Forschung in den Labors wird von der Fritz-Bender-Stiftung, München, Deutschland (TD) und einer von der Universität Witten / Herdecke internen Forschungsförderung (W.-KL) finanziert. Wir möchten Prof. Dr. Dr. Frank Thévenod (Institut für Physiologie, Pathophysiologie &amp; Toxikologie, Universität Witten / Herdecke) für hilfreiche Anregungen.

1. Vorbereitung der Reagenzien und Lösungen <ol><li> Bereiten Sie einen modifizierten Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS) (in mm: 136,9 NaCl, 5,37 KCl, 0,34 Na 2 HPO 4, 0,44 KH 2 PO 4, 4,17 NaHCO 3, pH 7,2, kein Phenol rot). Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Machen 1,5 M CaCl 2 und 2 M 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) (pH 7,2) Stammlösung unter Verwendung von destilliertem Wasser. </li><li> Bereiten Sie eine 250 mM Stammlösung von Probenecid. Für die Form der freien Säure (oft als wasserunlöslich), aufzulösen Probenecid Pulver in 1 N NaOH, zu füllen, um drei Viertel der endgültige Volumen mit destilliertem Wasser und langsam titriert auf pH 7,4 mit 1 N HCl. Lagerung bei 4 ° C. </li><li> Aufzulösen Fluoreszenzlässige Membran Calcium bindenden Farbstoff in wasserfreiem Dimethylsulfoxid (DMSO) auf eine Vorratskonzentration von 1 mM. Lagerung bei -20 ° C im Dunkeln. </li><li> Vor jedem Experiment frisch herzustellen Probenecid enthaltenden HBSS Fluss (PHF) Puffer durch Kombinieren modifizierter HBSS mit (Endkonzentrationen) 1,5 mM CaCl 2, 10 mM HEPES, pH 7,2, 5% fötales Rinderserum, 2 mM Probenecid und 5,55 mM Glucose. Warm bis 37 ° C. </li></ol> 2. Zellkultur <ol><li> Platte 2,5 x 10 5 Zellen des proximalen Tubulus der Niere (WKPT-0293 Cl.2) pro Well einer 6-Well-Platte oder 35 mm-Schale in Standardkulturmedium wachsen und für 2 Tage Erreichen einer Konfluenz von etwa 70%. </li></ol> 3. Calcium Dye Loading <ol><li> Für jede Vertiefung oder Schale, Mischungs 1 ml Kulturmedium, enthaltend 5% fötales Rinderserum, 4 uM zellpermeabel Calcium bindenden Farbstoff und 2 mM Probenecid. </li><li> Ersetzen des Kulturmediums mit 1 ml Ladepuffer Mischung in jede Vertiefung und Inkubieren bei 37 ° C für 30 min in einem befeuchteten Inkubator mit 5% CO 2. Die Platte mit Aluminiumfolie, um ein Ausbleichen der Fluoreszenzindikator verhindern. </li></ol> 4. Herstellung von Cells für die Durchflusszytometrie <ol><li> Warm 0,05% Trypsin-Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) -Lösung auf 37 ° C. </li><li> Saugen Calcium Ladefarbstofflösung aus jeder Vertiefung und 1 ml Trypsin entlang der Wand des Bohrlochs. </li><li> Inkubieren bei 37 ° C, bis alle Zellen abgelöst werden. </li><li> Übertragungszellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und Pellets durch Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge bei 10.000 g für 1 min. </li><li> Den Überstand vorsichtig absaugen, ohne das Pellet zu stören. </li><li> Wash-Zellen durch Zugabe von 1 ml PHF Puffer und resuspendieren durch Auf- und Abpipettieren. </li><li> Pellet-Zellen durch Zentrifugation bei 10.000 g für 1 min. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 4.6. und 4.7. zwei weitere Male. </li><li> Zellen in einem Endvolumen von 500 ul Puffer PHF und mit den Zellen für die Experimente innerhalb 1 Std. </li><li> Optional: count Zellen die Zellkonzentration zu bestimmen und 5 × 10 4 - 1x 10 5 Zellen pro Messung. </li></ol> 5. Fluss Cytometer-Setup <ol><li> Starten Sie das Durchflusszytometer, öffnen Sie die Fluidik Schublade und Flip das Entlüftungsventil Kippschalter um den Luftdruck der Hülle Fluidtank erhöhen. </li><li> &quot;Prime&quot; das Instrument, um potenzielle Wohnsitz Luftblasen aus dem Inneren der inneren Rohre und der Durchflusskammer zu entfernen. </li><li> In der Durchflusszytometrie Software, Open zwei Dot-Plot-Fenster. <ol><li> Die erste Punktdiagramm erfordert vorwärts gestreuten Licht (FSC) für den X-Parameter und Seitwärtsstreulicht (SSC) für die Y-Parameter, um die Qualität der Zellen innerhalb der Probe durch ihre Größe und ihre Granularität zu steuern. </li><li> Der zweite Punkt-Diagramm misst die Fluoreszenzintensität des Calcium-gebundene Farbstoff. Wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenzdetektionskanal für den Parameter Y über eine logarithmische Skala und Zeit in Sekunden für den Parameter X auf einer linearen Skala. </li></ol></li><li> Stellen Sie die Flussrate auf &quot;hoch&quot;. </li></ol> 6. Durchflusszytometrie Messung <ol><li> Führen die Messungen bei RT. In einer Durchflußcytometrieprobe Rohr (11,5 x 75 mm), fügen Sie 480 ul PHF Puffer. </li><li> In 20 ul Zellsuspension und kurz Vortex mischen. </li><li> Bewegen der Röhre Tragarm an der Seite und die Position der Probenröhre über dem Probeninjektionsrohr, bis eine dichte Abdichtung gebildet wird. Bringen Sie das Rohr Tragarm in seine ursprüngliche Mittelstellung. </li><li> Optimierung Messung durch Einstellen der Fluoreszenzkanal, so daß die mittlere Fluoreszenzintensität der Probe auf etwa 10 2 auf der y-Achse. Speichern und für spätere Experimente. </li><li> Um ein