Laboratuvarlarda araştırma Fritz-Bender Vakfı, Münih, Almanya (TD) ve (W.-KL) Witten / Herdecke iç araştırma bursu bir üniversite tarafından finanse edilmektedir. Biz yararlı önerileri için (Fizyoloji, Patofizyoloji ve Toksikoloji, Witten Üniversitesi / Herdecke için Institute) Prof Dr. Frank Thévenod teşekkür etmek istiyorum.

Reaktifler ve Çözümleri 1. Hazırlık <ol><li> Değiştirilmiş bir Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) hazırlanması (mM olarak: 136,9 NaCl, 5.37 KCI, 0.34 Na 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17 NaHCO 3, pH 7.2, fenol kırmızı). 4 ° C&#39;de muhafaza. </li><li> 1.5 M CaCI2 ve 2 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansülfonik asit (HEPES) (pH 7.2) damıtılmış su kullanılarak stok çözeltileri olun. </li><li> Probenesid, bir 250 mM stok çözelti hazırlayın. , 1 N NaOH içinde probenesid tozu çözmek damıtılmış su ile son hacminin dörtte üçüne kadar doldurun ve yavaşça 1 N HCI ile pH 7.4&#39;e titre edilir, serbest asit şekli için (suda çözünür olarak atfedilen). 4 ° C&#39;de muhafaza. </li><li> 1 mM&#39;lik bir stok konsantrasyona susuz dimetil sülfoksit (DMSO) içinde flüoresan membran geçirgen kalsiyum bağlama boya çözülür. Karanlıkta -20 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Her deneyden önce taze hazırlanması probenesid içeren HTarafından BSS akı (PHF) tamponu (nihai konsantrasyonda), 1.5 mM CaCl2, 10 mM HEPES, pH 7.2,% 5 fetal sığır serumu, 2 mM probenesid ve 5.55 mM glükoz ile HBSS modifiye birleştirilmesi. 37 ° C de ısıtılır. </li></ol> 2. Hücre Kültürü <ol><li> Standart kültür ortamı içinde bir 6 yuvalı plaka, 35 mm tabak başına iyi Levha, 2.5 x 10 5 böbrek proksimal tübül hücreleri (WKPT-0293 CL.2) ile yaklaşık% 70 arasında bir akışkanlığa eriştikten 2 gün süre ile büyür. </li></ol> 3. Kalsiyum Boya Yükleme <ol><li> Her bir göze ya da çanak için,% 5 fetal sığır serumu, 4 uM hücreden geçebilen kalsiyum bağlama boya ve 2 mM probenesit içeren 1 ml kültür ortamı karıştırın. </li><li> Her bir 1 ml dolum boya karışımı ile, kültür ortamı yerine ve% 5 CO2 ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde, 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edin. Flüoresan göstergesi ağartma engellenmesi için alüminyum folyo ile plaka örtün. </li></ol> Ce 4. hazırlanmasıAkış Sitometrinin için lls <ol><li> 37 ° C&#39;ye ısınmaya% 0.05 tripsin etilendiamintetraasetik asit (EDTA) çözeltisi. </li><li> Aspire kalsiyum yükleme boyası, her kuyudan çözeltisi ve kuyunun duvarı boyunca 1 mi tripsin ekleyin. </li><li> Tüm hücreler müstakil kadar 37 ° C&#39;de inkübe edilir. </li><li> 1 dakika için 10,000 g&#39;da bir mikrosantrifüj içinde santrifüjleme ile 1.5 ml tüp ve pelet hücreleri aktarın. </li><li> Dikkatle pelet bozmadan süpernatant aspire. </li><li> Yukarı ve aşağı pipetleme 1 ml PHF&#39;ye tampon ve tekrar süspansiyon ekleyerek hücreleri yıkayın. </li><li> 1 dakika için 10,000 g&#39;da santrifüj ile pelet hücreleri. </li><li> Tekrarlayın 4.6 adımları. ve 4.7. Bir başka iki kere verilir. </li><li> 500 ul PHF tamponu nihai hacim içinde hücrelerin yeniden süspanse edin ve 1 saat içinde deney için hücreleri kullanır. </li><li> İsteğe bağlı: sayımı hücreleri hücre konsantrasyonunu belirlemek ve 5 x 10 4 kullanımı - ölçüm başına 1 x 10 5 hücre. </li></ol> 5. Akış Cytometer Kur <ol><li> , Sitometresinin akışını başlatmak fluidik çekmeceyi açın ve kılıf sıvısı tankının hava basıncı artırmak için havalandırma valfi geçiş anahtarı çevirmek. </li><li> &quot;Prime&quot; iç boru ve akış yönlendirme odacığı içinde potansiyel oturduğu hava kabarcıklarını çıkarmak için cihaz. </li><li> Akış sitometri yazılımında, açık iki nokta arsa pencereler. <ol><li> Birinci nokta örgüsü, sırasıyla, büyüklüğüne ve boyu yoluyla numune içindeki hücrelerin kalitesi kontrol etmek için Y parametresi için X parametresi ve yan saçılan ışığa (SSC) için saçılan ışık (FSC) gerektirir. </li><li> İkinci nokta arsa kalsiyum bağlanmış boya floresans yoğunluğunu ölçer. Doğrusal bir ölçek üzerinde X parametresi için saniyede bir logaritmik ölçek ve zaman kullanarak Y parametresi için uygun floresan algılama kanalı seçin. </li></ol></li><li> &#39;Yüksek&#39; olarak akış hızını ayarlayın. </li></ol> 6. Akım Sitometri Measurement <ol><li> RT&#39;de ölçümleri yapın. Örnek tüpü (11.5 x 75 mm) sitometri akışı olarak, 480 ul, PHF tampon ekleyin. </li><li> Karıştırmak için 20 ul hücre süspansiyonu ve kısaca vorteks ekleyin. </li><li> Tarafına, boru destek kolunu hareket ve bir sıkı conta oluşana dek örnek enjeksiyon borusu üzerindeki numune tüpü yerleştirin. Orijinal merkezli konumuna boru destek kolunu dönün. </li><li> Numunenin ortalama florasan yoğunluğu yaklaşık 10 2 y-ekseni üzerinde olacak şekilde floresan kanalı ayarlayarak ölçümü optimize. Kaydedin ve daha sonraki deneyler için kullanılacak. </li><li> Bir denemeyi başlatmak için, tekrar 6,1-6,3 adımları. </li><li> 50 sn için rekor taban floresans. </li><li> Kısaca eklemek, ilgi, girdap bileşik örnek tüpü çıkarın ve örnek enjeksiyon tüp dönmek, ölçüm Pause. Bu adım fazla 15 saniye sürmez. </li><li> Ölçüm Devam ve 204,8 saniyelik bir toplam devam etmektedir. </li><li> Bir kalsiyum i kullanınonophore gibi iyonomisin (10 uM), ve etilen glikol tetraasetik asit (EGTA) gibi bir kalsiyum kenetleme maddesi, MnCl2 ve CoCl2 (2 nM), sırasıyla pozitif ve negatif kontroller için. </li></ol> 7. Veri analizi <ol><li> Böyle WınMDI (Akış Sitometrinin Windows Çoklu Belge Arabirimi), Scripps Enstitüsü&#39;nden, Sitometrisi Çekirdek Tesisi&#39;nde Joe Trotter tarafından geliştirilen ücretsiz bir yazılım paketi olarak çevrimdışı analiz için özel bir akış sitometri yazılımı kullanarak veri, analiz edin. </li><li> SSC ve FSC parametreleri ile bir nokta arsa açın. </li><li> &quot;Bölgeler&quot; aracını kullanarak analiz için hücrelerin bölgeyi seçin ölü hücreleri ya da veri analizi sol alt köşesinde