Name: killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells
Uploaded: 2014-08-11T19:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
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この作品は、ドイツ研究財団（DFG）SCHU-2681 / 1-1（CS）とKFO 146（MF）、DOD学科防衛の助成PC 040972（MO）によってサポートされており、国立衛生研究所は、RO1 CA108835を付与します、RO1 Ai44129（JPS）

HLA-A2-IgをベースKaAPCの1世代<ol><li>無菌のホウ酸緩衝液を準備します。水中のホウ酸の0.1M溶液を作成し、pHを7.0に調整。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。 </li><li>無菌のビーズ洗浄バッファーを準備します。マグネシウムおよびカルシウムなしでリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を使用。 3％の最終濃度のためのヒトAB血清を追加します。 2mMの最終濃度のためにエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を加える。 0.01％の最終濃度のためにアジ化ナトリウム（NaN 3を ） を加える。無菌フィルター（0.22μm）をバッファリングし、4℃で保存する。 </li><li>無菌に在庫からのエポキシビーズ（約100×10 6ビーズ）を250μlを移し、トップガラスバイアルスクリュー。 </li><li>ホウ酸緩衝液を250μlを追加。 </li><li>磁石の上ガラスバイアルを入れて、ビーズを2分間付着させ;吸引バッファと磁石からガラスバイアルを取り外します。 </li><li> 1ミリリットルホウ酸緩衝液で1回ビーズを洗浄する。 </li><li> 0.018μgの550μlの中に再懸濁ビーズ/ mlのHLA-A2-Igおよび3.64 / mlの抗ヒトCD95モノクローナル抗体（クローンCH11）と軽く振り混ぜる。 （詳細については、議論のセクションを参照してください。） </li><li> 24時間、4℃で、端部の上に回転子の端にガラスバイアルをインキュベートする。 </li><li> 2分間300×gでビーズをスピンダウン。 </li><li> 2分間磁石上にガラスバイアルを置き、「KaAPC負荷溶液」を吸引する。磁石からガラスバイアルを取り外し、ビーズ洗浄緩衝液1mlを加え、振とうして、慎重に再懸濁する。 </li><li>二回ステップ1.10を繰り返します。 </li><li> 1ミリリットルビーズ洗浄緩衝液中で24時間、4℃で回転装置上ガラスバイアルをインキュベートする。この時点で、結合部位を全ての残留タンパク質は、ビーズ洗浄緩衝液に含まれるヒトAB血清によってブロックされる。 </li><li> 2分間300×gでビーズをスピンダウン。 </li><li> 2分と吸引ビーズ洗浄バッファー用の磁石の上に置きガラスバイアル;磁石からガラスバイアルを除去し、1mlのPBSで溶液を交換してください。 </li></ol> 2品質管理、ペプチド負荷、Wアッシング、ストレージ、およびKaAPCの安定性<ol><li> FACSチューブに1.5×10 5 KaAPCを移し、FACSバッファを洗う1ミリリットルで洗浄する。 </li><li> 100μlのFACSに再懸濁ビーズ（HLA-A2-IgのFc部分を検出するための）抗マウスIgG1 PEを1μlおよび検出のための抗マウスIgM FITC（クローンR6-60.2、1μlのをバッファリングし、追加の洗浄抗ヒトCD95 mAbの）。 </li><li> FACSバッファーを洗浄し、250μlのFACSでの再懸濁は、フローサイトメトリーによって染色をバッファリングし、読んで洗う1ミリリットルで洗浄し、4℃で15分間インキュベートする。 </li></ol><img alt="図1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> プロトコルの項で述べたように作られKaAPCバッチの図1のQC染色剤。染色は、抗ヒトCD95のに対し、2 HLA-A2-Igは抗マウスIgG1のPEモノクローナル抗体を用いて検出したプロトコルの項に記載したように行った（抗Fas）（プロトコル自体を参照して抗マウスIgMをFITC mAbで検出されました2.2 ction）（青線）。充填された黒色のグラフは、それぞれ、抗マウスIgG1のPE mAbまたは抗マウスIgMをFITC mAbで染色された空のビーズを表す。