Experiment zu starten, wiederholen Sie die Schritte 6.1 bis 6.3. </li><li> Rekordfluoreszenzbasis für 50 sec. </li><li> Pause Messung, entfernen Sie das Probenröhrchen, fügen Verbindung von Interesse, kurz vortexen und zum Probeninjektionsrohr. Dieser Schritt sollte nicht länger als 15 sec. </li><li> Fortsetzen Messung und weiterhin für insgesamt 204,8 sec. </li><li> Verwenden Sie einen Kalzium ionophore wie Ionomycin (10 uM) und ein Calcium-Chelatbildner, wie beispielsweise Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA), MnCl 2 oder CoCl 2 (2 mM) für positive und negative Kontrollen. </li></ol> 7. Datenanalyse <ol><li> Analysieren von Daten mit dedizierten Durchflusszytometrie Software für die Offline-Analyse, wie WinMDI (Windows Multiple Document Interface für die Durchflusszytometrie), einer freien Software-Paket von Joe Trotter am Scripps Institute, Durchflusszytometrie Core Facility entwickelt. </li><li> Öffnen Sie ein Punktdiagramm mit SSC und FSC-Parameter. </li><li> Wählen Sie die Region der Zellen für die Analyse mit Hilfe der &quot;Regionen&quot; Werkzeug (Rechtsklick auf das Bild), um abgestorbene Zellen oder Zelltrümmer in der linken unteren Ecke von der Datenanalyse (Abbildung 1) auszuschließen. </li><li> Quadrant-Analyse (Figur 2) <ol><li> Öffnen einer Dichteverteilung mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen. </li><li> Unse die gleichen Gating Region wie in 7.3. </li><li> Quantifizieren Sie die Daten mit Hilfe der &quot;Quadrant&quot; -Tool. </li><li> Einstellen der Quadranten Separatoren, so daß die vertikale Linie zum Zeitpunkt der Zugabe der Verbindung gegeben, und die horizontale Linie in der Mitte des Grundfluoreszenz in den Kontrollen gegeben. Sicherzustellen, dass die Positionierung der Quadranten Separatoren in allen Proben gleich ist. </li><li> Der Prozentsatz an Zellen in jedem Quadranten ist in jeder Ecke (2) angezeigt. Vergleichen des oberen rechten Quadranten (UR) zwischen den Proben. </li></ol></li><li> Histogrammanalyse (Figur 3) <ol><li> Öffnet die Steuerdaten in einem Histogramm-Fenster mit der Fluoreszenzintensität auf der x-Achse und Ereignisse auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen. </li><li> Für eine Bildübersicht, fügen die Testdaten, um zu der Kontrollparzelle als Overlay Parzellen (weiter zu → Öffnen Sie Datei → Datei auswählen → Overlay-Datei) verglichen werden. </li><li> Für die quantitative Analyse einzelner Histogramm gewinnenster müssen verwendet werden. Tor der Zellpopulation mit der Region R1 aus Schritt 7.3. </li><li> In der nicht-behandelten Kontrolle, mit dem Marker-Funktion (&quot;Marker&quot;), um den Bereich für die Analyse ausgehend von dem Mittelpunkt zwischen dem minimalen und maximalen Fluoreszenz des Steuer Spitze und endet bei der maximalen Fluoreszenzintensität zu kennzeichnen. Der Prozentsatz an Zellen in diesem Bereich berechnet. </li><li> Abrufen von Daten aus dem Statistik-Fenster. Wiederholen Sie für verbleibende Datendateien mit dem gleichen markierten Bereich für die Analyse. </li></ol></li><li> Fluoreszenzintensitätsanalyse (Figur 4) <ol><li> Öffnen einer Dot-Plot mit der Zeit auf der x-Achse und die Fluoreszenzintensität auf der y-Achse. Nutzen Sie alle Veranstaltungen. </li><li> Enable &quot;Kinetics Mode&quot; und &quot;Overlay Kinetics Line&quot;. Eine blaue Linie in der Dot-Plot der mittleren Fluoreszenzintensität repräsentiert erscheinen. </li><li> Quantifizierung der relativen Calcium-Einstrom, indem Sie mehrere rechteckige Bereiche. Jede Region sollte awreite von etwa &quot;50&quot;, die gleichbedeutend mit &quot;10 sec&quot; ist. Definieren Sie bis zu 15 rechteckige Bereiche. </li><li> Abrufen Quantifizierung aus der Statistik-Fenster und kopieren Sie in eine Tabellenkalkulation. </li><li> Verwenden Sie die y-Mittelwert Daten für die Analyse. Berechnet den Mittelwert der R2 bis R6, die gleich 20 bis 50 sec ist. Dies ist der Ausgangswert. </li><li> Wählen eines geeigneten Zeitintervalls für Calcium-Einstrom-Analyse (abhängig von Beginn, Dauer und Intensität). </li><li> Berechnen der Calciumsignale aus jeder Region innerhalb dieses Zeitintervalls relativ zu dem mittleren Grundlinienwert, das heißt, das Fluoreszenzsignal vor Zugabe der Verbindung, die auf 100% gesetzt. Bestimmen Sie den Mittelwert und Standardabweichung der Regionen veröffentlichen Verbindung hinaus; Das ist die Durchschnittscalciumsignal durch die Verbindung hervorgerufen wird. </li></ol></li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Calcium ist ein Schlüsselereignis in mehreren Zellprozesse als second messenger-Signalmoleküls als auch als ein Mittel, um zwischen dem ER und Mitochondrien vermitteln wirkt. Die Fähigkeit, Änderungen in der freien cytosolischen Calciumkonzentrationen zu messen, ist eine nützliche Technik, die in allen Bereichen der Zellbiologie gelten können. Es gibt verschiedene Methoden, um cytosolische Calcium-Signale zu detektieren. Klassisch, Signale von einer ratiometrischen Calciumindikator, wie Fura-2, werden in lebenden ...