bulunan hücre artıkları (Şekil 1) dışlamak için (resmin üzerine sağ tıklayın). </li><li> Quadrant analizi (Şekil 2) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman bir yoğunluk arsa açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> Bize7.3 olarak aynı yolluk bölgeyi e. </li><li> &quot;Quadrant&quot; aracını kullanarak, verileri niceliğini. </li><li> Dikey çizgi bileşiği, ilave bir zamanda ve yatay çizgi kontrollerde taban floresans ortasına yerleştirilir, böylece kadran ayırıcılar ayarlayın. Kadranda ayırıcılar konumlandırma tüm örneklerde eşit olduğundan emin olun. </li><li> Ayrıca herbir çeyrek içindeki hücrelerin yüzdesi her bir köşesinde (Şekil 2) olarak gösterilir. Örnekler arasındaki sağ üst kadranda (UR) karşılaştırın. </li></ol></li><li> Histogram analizi (Şekil 3) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve olaylar floresan yoğunluğu olan bir histogram pencerede kontrol verilerini açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> Resimsel bir bakış için, bindirme araziler olarak kontrol parseline (Dosya seç → Kaplama → Open File → Dosya gidin) karşılaştırılmak üzere test verileri ekleyin. </li><li> Kantitatif analiz için, tek histogram kazanmakCamlar kullanılmalıdır. Gate adım 7.3 bölgesi R1 kullanarak hücre popülasyonu. </li><li> Muamele edilmemiş kontrolde, azami floresan yoğunluğu olarak ve minimum kontrol pik maksimum floresans ve bitiş kısmı arasındaki orta nokta başlayarak analiz alanı işaretlemek için (&quot;marker&quot;) işareti işlevini kullanın. Bu bölgede hücrelerin yüzdesi hesaplanır. </li><li> Istatistik penceresinden veri almak. Analiz için aynı işaretli alana kullanarak veri dosyalarını geri kalan için tekrarlayın. </li></ol></li><li> Flüoresan yoğunluğu analizi (Şekil 4) <ol><li> Y-ekseni üzerinde x-ekseni ve floresan yoğunluğu ile zaman, bir nokta arsa açın. Tüm olayları kullanın. </li><li> &quot;Kinetik Modu&quot; ve &quot;Kaplama Kinetik Çizgi&quot; etkinleştirin. Mavi çizgi ortalama floresan yoğunluğu temsil nokta arsa görünecektir. </li><li> Birden fazla dikdörtgen bölgeler oluşturarak bağıl kalsiyum girişini niceliğini. Her bölge aw olmalıdır&quot;10 saniye&quot; eşdeğer &quot;50&quot;, yaklaşık bir likli. 15 dikdörtgen bölgelere kadar tanımlayın. </li><li> Istatistik penceresinden ölçümlerini almak ve bir tablo içine kopyalayın. </li><li> Analizi için y-ortalama veri kullanılır. 20 saniye 50 eşdeğerdir R6, R2 ila ortalamasını hesaplayın. Bu, temel değerdir. </li><li> Kalsiyum akını analizi (başlangıçlı, süresi ve yoğunluğuna bağlıdır) için uygun bir zaman aralığı seçin. </li><li> , Ortalama bazal değer, bu zaman aralığı, göreli içinde% 100 olarak ayarlanmış bileşik ilavesinden önce yani flüoresans sinyali, her bir bölgeden kalsiyum sinyallerini hesaplar. Bileşik ek sonrası ortalama ve bölgelerin standart sapmasını belirlemek; Bu bileşik ile uyarılmış ortalama kalsiyum sinyalidir. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling.">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li><li>Brini, M., Carafoli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+pumps+in+health+and+disease.">Calcium pumps in health and disease.</a> Physiol Rev. 89, 1341-1378 (2009).</li><li>Berridge, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+trisphosphate+and+calcium+signalling.">Inositol trisphosphate and calcium signalling.</a> Nature. 361, 315-325 (1993).</li><li>Putney, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+and+actions+of+calcium-mobilizing+messenger,+inositol+1,4,5-trisphosphate.">Formation and actions of calcium-mobilizing messenger, inositol 1,4,5-trisphosphate.</a> Am J Physiol. 252, 149-157 (1987).</li><li>Putney, J. W., Ribeiro, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+pathways+between+the+plasma+membrane+and+endoplasmic+reticulum+calcium+stores.">Signaling pathways between the plasma membrane and endoplasmic reticulum calcium stores.</a> Cell Mol Life Sci. 57, 1272-1286 (2000).</li><li>Soboloff, J., Rothberg, B. S., Madesh, M., Gill, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STIM+proteins:+dynamic+calcium+signal+transducers.">STIM proteins: dynamic calcium signal transducers.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 13, 549-565 (2012).</li><li>Williams, G. S., Boyman, L., Chikando, A. C., Khairallah, R. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondrial+calcium+uptake.">Mitochondrial calcium uptake.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 10479-10486 (2013).</li><li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria,+calcium+and+cell+death:+a+deadly+triad+in+neurodegeneration.">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787, 335-344 (2009).</li><li>Monteith, G. R., Davis, F. M., Roberts-Thomson, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+channels+and+pumps+in+cancer:+changes+and+consequences.">Calcium channels and pumps in cancer: changes and consequences.</a> J Biol Chem. 287, 31666-31673 (2012).</li><li>Roderick, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+in+the+heart:+when+it's+good,+it's+very+very+good,+but+when+it's+bad,+it's+horrid.">Calcium in the heart: when it's good, it's very very good, but when it's bad, it's horrid.</a> Biochem Soc Trans. 35, 957-961 (2007).</li><li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+generation+of+Ca2++indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties.">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> J Biol Chem. 260, 3440-3450 (1985).</li><li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cilioplasm+is+a+cellular+compartment+for+calcium+signaling+in+response+to+mechanical+and+chemical+stimuli.">Cilioplasm is a cellular compartment for calcium signaling in response to mechanical and chemical stimuli.</a> Cell Mol Life Sci. , (2013).