右上の数字は、平均蛍光強度（MFI）を示す。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="4"><li>新しい滅菌ガラスバイアルにペプチド積載転送20×10 6 KaAPCのために、2分間磁石上に置き、5μgのペプチドを有する500μlの新しいPBSに吸引PBS再懸濁ビーズは（覚えておいて、唯一のHLA-A2制限ペプチドは意志二量体に結合すること！）。 </li><li>ストアは、HLA-A2-Ig二量体への十分なペプチド負荷を可能にするために、少なくとも3日間、使用するまで4℃でKaAPCをロードしました。 </li><li>使用直前に、1.14に示されるようにKaAPCをロードしたペプチドを洗浄し;少なくとも6倍、この手順を繰り返します。 注：これは遊離ペプチドがtを有することを保証するために重要なステップです。oが偽陽性の殺傷の結果を避けるために完全に除去すること;残留遊離ペプチドは、抗原特異的T細胞培養9においてアポトーシスを誘導することが示されている。可溶性ペプチドの効果を除外するために、ペプチドの実行上清対照サンプルがロードされ、（3.8を参照）KaAPC洗浄した。 </li><li>血球計数器を用いてビーズを数え、ペプチドと集中の日付、名前でラベルを付けます。 注：ロードされたKaAPCは少なくとも1ヶ月間、4℃で機能している場合。 1ヶ月後、同じペプチドでの再ロードはKaAPCは、1年のために利用することができます。 </li></ol> 3 KaAPC 体外キリングアッセイ<ol><li>共培養培地を準備します。 （実験室6製）3％T細胞増殖因子および3％ドナー自家血漿を添加した完全RPMI培地を調製する。ドナー自己血漿が使用できない場合は、熱不活性化ヒトAB血清を使用しています。 </li><li>アネキシンV結合緩衝液の準備を準備します。 8.12グラムの塩化ナトリウム（NaCl）および0.12グラムの計算値を溶かす990ミリリットルののddH 2にイウムクロライド（のCaCl 2）を 10mlの1M HEPES緩衝液をO.Add。 </li><li>ヒト抗原特異的T細胞を生成する。 （詳細なプロトコールについては、人工抗原提示細胞（aAPCを）利用する前の出版物7を参照してください）。四量体染色によって決定されるように、ペプチド特異性は、少なくとも&gt; 75％であることを確認してください。 </li><li>加湿インキュベーター中で48時間KaAPC 1比率37℃で：各試料について、2×10 5抗原特異的T細胞/ウェル（96ウェル丸底プレート中の）1での共培養培地200μl中でインキュベートC、5％CO 2。 </li><li>収穫サンプルおよびFACSチューブに移す。 、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄し、5分間300×gでスピンダウン、アネキシンV結合緩衝液100μlの上清と再懸濁を捨てる</li><li> RTで10〜15分間、1μlのアネキシンV FITCおよび5μlの7-AADで染色サンプルは、1ミリリットルアネキシンV結合緩衝液で洗浄する。 5分間300×gでスピンダウン、上澄みANを捨てる250μlのアネキシンV結合緩衝液中のd再懸濁</li><li>フローサイトメーター上で直ちにサンプルをお読みください。 </li><li>以下KaAPCにより抗原特異的な死滅を決定するためのサンプルの準備：T細胞のみ; T細胞+可溶性抗CD95; T細胞はKaAPCアンロード+; KaAPCロードされたT細胞は、+非同族ペプチド; T細胞+同族のペプチドはKaAPCをロードした。同族のペプチドのT細胞+上清をKaAPCをロードしました。 </li></ol><img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> アッセイを殺す図2 KaAPCペプチドは1から48時間培養した（HLA-A2-Igのビーズのみ）KaAPCまたはコントロールビーズをロードした：回収し、その後アネキシンVで染色し、CMVpp65特異的T細胞（〜80％）と1の比率フローサイトメトリーによってアポトーシスを測定するためにヨウ化物（PI）プロピジウム（プロトコルセクション3.3から3.7を参照）。「コグネイト」はであることがCMVpp65および「非同族&quot;で撮影されたビーズを指しMART-1ペプチドをロードした広告。数字は各プロットの左下の象限中の生存T細胞の割合を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <ol start="9"><li>十字、実験を行うために、2つの異なる特異性の抗原特異的T細胞を生成する。 </li><li>さらに不均一なT細胞集団におけるT細胞の抗原特異的排除の同時分析をKaAPCの抗原特異的な空乏能力を評価する。 （詳細なプロトコールについてシュッツらを参照してください。10）。 </li></ol>