Calcium ist ein wichtiger sekundärer Botenstoff für die Übertragung von zellulären physiologischen und pathophysiologischen Signale 1 verantwortlich. Cytosolischen Calciumkonzentrationen werden durch die Aktivität der Calciumpumpen und Calciumtauscher gering gehalten. Das Sarkoplasma / Endoplasmatischen Retikulum Kalzium-ATPase (SERCA) füllt das endoplasmatischen Retikulum (ER) Calciumspeicher als Teil einer &quot;Pumpe Leck&quot; System, während die Plasmamembran Calcium ATPase (PMCA) extrudiert Calcium an den extrazellulären Raum, sowohl im ATP-abhängigen Weise 2. Physiologischen Botenstoffe, wie Hormone oder Neurotransmitter, übertragen ihre Signale über G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die Aktivierung von Phospholipase C, die Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) in der Plasmamembran hydrolysiert zu Diacylglycerol und Inositoltriphosphat (IP3) 3 zu erzeugen. Während Diacylglycerin in der Plasmamembran bleibt diffundiert IP3 in das Cytosol und bindet an IP3-Rezeptors (IP3Rs), die Liganden-aktivierten Calciumkanäle, in die ER-Membran und Calcium ist von dem ER luminalen Speicher die mit einer Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration 4 gelöst. Eine alternative Route für Calcium in das Cytosol zu erreichen, ist durch Calciumkanäle und Wärmetauscher in der Plasmamembran vorhanden sind. Übersprechen zwischen diesen beiden Fächern wurden beschrieben: Calcium induzierte Calciumfreisetzung (CICR), wo extrazelluläres Calcium induziert Calcium-Freisetzung aus ER speichert 5 und Speicher betrieben Calcium Eintrag (SOCE), wo Entleerung der ER speichert durch STIM erfasst und bewirkt Öffnung Orai Calcium-Kanäle in der Plasmamembran zu fördern Nachfüllen der ER speichert 6. Unter pathophysiologischen Bedingungen ist die zelluläre Kalziumantwort deregulierten und cytosolischen Calciumerhöhungen in Abwesenheit von physiologischen Stimulatoren 1. Die Calcium-Reaktion kann in einer Anzahl von Weisen beeinflusst werden: verlängerte CalciumSignal, verzögerte Calciumentfernung aus dem Cytosol, Erschöpfung der Kalziumspeichern oder lokalisierte Veränderungen der Kalzium. Darüber hinaus sind die Mitochondrien nehmen eine zentrale Rolle bei der Pufferung und der Freisetzung von Kalzium 7. Längerer und / oder supra zytosolischen Kalziumanstieg führt zum Zelltod. In der Tat ist Calcium öfter als nicht in der zellularen pathophysiologischen Antwort beteiligt und ist ein Schlüsselereignis in einer Vielzahl von Erkrankungen, wie von neurodegenerativen Erkrankungen, Herzerkrankungen, Krebs, Knochenerkrankungen und Nierenerkrankungen, die hauptsächlich mit Zelltod verbunden sind, und Verlust oder die Veränderung von Organ- oder Gewebefunktion 8-10. Darüber hinaus hat der Störungscalciumsignale an zellulären Anpassung und Veränderungen der zellulären Funktionen und Antworten verknüpft. Traditionell werden Calcium-Signale mit einem negativ geladenen fluoreszierenden Calcium-Indikator, der in einer Zelle durchlässigen Acetoxymethyl (AM) in Esterform in die Zellen geladen werden, wird gemessen. Einmal durch zelluläre Esteras gespaltenes bleiben die Fluoreszenzindikatoren innerhalb des intrazellulären Kompartiment und Erhöhung der Fluoreszenzintensität, wenn Kalzium gebunden ist. Die bekannteste und verwendet Calciumindikator ist die ratiometrische Fura-2 von Roger Tsien und Kollegen 11 entwickelt. Calcium-Indikatoren mit unterschiedlichen Affinitäten für Calcium erlauben verschiedene Calcium-Pools zu überwachen. Nachweismethoden umfassen Live Cell Imaging, Fluoreszenz Mikroplatten-Reader und Durchflusszytometrie. Die relativ schnelle Kinetik der Calciumsignale (in der Regel innerhalb von ein paar Sekunden bis Minuten) macht das Live Cell Imaging, die beste Methode für die Gewinnung