</li><li>Valet, G., Raffael, A., Russmann, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+intracellular+calcium+in+vital+cells+by+flow-cytometry.">Determination of intracellular calcium in vital cells by flow-cytometry.</a> Naturwissenschaften. 72, 600-602 (1985).</li><li>June, C. H., Rabinovitch, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+cellular+ionized+calcium+concentration.">Flow cytometric measurement of cellular ionized calcium concentration.</a> Pathology and immunopathology research. 7, 409-432 (1988).</li><li>Ransom, J. T., DiGiusto, D. L., Cambier, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+intracellular+calcium+mobilization.">Flow cytometric analysis of intracellular calcium mobilization.</a> Methods Enzymol. 141, 53-63 (1987).</li><li>Gergely, L., Cook, L., Agnello, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simplified+method+for+Ca2++flux+measurement+on+isolated+human+B+cells+that+uses+flow+cytometry.">A simplified method for Ca2+ flux measurement on isolated human B cells that uses flow cytometry.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 4, 70-74 (1997).</li><li>Seidel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotransmitter+GABA+is+a+potent+inhibitor+of+the+stromal+cell-derived+factor-1alpha+induced+migration+of+adult+CD133++hematopoietic+stem+and+progenitor+cells.">The neurotransmitter GABA is a potent inhibitor of the stromal cell-derived factor-1alpha induced migration of adult CD133+ hematopoietic stem and progenitor cells.</a> Stem cells and development. 16, 827-836 (2007).</li><li>Lee, W. K., Chakraborty, P. K., Roussa, E., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ERK1/2-dependent+bestrophin-3+expression+prevents+ER-stress-induced+cell+death+in+renal+epithelial+cells+by+reducing+CHOP.">ERK1/2-dependent bestrophin-3 expression prevents ER-stress-induced cell death in renal epithelial cells by reducing CHOP.</a> Biochim Biophys Acta. 1823, 1864-1876 (2012).</li><li>Woost, P. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immortalization+and+characterization+of+proximal+tubule+cells+derived+from+kidneys+of+spontaneously+hypertensive+and+normotensive+rats.">Immortalization and characterization of proximal tubule cells derived from kidneys of spontaneously hypertensive and normotensive rats.</a> Kidney Int. 50, 125-134 (1996).</li><li>Beyer, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Benemid,'+p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic+acid;+its+renal+affinity+and+its+elimination.">Benemid,' p-(di-n-propylsulfamyl)-benzoic acid; its renal affinity and its elimination.</a> Am J Physiol. 166, 625-640 (1951).</li><li>Buckley, B. J., Whorton, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tunicamycin+increases+intracellular+calcium+levels+in+bovine+aortic+endothelial+cells.">Tunicamycin increases intracellular calcium levels in bovine aortic endothelial cells.</a> Am J Physiol. 273, 1298-1305 (1997).</li><li>Koepsell, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+SLC22+family+with+transporters+of+organic+cations,+anions+and+zwitterions.">The SLC22 family with transporters of organic cations, anions and zwitterions.</a> Molecular aspects of medicine. 34, 413-435 (2013).</li><li>Dean, M., Hamon, Y., Chimini, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+ATP-binding+cassette+(ABC)+transporter+superfamily.">The human ATP-binding cassette (ABC) transporter superfamily.</a> J Lipid Res. 42, 1007-1017 (2001).</li><li>Brezden, C. B., Hedley, D. W., Rauth, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+expression+of+P-glycoprotein+as+a+determinant+of+loading+with+fluorescent+calcium+probes.">Constitutive expression of P-glycoprotein as a determinant of loading with fluorescent calcium probes.</a> Cytometry. 17, 343-348 (1994).</li><li>Th&#233;venod, F., Friedmann, J. M., Katsen, A. D., Hauser, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Up-regulation+of+multidrug+resistance+P-glycoprotein+via+nuclear+factor-kappaB+activation+protects+kidney+proximal+tubule+cells+from+cadmium-+and+reactive+oxygen+species-induced+apoptosis.">Up-regulation of multidrug resistance P-glycoprotein via nuclear factor-kappaB activation protects kidney proximal tubule cells from cadmium- and reactive oxygen species-induced apoptosis.</a> J Biol Chem. 275, 1887-1896 (2000).</li><li>Chakraborty, P. K., Lee, W. K., Molitor, M., Wolff, N. A., Th&#233;venod, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cadmium+induces+Wnt+signaling+to+upregulate+proliferation+and+survival+genes+in+sub-confluent+kidney+proximal+tubule+cells.">Cadmium induces Wnt signaling to upregulate proliferation and survival genes in sub-confluent kidney proximal tubule cells.</a> Mol Cancer. 9, 102 (2010).</li><li>Jennings, L. K., Dockter, M. E., Wall, C. D., Fox, C. F., Kennedy, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+mobilization+in+human+platelets+using+indo-1+and+flow+cytometry.">Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry.</a> Blood. 74, 2674-2680 (1989).</li><li>Lopez, M., Olive, D., Mannoni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+cytosolic+ionized+calcium+variation+in+polymorphonuclear+leukocytes+using+flow+cytometry+and+Indo-1+AM.">Analysis of cytosolic ionized calcium variation in polymorphonuclear leukocytes using flow cytometry and Indo-1 AM.</a> Cytometry. 10, 165-173 (1989).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Kalsiyum ikinci mesajcı sinyal molekülü olarak ve aynı zamanda, ER ve mitokondri arasında iletişim kurmak için bir araç olarak hareket eden bir çok hücresel süreçlerde önemli bir olaydır. Ücretsiz Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları değişiklikleri ölçmek için yeteneği hücre biyolojisi tüm alanlarında uygulayabileceğiniz yararlı bir tekniktir. Sitozolik kalsiyum sinyalleri algılamak için çeşitli yöntemler vardır. Klasik olarak, bu tür Fura-2 gibi, bir oran ölçer kalsiyum göstergesi, ...

