال تريس ، ألبومين المصل البقري) لن يكون حاضرا أثناء اقتران رد فعل ، وهذه يمكن أن تتنافس مع خريطة موقع لمرفق حبة ويؤدي إلى اقتران خريطة موقع منخفض. إذا اقتران خريطة موقع ليثبت الخرز إشكالية لأسباب أخرى ، يمكن بدلا من ذلك إلى أن يقترن الخرز أفيدين / streptavidin ، والأجسام المضادة biotinylated يمكن في وقت لاحق غير محدد وتساهميا المستخدمة لimmunprecipitation. على الرغم من اقتران الأضداد جيدة ، قد كشف الأولي للحبة المرتبطة مضان تكون منخفضة. أولى ، قد تكون هي نفسها معقدة التقاط منخفضة. وذلك لأن IP - FCM يعتمد على تركيز من analytes ، وزيادة عدد الخلايا في حجم lysed تحلل زيادة حدة التقاط تحليلها والكشف. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم القبض على تعزيز من خلال خفض عدد من الخرز IP المحتضنة مع lysate ، التي توزع عبر المجمعات أسر أقل الخرز ، والنتائج في مضان زاد متوسط ​​لكل حبة عند بحثها. الثانية ، فمن الممكن أن يعرقل وصول sterically الضد التحقيق الى المجمعات التي استولت عليها immunoprecipitating الأضداد. في هذه الحالة ، يمكن أن تعالج المشكلة عن طريق استخدام أجسام مضادة مختلفة لالتقاط و / أو التحقيق.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>carboxylate-modified polystyrene latex (CML) beads (5mm surfactant-free)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Interfacial Dynamics Corporation/Molecular Probes</td>
<td>2-5000</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>Rainbow Calibration Particles</td>
<td>Reagent</td>
<td>Spherotech, Inc.</td>
<td>RCP-30-5A</td>
<td>Store at 4&deg;C.</td>
</tr>
<tr>
<td>2-[N-Morpholino] ethanesulfonic acid (MES)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>M-5287</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropl) carbodiimide HCl (EDAC)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Pierce Sigma</td>
<td>22980 E-6383</td>
<td>Store at -20&deg;C under desiccating conditions.</td>
</tr>
<tr>
<td>Protease Inhibitor General Use Cocktail, containing AEBSF, Bestatin, Aprotinin, EDTA, E-64, and Leupeptin</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma</td>
<td>P-2714</td>
<td> Prepare 100x stock solution in H2O. Aliquot and store at -20&deg;C. Handle with gloves.</td>
</tr>
<tr>
<td>PCR plates, 96-well 0.2mL, natural, tall chimney</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher</td>
<td>08-408-230</td>
<td>For use in place of microcentrifuge tubes during FCM staining</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

ip-fcm:  immunoprecipitation detected by flow cytometry

مناعي الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي (IP - FCM) هو وسيلة فعالة لكشف وقياس البروتين البروتين التفاعلات. المبدأ الأساسي الذي يمتد من شطيرة ELISA ، حيث يمكن الكشف عن القبض على الحليلة الابتدائية مع الجزيئات الأخرى المرتبطة بدنيا داخل المجمعات multiprotein. الإجراء ينطوي على اقتران التساهمية من اللاتكس microbeads البوليسترين immunoprecipitating مع الاجسام المضادة (ماب) معينة للحصول على البروتين من الفائدة ، واحتضان هذه الخرز مع lysates الخلية ، وسبر مجمعات البروتين ملون تألقي مع أسر ، مترافق تحقيقات وتحليل حبة المرتبطة مضان بواسطة التدفق الخلوي. IP - FCM حساس للغاية ، يتيح تحليل البروتينات في الدولة الأم (غير المعطل) ، وإما قابلة للتحليل الكمي أو شبه كمي. ومزايا إضافية ، IP - FCM لا يتطلب أي معدات أو الهندسة الوراثية المتخصصة وغيرها من تدفق عداد الكريات ، ويمكن تكييفها بسهولة للتطبيقات عالية الإنتاجية.

Watch this Scientific Journal Video about IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry at JoVE.com

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

ويقدم الأسلوب IP - FCM ، الذي يسمح للقوي وحساسة ، وتقييم من التفاعلات الكيميائية الحيوية البروتين البروتين الأصلي ، دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينة كبيرة.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K Views.  Mayo Clinic. ويقدم الأسلوب IP - FCM ، الذي يسمح للقوي وحساسة ، وتقييم من التفاعلات الكيميائية الحيوية البروتين البروتين الأصلي ، دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينة كبيرة.

Video: IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease mechanisms and may elucidate new markers to substratify disease with different clinical features and better understand pathogenesis. We have developed a highly quantitative method called Luciferase Immunoprecipitation Systems (LIPS) for profiling patient sera antibody responses to autoantigens and pathogen antigens associated with infection. Unlike ELISAs, the highly sensitive LIPS is easily implemented to survey humoral serological response profiles to different antigens in a universal format and produces dynamic antibody titer ranges up to 6 log10 for some antigens. In these studies, quantitative profiling by LIPS of patient humoral responses against panels of antigens or even the entire proteome of some pathogens (i.e. HIV), is typically more informative than testing a single antigen by ELISA. In addition, LIPS also eliminates time and effort needed to produce highly purified antigens as well as the labor-intensive assay optimization steps needed for standard ELISAs. Here we provide a detailed protocol describing the technical aspects of performing LIPS assays for readily profiling antibody responses to single or multiple antigens.