die meisten Informationen über Eigenschaften des Calciumsignals. Abgesehen von der schnellen Kinetik der Kalzium-Signale (in Millisekunden), ist Live Cell Imaging eine bessere Methode zur Untersuchung von zellulären Kompartimentierung von Kalzium Signalisierung innerhalb einer einzelnen Zelle 12. Absolute Calciumkonzentrationen kann durch Bestimmung der minimalen und maximalen Fluoreszenz des Calcium ind berechnet werdenicator durch Zugabe eines Calcium-Chelators und Permeabilisierung der Zellen, die jeweils in der durch die Grynkiewicz et al. 11 beschrieben. Die Verwendung von Durchflusszytometrie zur Calcium-Signale zu messen wurde zuerst in den 1980er Jahren in der immunologischen Zellen entwickelt, bei denen die Möglichkeit, mehrere Parameter, wie die Membranintegrität und die Trennung der Zellpopulation, und dem Erfordernis der Zellen in Suspension in Verbindung mit der Entwicklung der einzelnen Wellenlänge zu messen Calcium Indikatoren Durchflusszytometrie einer idealen und convenientdetection Verfahren 13-15. In adhärenten Zellen, bietet Live Cell Imaging die meisten Informationen über Calcium-Signal, was am wichtigsten ist die Kinetik, erfordert jedoch ein kompliziertes Setup bestehend aus einem Fluoreszenzmikroskop, ein Perfusionssystem, Aufrechterhaltung der Zellumgebung, wie Temperatur, und spezialisierte Mikroskop-Software für den Erwerb und Analysieren von Daten. Alternative Verfahren, wie ein Fluoreszenzmikroplattenlesegerät oder Pharmacollogischen Mittel, durch Verwendung von Calciumchelatoren sind in Bezug auf die gewonnenen Informationen unvergleichlich. Durchflusszytometrie wird immer häufiger verwendet, um cytosolische Calcium in adhärenten Zellen, obwohl zu überwachen, in den meisten Studien nur Endpunktmessungen durchgeführt. Verwendung des Verfahrens zunächst von Gergely et al. In immunologischen B-Zellen 16, Änderungen in der cytosolischen freien Kalziumkonzentration mittels Durchflusscytometrie mit Echtzeit-Kinetik und die Überwachung der Fluoreszenzintensität in einzelnen Zellen aus einer Probenpopulation wurden erfolgreich bei Krebs epithelialen Zellen gemessen und Krebsstammzellhybriden 17. Dieses Verfahren wurde für die Verwendung in adhärenten Epithelzellen, die schwierig mit Calcium-Indikatoren 18 zu laden sind, angepasst. Hier mit einem verewigt adhärenten Zelllinie aus dem S1-Segment der Rattenniere proximalen Tubulus (WKPT-0293 Cl.2) 19 abgeleitet, beschreiben wir eine optimierte vereinfachte methode zur Messung von Änderungen in der cytosolischen Calciumkonzentration durch Durchflusszytometrie. Da viele Epithelzellen eine Reihe von organischen Transporter für anionische Verbindungen besitzen, können Beladung von Zellen mit einem Calcium-Indikator als eine Herausforderung sein. Um das Ausströmen von Kalzium-Indikatoren, Probenecid, der prototypischen Inhibitor der organisches Anion Transporter und ursprünglich entwickelt, um die renale Ausscheidung von Penicillin 20 verringern zu verhindern, wird gleichzeitig im Inkubationsmedium aufgetragen. Die Zellen werden in Monokalziumindikator geladen gehalten, in Suspension gebracht und Calciumsignale unmittelbar nach Zugabe der Verbindung detektiert werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Um cytosolischen Calcium zu erhöhen, wurden zwei pharmakologische Verbindungen zu Nieren proximalen Tubuluszellen (WKPT-0293 Cl.2) mit zellpermeablen Kalzium bindenden Farbstoff, Fluo-3-AM beladen angewendet. Unbehandelten Kontrollproben wurden mit Calcium bindenden Farbstoff in Gegenwart von Probenecid geladen und gemischt, aber ohne den Zusatz irgendwelcher Verbindungen. Thapsigargin (TG) ist ein klassisches Inhibitor der SERCA Pumpe führt, aus dem ER Leckage und zu erhöhten zytosolischen Calcium. Tunicamycin (TUN)...