Kalsiyum hücre fizyolojik ve patofizyolojik sinyallerinin 1 aktarılmasından sorumlu önemli bir ikincil habercidir. Sitozolik kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum pompaları ve kalsiyum değiştirgeçlerinin aktivite yoluyla düşük tutulur. Sarkoplazmik / endoplazmik retikulum kalsiyum ATPaz&#39;ın (SERCA) ATP&#39;ye bağımlı şekillerde hem de plazma membran kalsiyum ATPaz&#39;ın (PMCA) Hücre dışı bölüme kalsiyum ekstrüde ise &quot;pompa kaçak&quot; sisteminin bir parçası olarak endoplazmik retikulum (ER), kalsiyum deposunu doldurabilir 2. Gibi hormonlar veya sinir taşıyıcıları gibi fizyolojik haberciler, G-proteini ile bağlanmış reseptörler, diasilgliserol ve inositol trifosfat (IP3) 3 oluşturmak için, plazma membranında, fosfatidilinositol 4,5-bisfosfat (PIP2) hidrolize eden, fosfolipaz C aktivasyonu yoluyla iletir. Diaçilgliserol plazma membranında kalırken, IP3 sitozol içine girer ve IP3 reseptörüne bağlananER membran ve kalsiyum bulunan bağ kalsiyum kanallarını aktive S (IP3Rs), sitozolik kalsiyum konsantrasyonları 4 bir artışa sonuçlanan ER lümen deposundan salınır. Sitoplazmada ulaşmak için kalsiyum için alternatif bir yol, plazma membranında bulunan kalsiyum kanallarda ve değiştiricilerde geçer. Bu iki bölme arasındaki çapraz karışma tarif edilmiştir: kalsiyum kaynaklı kalsiyum dışı kalsiyum ER depolar 5 kalsiyum serbest kalmasına sebep olur salım (YÜÇAM) ve depolamak stimülasyonu tarafından algılanan ER mağaza boşaltılmasından kalsiyum girişini (Soce) çalıştırılabilir ve Orai açılmasına neden olur plazma membranında kalsiyum kanalları ER mağaza 6 yeniden dolmasını teşvik etmek. Patofizyolojik koşullar altında, hücresel kalsiyum tepki de fizyolojik uyarıyıcıya 1 yokluğunda serbest ve sitosolik kalsiyum artar. Kalsiyum yanıtı çeşitli yollarla etkilenebilir: kalsiyum uzun sürelisinyali, sitosolden kalsiyum çıkarılmasını, kalsiyum mağazalarda veya kalsiyum lokalize değişikliklerin tükenmesi erteledi. Ayrıca, mitokondri tamponlama merkezi bir rol almak ve kalsiyum 7 serbest. Uzun süreli ve / veya supramaksimal sitosolik kalsiyum artışı hücre ölümüne sebep olur. Aslında, kalsiyum daha çok hücresel patofizyolojik yanıtta ve bu tür daha çok hücre ölümü ile ilişkili nörodejeneratif hastalık, kalp hastalığı, kanser, kemik hastalığı ve böbrek hastalığı gibi hastalıklar, geniş bir dizi önemli bir olay değildir daha kayıp veya organ veya doku işlevinin 8-10 değiştirilmesi ve. Üstelik, kalsiyum sinyallerinin pertürbasyon hücre uyarlanması ve hücresel işlevleri ve yanıtları değişikliklere bağlanmıştır. Geleneksel olarak, kalsiyum sinyalleri hücre geçirgen asetoksimetil (AM) bir ester formunda hücrelere yüklenen bir negatif yüklü bir fluoresan kalsiyum göstergesi ile ölçülür. Bir kez hücre esteras parçalanabilenES floresan göstergeler hücre bölmesi içinde kalır ve kalsiyum bağlı olduğunda, flüoresans yoğunluğunda artış. En iyi bilinen ve kullanılan kalsiyum göstergesi rasyometrik Fura-2 Roger Tsien ve arkadaşları 11 tarafından geliştirilen. Kalsiyum için farklı afinitelerle kalsiyum göstergeleri farklı kalsiyum havuzları izlenmesine olanak tanır. Tespit yöntemleri, canlı hücre görüntüleme, floresan mikroplaka okuyucu içerir ve akış sitometresi. (Genellikle birkaç dakika için birkaç saniye içinde) kalsiyum sinyallerinin görece hızlı kinetik kalsiyum sinyalinin özellikleri hakkında en çok bilgi kazanmak için en iyi yöntem görüntüleme canlı hücre yapar. Kenara (milisaniye içinde) kalsiyum sinyallerin hızlı kinetik, canlı hücre görüntüleme tek bir hücrenin 12 içinde kalsiyum sinyal hücresel compartmentalization çalışmak için iyi bir yöntemdir. Mutlak kalsiyum konsantrasyonları kalsiyum ind minimum ve maksimum floresans belirlenmesi ile hesaplanabilirGrynkievvicz et al. 11 tarafından tarif edildiği gibi, sırasıyla, bir kalsiyum tutucusunun eklenmesi ve hücrelerin geçirimli ile icator. Kalsiyum sinyallerinin ölçülmesi için akış sitometrisi kullanımı, ilk olarak bir fırsat zar bütünlüğü ve hücre grubunun ayrılması ve tek bir dalga boyu gelişimi ile birlikte süspansiyon içinde hücrelerin gereği olarak, birden çok parametre ölçmek için burada immünolojik hücrelerde 1980&#39;li yıllarda geliştirilen kalsiyum göstergeler bir ideal ve convenientdetection yöntemle 13-15 flow sitometri yaptı. Yapışık hücrelere, canlı hücre görüntüleme kalsiyum sinyalizasyonu, en önemlisi kinetiği hakkında en çok bilgi sağlar, ancak elde etmek için bir sıcaklık gibi bir floresan mikroskop, bir perfüzyon sistemi, hücresel çevre bakımı, oluşan karmaşık kurulum ve özel mikroskop yazılım gerektirir ve verileri analiz. Bu tür bir floresan mikroplaka okuyucu ya da Pharmacol gibi seçenek yöntemlerKalsiyum kenetleme maddelerinin kullanımı yoluyla ogical araçları elde edilen bilgilerin açısından eşsiz. Akış sitometrisi, daha yaygın olarak, çalışmaların çoğunda olsa da, ölçümler yapılmıştır sadece son-nokta yapışık hücreler sitosolik kalsiyum izlemek için kullanılabilir hale gelmektedir. Başlangıçta Gergely ve arkadaşları tarafından geliştirilen yöntem kullanılarak. Imünolojik B hücreleri 16, gerçek zamanlı kinetiği olan akış sitometrisi ve bir numune bir gruptan hücrelerinde floresan yoğunluğunun izlenmesi ile sitosolik serbest kalsiyum konsantrasyonunda değişiklikler başarıyla kanser epitelyal hücrelerinde ölçülmüştür ve kanser kök hücresi 17 melezler. Bu yöntem, bundan başka, kalsiyum göstergeleri 18, yükleme zordur yapışık epitel hücrelerinde, kullanım için adapte edilmiştir. Burada, sıçan böbrek proksimal tübül (WKPT-0293 CL.2) 19 S1 kısmında elde edilen ölümsüzleştirilmiş yapışkan epitel hücre soyunu kullanarak, biz, optimize edilmiş bir basitleştirilmiş m açıklamakAkış sitometrisi ile sitosolik kalsiyum konsantrasyonundaki ^ değişikliklerin ölçülmesi için METOT. Birçok epitel hücreleri anyonik bileşikler için organik taşıyıcıların bir dizi sahip olduğu için, bir kalsiyum göstergesi ile hücrelerin yük bir meydan okuma olarak kanıtlamak olabilir. Kalsiyum göstergeleri, probenesid, penisilin 20 ekskresyonun düşürmek için geliştirilmiş başlangıçta prototipik organik anyon nakil inhibitörü ve akışını önlemek için, kuluçkalama ortamı içinde eş zamanlı olarak uygulanır. Hücreler, kalsiyum indikatör yükleme için tek tabaka halinde tutulan bir bileşik ilave edildikten sonra hemen tespit edilebilir süspansiyon ve kalsiyum sinyalleri haline getirilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="735">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:79px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:321px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-3, AM</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">F-1241&#160;</td>
			<td>Cell permeable</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Probenecid</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8761</td>
			<td>Water insoluble, dissolve in 1 N NaOH</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:79px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">25300-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ionomycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">I9657</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Thapsigargin</td>
			<td style="width:79px;">Tocris Bioscience</td>
			<td style="width:119px;">1138</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tunicamycin</td>
			<td style="width:79px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FACSCalibur Flow Cytometer + CELLQuest software</td>
			<td style="width:79px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:216px;">Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)</td>
			<td style="width:79px;">Joe Trotter, The Scripps Institute</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Please note that this is an older 16-bit application that reads FCS 2.0 compliant files but does not recognize FCS 3.0 digital data.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">WKPT-0293 Cl.2 rat kidney proximal tubule cell line</td>
			<td style="width:79px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:321px;">Made available by Dr. Ulrich Hopfer (Department of Physiology &#38; Biophysics, Case 
			Western Reserve University, Cleveland, OH)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cytosolic calcium measurements in renal epithelial cells by flow cytometry