Antibody Profiling by Luciferase Immunoprecipitation Systems LIPS

The technical aspects of performing LIPS (Luciferase Immunoprecipitation Systems) are described. The overall approach involves expressing chimeric genes encoding antigens fused to Renilla luciferase (Ruc) in mammalian cells. Crude Ruc-antigen extracts are then prepared and, without purification, employed in immunoprecipitation assays to quantify antibodies.

التنميط الضد من قبل أنظمة مناعي Luciferase (الشفاه)

Technologies for comprehensively understanding and quantifying antibody profiles to autoantigens and infectious agents may yield new insights into disease ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces glucose uptake by insulin-sensitive tissues, most notably the brain, skeletal muscle, and adipocytes. Patients suffering from type-2 diabetes and/or obesity often develop insulin resistance and are unable to control their glucose homeostasis. New insights into the mechanisms of insulin resistance may provide new treatment strategies for type-2 diabetes.
The GLUT family of glucose transporters consists of thirteen members distributed on different tissues throughout the body1. Glucose transporter type 4 (GLUT4) is the major transporter that mediates glucose uptake by insulin sensitive tissues, such as the skeletal muscle. Upon binding of insulin to its receptor, vesicles containing GLUT4 translocate from the cytoplasm to the plasma membrane, inducing glucose uptake. Reduced GLUT4 translocation is one of the causes of insulin resistance in type-2 diabetes2,3.
The translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane can be visualized by immunocytochemistry, using fluorophore-conjugated GLUT4-specific antibodies.
Here, we describe a technique to quantify total amounts of GLUT4 translocation to the plasma membrane of cells during a chosen duration, using flow cytometry. This protocol is rapid (less than 4 hours, including incubation with insulin) and allows the analysis of as few as 3,000 cells or as many as 1 million cells per condition in a single experiment. It relies on anti-GLUT4 antibodies directed to an external epitope of the transporter that bind to it as soon as it is exposed to the extracellular medium after translocation to the plasma membrane.

This protocol describes a rapid technique to quantify the translocation of GLUT4 from the cytoplasm to the plasma membrane of cells by flow cytometry.

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Calcium is involved in numerous physiological and pathophysiological signaling pathways. Live cell imaging requires specialized equipment and can be time consuming. A quick, simple method using a flow cytometer to determine relative changes in cytosolic calcium in adherent epithelial cells brought into suspension was optimized.

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

Immunodetection of Outer Membrane Proteins by Flow Cytometry of Isolated Mitochondria

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and pathophysiology. This protocol describes a technique where mitochondria isolated from rodent tissue are immunolabeled and analyzed by flow cytometry. Mitochondria are isolated from rodent spinal cords and subjected to a rapid enrichment step so as to remove myelin, a major contaminant of mitochondrial fractions prepared from nervous tissue. Isolated mitochondria are then labeled with an antibody of choice and a fluorescently conjugated secondary antibody. Analysis by flow cytometry verifies the relative purity of mitochondrial preparations by staining with a mitochondrial specific dye, followed by detection and quantification of immunolabeled protein. This technique is rapid, quantifiable and high-throughput, allowing for the analysis of hundreds of thousands of mitochondria per sample. It is applicable to assess novel proteins at the mitochondrial surface under normal physiological conditions as well as the proteins that may become mislocalized to this organelle during pathology. Importantly, this method can be coupled to fluorescent indicator dyes to report on certain activities of mitochondrial subpopulations and is feasible for mitochondria from the central nervous system (brain and spinal cord) as well as liver.

Described here is a method to detect and quantify mitochondrial outer membrane proteins by immunolabeling of mitochondria isolated from rodent tissue and analysis by flow cytometry. This method can be extended to assess functional aspects of mitochondrial subpopulations.

مناعي للبروتينات الغشاء الخارجي بواسطة التدفق الخلوي من الميتوكوندريا المعزولة

Methods to detect and monitor mitochondrial outer membrane protein components in animal tissues are vital to study mitochondrial physiology and ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the controlled delivery of light to the cell sample and hence the most popular tools for optogenetic studies are microscopy-based cell analyses and in vitro experiments. The flow cytometer has major advantages over a microscope, including the ability to rapidly measure thousands of cells at single cell resolution. However, it is not yet widely used in optogenetics. Here, we present a device that combines the power of optogenetics and flow cytometry: the LED Thermo Flow. This device illuminates cells at specific wavelengths, light intensities and temperatures during flow cytometric measurements. It can be built at low cost and be used with most common flow cytometers. To demonstrate its utility, we characterized the photoswitching kinetics of Dronpa proteins in vivo and in real time. This protocol can be adapted to almost all optically controlled substances and substantially expands the set of possible experiments. More importantly, it will greatly simplify the discovery and development of new optogenetic tools.

LED Thermo Flow &amp;#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

Optically controlled substances are powerful tools to study signaling pathways. To expand the spectrum of possible experiments, we developed a device for studying optically controlled substances in real time using flow cytometry: the LED Thermo Flow.

LED الحرارية تدفق - الجمع بين علم البصريات الوراثي مع التدفق الخلوي

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

تحليل معلقات خلية معزولة من الأنسجة الصلبة من قبل الطيفي التدفق الخلوي

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

قياس اندوريدوبليكيشن بقياس التدفق الدرنات المعزولة بروتوبلاستس

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

قياس الإنتاجية العالية من ماكروبينوسيتوسيس ديسكويديوم ديكتيوستيليوم "التدفق الخلوي"

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...