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Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert.

Cytosolischen Calcium Messungen in Nierenepithelzellen mittels Durchflusszytometrie

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

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Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Aufrufe.  University of Witten/Herdecke.  Calcium ist in vielen physiologischen und pathophysiologischen Signalwegen beteiligt sind. Live Cell Imaging erfordert spezielle Geräte und kann zeitaufwendig sein. Eine schnelle, einfache Methode mit einem Durchflusszytometer, um relative Veränderungen in zytosolischen Kalzium in adhärenten Epithelzellen in Suspension gebracht bestimmen optimiert. 

Serie: Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

Chromatin Isolierung von RNA-Reinigung (Chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Forschung

Biologie

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Optimiert Färbung und Proliferation Modeling-Methoden für die Zellteilung Überwachung mit Cell-Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Schnelle Genetische Analyse von epithelial-mesenchymale Signaling Während Haarregeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Induktion und Analyse von epithelialen zu mesenchymalen Transition

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

High Efficiency Differenzierung von humanen pluripotenten Stammzellen zu Kardiomyozyten und Charakterisierung mittels Durchflusszytometrie

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Analyse von Zellsuspensionen isoliert von festen Geweben von Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Messung der Endoreduplikation durch Durchflusszytometrie von isolierten Knolle Protoplasten

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Hochdurchsatz-Messung von Dictyostelium Discoideum Macropinocytosis von Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...

Detecting and Characterizing Protein Self-Assembly In Vivo by Flow Cytometry

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from low-sensitivity, indirect read-outs, limited throughput, and/or population-level rather than single-cell resolution. We designed a flow cytometry-based single methodology that addresses all of these limitations: Distributed Amphifluoric FRET or DAmFRET. DAmFRET detects and quantifies protein self-assemblies by sensitized emission FRET in vivo, enables deployment across model systems-from yeast to human cells-and achieves sensitive, single-cell, high-throughput read-outs irrespective of protein localization or solubility.

This article describes a FRET-based flow cytometry protocol to quantify protein self-assembly in both S. cerevisiae and HEK293T cells.

Erkennung und Charakterisierung der Protein-Selbstmontage in Vivo durch Durchflusszytometrie

Protein self-assembly governs protein function and compartmentalizes cellular processes in space and time. Current methods to study it suffer from ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

Messung des mitochondrialen Masse- und Membranpotenzials in hämatopoetischen Stammzellen und T-Zellen durch Durchflusszytometrie

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...