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial function, cell death, cell metabolism and cell migration to name but a few. Cytosolic calcium is normally maintained at low nanomolar concentrations; rather it is found in high micromolar to millimolar concentrations in the endoplasmic reticulum, mitochondrial matrix and the extracellular compartment. Upon stimulation, a transient increase in cytosolic calcium serves to signal downstream events. Detecting changes in cytosolic calcium is normally performed using a live cell imaging set up with calcium binding dyes that exhibit either an increase in fluorescence intensity or a shift in the emission wavelength upon calcium binding. However, a live cell imaging set up is not freely accessible to all researchers. Alternative detection methods have been optimized for immunological cells with flow cytometry and for non-immunological adherent cells with a fluorescence microplate reader. Here, we describe an optimized, simple method for detecting changes in epithelial cells with flow cytometry using a single wavelength calcium binding dye. Adherent renal proximal tubule epithelial cells, which are normally difficult to load with dyes, were loaded with a fluorescent cell permeable calcium binding dye in the presence of probenecid, brought into suspension and calcium signals were monitored before and after addition of thapsigargin, tunicamycin and ionomycin.

Sitozolik kalsiyum artırmak için, iki farmakolojik bileşikler hücre geçirgen kalsiyum bağlama boyası, Flu-3-AM ile yüklendi, renal proksimal tübüllerde (WKPT-0293 CL.2) uygulanmıştır. İşlem görmemiş kontrol numuneleri probenesid mevcudiyetinde kalsiyum bağlama boya ile yüklenir ve karıştırılır, ancak herhangi bir bileşik ilavesi olmaksızın edildi. Thapsigargin (TG) ER dışarı sızıntı yol açan ve artan sitosolik kalsiyumun elde SERCA pompanın klasik bir inhibitörüdür. Tunikamisin (TUN...

Watch this Scientific Journal Video about Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry at JoVE.com

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir.

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...

cytosolic-calcium-measurements-renal-epithelial-cells-flow

Research

JoVE Journal

Biology

15.2K Görüntüleme.  University of Witten/Herdecke.  Kalsiyum çeşitli fizyolojik ve patofizyolojik sinyal yollarında rol oynamaktadır. Canlı hücre görüntüleme özel ekipman gerektirir ve zaman alıcı olabilir. Süspansiyon haline getirilmiştir yapışık epitel hücrelerinde sitozolik kalsiyum göreli değişiklikleri belirlemek için bir akış Sitometreyi kullanarak hızlı, basit bir yöntem optimize edilmiştir. 

Video: Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic principle extends that of sandwich ELISA, wherein the captured primary analyte can be detected together with other molecules physically associated within multiprotein complexes. The procedure involves covalent coupling of polystyrene latex microbeads with immunoprecipitating monoclonal antibodies (mAb) specific for a protein of interest, incubating these beads with cell lysates, probing captured protein complexes with fluorochrome-conjugated probes, and analyzing bead-associated fluorescence by flow cytometry. IP-FCM is extremely sensitive, allows analysis of proteins in their native (non-denatured) state, and is amenable to either semi-quantitative or quantitative analysis. As additional advantages, IP-FCM requires no genetic engineering or specialized equipment, other than a flow cytometer, and it can be readily adapted for high-throughput applications.

The IP-FCM method is presented, which allows a sensitive, robust, biochemical assessment of native protein-protein interactions, without requiring genetic engineering or large sample sizes.

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Biyoloji

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental gene expression 1,2,3,4,5,6,7. The recent discovery of thousands of lncRNAs in association with specific chromatin modification complexes, such as Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) that mediates histone H3 lysine 27 trimethylation (H3K27me3), suggests broad roles for numerous lncRNAs in managing chromatin states in a gene-specific fashion 8,9. While some lncRNAs are thought to work in cis on neighboring genes, other lncRNAs work in trans to regulate distantly located genes. For instance, Drosophila lncRNAs roX1 and roX2 bind numerous regions on the X chromosome of male cells, and are critical for dosage compensation 10,11. However, the exact locations of their binding sites are not known at high resolution. Similarly, human lncRNA HOTAIR can affect PRC2 occupancy on hundreds of genes genome-wide 3,12,13, but how specificity is achieved is unclear. LncRNAs can also serve as modular scaffolds to recruit the assembly of multiple protein complexes. The classic trans-acting RNA scaffold is the TERC RNA that serves as the template and scaffold for the telomerase complex 14; HOTAIR can also serve as a scaffold for PRC2 and a H3K4 demethylase complex 13.
Prior studies mapping RNA occupancy at chromatin have revealed substantial insights 15,16, but only at a single gene locus at a time. The occupancy sites of most lncRNAs are not known, and the roles of lncRNAs in chromatin regulation have been mostly inferred from the indirect effects of lncRNA perturbation. Just as chromatin immunoprecipitation followed by microarray or deep sequencing (ChIP-chip or ChIP-seq, respectively) has greatly improved our understanding of protein-DNA interactions on a genomic scale, here we illustrate a recently published strategy to map long RNA occupancy genome-wide at high resolution 17. This method, Chromatin Isolation by RNA Purification (ChIRP) (Figure 1), is based on affinity capture of target lncRNA:chromatin complex by tiling antisense-oligos, which then generates a map of genomic binding sites at a resolution of several hundred bases with high sensitivity and low background. ChIRP is applicable to many lncRNAs because the design of affinity-probes is straightforward given the RNA sequence and requires no knowledge of the RNA's structure or functional domains.

Chromatin Isolation by RNA Purification ChIRP

ChIRP is a novel and rapid technique to map genomic binding sites of long noncoding RNAs (lncRNAs). The method takes advantage of the specificity of anti-sense tiling oligonucleotides to allow the enumeration of lncRNA-bound genomic sites.

RNA Saflaştırma tarafından Kromatin İzolasyon (chirp)

Long noncoding RNAs are key regulators of chromatin states for important biological processes such as dosage compensation, imprinting, and developmental ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of different cell types in vitro and in vivo.1-5 Although there are literally thousands of publications using such dyes, some of the most commonly encountered cell tracking applications include monitoring of:
<ol>
	<li>stem and progenitor cell quiescence, proliferation and/or differentiation6-8</li>
	<li>antigen-driven membrane transfer9 and/or precursor cell proliferation3,4,10-18 and</li>
	<li>immune regulatory and effector cell function1,18-21.</li>
</ol>
Commercially available cell tracking dyes vary widely in their chemistries and fluorescence properties but the great majority fall into one of two classes based on their mechanism of cell labeling. "Membrane dyes", typified by PKH26, are highly lipophilic dyes that partition stably but non-covalently into cell membranes1,2,11. "Protein dyes", typified by CFSE, are amino-reactive dyes that form stable covalent bonds with cell proteins4,16,18. Each class has its own advantages and limitations. The key to their successful use, particularly in multicolor studies where multiple dyes are used to track different cell types, is therefore to understand the critical issues enabling optimal use of each class2-4,16,18,24.
The protocols included here highlight three common causes of poor or variable results when using cell-tracking dyes. These are:
<ol>
	<li>Failure to achieve bright, uniform, reproducible labeling. This is a necessary starting point for any cell tracking study but requires attention to different variables when using membrane dyes than when using protein dyes or equilibrium binding reagents such as antibodies.</li>
	<li>Suboptimal fluorochrome combinations and/or failure to include critical compensation controls. Tracking dye fluorescence is typically 102 - 103 times brighter than antibody fluorescence. It is therefore essential to verify that the presence of tracking dye does not compromise the ability to detect other probes being used.</li>
	<li>Failure to obtain a good fit with peak modeling software. Such software allows quantitative comparison of proliferative responses across different populations or stimuli based on precursor frequency or other metrics. Obtaining a good fit, however, requires exclusion of dead/dying cells that can distort dye dilution profiles and matching of the assumptions underlying the model with characteristics of the observed dye dilution profile.</li>
</ol>
Examples given here illustrate how these variables can affect results when using membrane and/or protein dyes to monitor cell proliferation.

Successful use of cell tracking dyes to monitor immune cell function and proliferation involves several critical steps. We describe methods for: 1) obtaining bright, uniform, reproducible label-ing with membrane dyes; 2) selecting fluorochromes and data acquisition conditions; and 3) choosing a model to quantify cell proliferation based on dye dilution.

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Rapid Genetic Analysis of Epithelial-Mesenchymal Signaling During Hair Regeneration

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an attractive model system to study organ development and tissue-specific signaling. Although hair follicle development is genetically tractable, fast and reproducible analysis of factors essential for this process remains a challenge. Here we describe a procedure to generate targeted overexpression or shRNA-mediated knockdown of factors using lentivirus in a tissue-specific manner. Using a modified version of a hair regeneration model 5, 6, 11, we can achieve robust gain- or loss-of-function analysis in primary mouse keratinocytes or dermal cells to facilitate study of epithelial-mesenchymal signaling pathways that lead to hair follicle morphogenesis. We describe how to isolate fresh primary mouse keratinocytes and dermal cells, which contain dermal papilla cells and their precursors, deliver lentivirus containing either shRNA or cDNA to one of the cell populations, and combine the cells to generate fully formed hair follicles on the backs of nude mice. This approach allows analysis of tissue-specific factors required to generate hair follicles within three weeks and provides a fast and convenient companion to existing genetic models.

Tissue-specific analysis of a hair follicle regeneration model using lentivirus to mediate gain- or loss-of-function.

Saç Rejenerasyon sırasında epitelyal-mezenkimal Sinyal Rapid Genetik Analizi

Hair follicle morphogenesis, a complex process requiring interaction between epithelia-derived keratinocytes and the underlying mesenchyme, is an ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Mezenkimal Geçiş indüksiyon ve Epitel Analizi

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

High Efficiency Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells to Cardiomyocytes and Characterization by Flow Cytometry

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the heart, and improving strategies to accurately model heart disease. The potential of exploiting human induced pluripotent stem cell (hiPSC) technology to generate cardiac muscle &#8220;in a dish&#8221; for these applications continues to generate high enthusiasm. In recent years, the ability to efficiently generate cardiomyogenic cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) has greatly improved, offering us new opportunities to model very early stages of human cardiac development not otherwise accessible. In contrast to many previous methods, the cardiomyocyte differentiation protocol described here does not require cell aggregation or the addition of Activin A or BMP4 and robustly generates cultures of cells that are highly positive for cardiac troponin I and T (TNNI3, TNNT2), iroquois-class homeodomain protein IRX-4 (IRX4), myosin regulatory light chain 2, ventricular/cardiac muscle isoform (MLC2v) and myosin regulatory light chain 2, atrial isoform (MLC2a) by day 10 across all human embryonic stem cell (hESC) and hiPSC lines tested to date. Cells can be passaged and maintained for more than 90 days in culture. The strategy is technically simple to implement and cost-effective. Characterization of cardiomyocytes derived from pluripotent cells often includes the analysis of reference markers, both at the mRNA and protein level. For protein analysis, flow cytometry is a powerful analytical tool for assessing quality of cells in culture and determining subpopulation homogeneity. However, technical variation in sample preparation can significantly affect quality of flow cytometry data. Thus, standardization of staining protocols should facilitate comparisons among various differentiation strategies. Accordingly, optimized staining protocols for the analysis of IRX4, MLC2v, MLC2a, TNNI3, and TNNT2 by flow cytometry are described.

The article describes the detailed methodology to efficiently differentiate human pluripotent stem cells into cardiomyocytes by selectively modulating the Wnt pathway, followed by flow cytometry analysis of reference markers to assess homogeneity and identity of the population.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

There is an urgent need to develop approaches for repairing the damaged heart, discovering new therapeutic drugs that do not have toxic effects on the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to the analysis of a few fluorochromes, currently there are dozens of different fluorescent dyes, and up to 14-18 different dyes can be combined at a time. However, several limitations still impair the analytical capabilities. Because of the multiplicity of fluorescent probes, data analysis has become increasingly complex due to the need of large, multi-parametric compensation matrices. Moreover, mutant mouse models carrying fluorescent proteins to detect and trace specific cell types in different tissues have become available, so the analysis (by flow cytometry) of auto-fluorescent cell suspensions obtained from solid organs is required. Spectral flow cytometry, which distinguishes the shapes of emission spectra along a wide range of continuous wavelengths, addresses some of these problems. The data is analyzed with an algorithm that replaces compensation matrices and treats auto-fluorescence as an independent parameter. Thus, spectral flow cytometry should be capable of discriminating fluorochromes with similar emission peaks and can provide a multi-parametric analysis without compensation requirements.
This protocol describes the spectral flow cytometry analysis, allowing for a 21-parameter (19 fluorescent probes) characterization and the management of an auto-fluorescent signal, providing high resolution in minor population detection. The results presented here show that spectral flow cytometry presents advantages in the analysis of cell populations from tissues difficult to characterize in conventional flow cytometry, such as the heart and the intestine. Spectral flow cytometry thus demonstrates the multi-parametric analytical capacity of high-performing conventional flow cytometry without the requirement for compensation and enables auto-fluorescence management.

This article describes spectral cytometry, a new approach in flow cytometry that uses the shapes of emission spectra to distinguish fluorochromes. An algorithm replaces compensations and can treat auto-fluorescence as an independent parameter. This new approach allows for the proper analysis of cells isolated from solid organs.

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Measuring Endoreduplication by Flow Cytometry of Isolated Tuber Protoplasts

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated with specialization, development and increase in cellular size. In plants, endoreduplication seems to facilitate the growth and expansion of certain tissues and organs. Among them is the tuber of potato (Solanum tuberosum), which undergoes considerable cellular expansion in fulfilling its function of carbohydrate storage. Thus, endoreduplication may play an important role in how tubers are able to accommodate this abundance of carbon. However, the cellular debris resulting from crude nuclear isolation methods of tubers, methods that can be used effectively with leaves, precludes the estimation of the tuber endoreduplication index (EI). This article presents a technique for assessing tuber endoreduplication through the isolation of protoplasts while demonstrating representative results obtained from different genotypes and compartmentalized tuber tissues. The major limitations of the protocol are the time and reagent costs required for sample preparation as well as relatively short lifespan of samples after lysis of protoplasts. While the protocol is sensitive to technical variation, it represents an improvement over traditional methods of nuclear isolation from these large specialized cells. Possibilities for improvements to the protocol such as recycling enzyme, the use of fixatives, and other alterations are proposed.

The protocol described herein is a method for measuring endoreduplication within tubers of potato (Solanum tuberosum). It includes plasmolysis and protoplast extraction steps to decrease the noise and debris in downstream flow cytometric analysis.

Endoreduplication izole yumru önceki Akış Sitometresi tarafından ölçme

Endoreduplication, the replication of a cell's nuclear genome without subsequent cytokinesis, yields cells with increased DNA content and is associated ...

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion and the spread of neurodegenerative diseases. The commonly used laboratory strains of the amoeba Dictyostelium discoideum have extremely high fluid uptake rates when grown in nutrient medium, over 90% of which is due to macropinocytosis. In addition, many of the known core components of mammalian macropinocytosis are also present, making it an excellent model system for studying macropinocytosis. Here, the standard technique to measure internalized fluid using fluorescent dextran as a label is adapted to a 96-well plate format, with the samples analyzed by flow cytometry using a high-throughput sampling (HTS) attachment.
Cells are fed non-quenchable fluorescent dextran for a pre-determined length of time, washed by immersion in ice-cold buffer and detached using 5 mM sodium azide, which also stops exocytosis. Cells in each well are then analyzed by flow cytometry. The method can also be adapted to measure membrane uptake and phagocytosis of fluorescent beads or bacteria.
This method was designed to allow measurement of fluid uptake by Dictyostelium in a high-throughput, labor and resource efficient manner. It allows simultaneous comparison of multiple strains (e.g. knockout mutants of a gene) and conditions (e.g. cells in different media or treated with different concentrations of inhibitor) in parallel and simplifies time-courses.

High-throughput Measurement of Dictyostelium discoideum Macropinocytosis by Flow Cytometry

Macropinocytosis, large-scale non-specific fluid uptake, is important in many areas of clinical biology including immunology, infection, cancer, and neurodegenerative diseases. Here, existing techniques have been adapted to allow high-throughput, single-cell resolution measurement of macropinocytosis in the macropinocytosis model organism Dictyostelium discoideum using flow cytometry.

Dictyostelium discoideum Macropinocytosis akış sitometresi tarafından yüksek üretilen iş ölçümü

Large-scale non-specific fluid uptake by macropinocytosis is important for the proliferation of certain cancer cells, antigen sampling, host cell invasion ...