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	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CSとMFが開示することは何もない。 NexImmuneとジョンズ·ホプキンス大学、博士との間のライセンス契約の下で。シュネックとエールケはこの資料に記載のaAPC商品の販売に大学によって受信されたロイヤルティの株式を受けることができます。彼らはまた、大学の方針の下、一定の制限の対象となるNexImmune株式を所有。博士はシュネックは取締役会および科学諮問委員会」の会社のメンバーでもあります。この構成の条件は、金利政策の抵触に応じて、ジョンズ·ホプキンス大学で管理されている。

プロトコルの中で最も重要なステップは、信号1（ペプチドMHC）と信号2（抗Fas mAb）での適切な比率を確保することである。私たちは、信号1および2のための完全な比率を定義するために集中的な滴定実験を行った。それは、HLA-A2 Ig二量体または抗Fas mAb濃度の違いによる最小限の変動がKaAPCの機能を妨害する可能性があることが明らかになった。このように、両方の信号の濃度を常に検証する必要があり、それは商業的供給源から注文された場合でも、両方のタンパク質の品質は頻繁にテストする必要があります。異なる検出アッセイは、異なる濃度になる場合がありさらに、濃度が常に同じアッセイによって決定されるべきである。 HLA-A2-Igの機能は、不完全なフォールディングおよび/または非効率的なペプチド負荷に損なわれる可能性があります。さらに、二量体分子は、タンパク質の機能的活性に影響を与える可能性が異なる程度に集約できます。従って、ACTU機能的かつ具体的なKaAPCの生成に必要とされる二量体の他の量は変わる場合があります。さらに、当社はKaAPC上の信号抗Fasモノクローナル抗体を誘導する死のための理想的な範囲は非常に厳しいであることがわかった。私たちの手の金額でより3.64μgの/ ml未満の金額は用量依存減少殺傷活性をもたらした中のFas陽性T細胞の非特異的殺害につながる/ 3.64μgの。これらの条件はかなり厳しいようだが、これらの細部に注意が機能し、特定のKaAPCの世代になります。 現在KaAPC表現型は活性化した抗原特異的T細胞の枯渇のために機能的であるが、これらの集団は、Fas発現が低下しているように、ナイーブまたは休止抗原特異的T細胞を標的とする最初の実験は、抗原特異的アポトーシスの有意な誘導を示さなかった。そのため、人はそれらを有効にする静止T細胞上のFasのアップレギュレーションを誘導することがKaAPC上に共刺激シグナルを追加思い描くかもしれませんKaAPCのターゲットに。これは実現可能ですが、3つすべての信号は、慎重に、機能KaAPC表現型を確実にするために滴定する必要があります。 生体適合性または生分解性マトリックスにビーズプラットフォームを調整することで、生体内適用​​に KaAPCを強化する。最近、シェンらは KaAPCは抗Fas（クローンは、Jo2）および抗His / H2-K b の -TRP2 11にコンジュゲートを5μmのラテックスビーズを利用した生体内の使用で成功を報告している。私たちは、人工抗原提示細胞（aAPCを）の一般的な概念が正常程度の大きさの粒子の大きさの程度12から転送することができ、その機能性は、粒子の幾何学的形状13の影響を受けていることを示すことができた。したがって、サイズおよび/ ​​または将来のKaAPCの形状を変化させることによって一つの臓器特異的自己免疫疾患の治療の成功のための鍵である可能性があり、in vivoでの機能性および生体分布に影響を与えることができるかもしれない設計。 <p c小娘= &quot;jove_contentは&quot;&gt; KaAPCは、ドナーの条件と、前処理とは独立して、時間とコスト効率的なアプローチ &quot;既製&quot;使いやすいように、細胞ベースの枯渇戦略の主要な欠点​​を克服する。 KaAPC、自己またはパラクリン殺害シグナル伝達のターゲットおよびCTLの細胞溶解性エフェクター機能に敏感ではないではありません。 KaAPCは、関連する疾病抗原の識別を必要とし、それらの特定のHLAタイプに依存します。 1型糖尿病のために現在、数多くの適切なHLA-A2制限された抗原が、GvHDのと倍数硬化症は2、私はさらに増加しての適用可能性を広げるであろう分子ならびに新たな自己免疫に関連する抗原の継続的な識別ダイマー追加のHLAクラスの開発を同定されているKaAPC。さらに1は、同時に複数の抗原を標的とするために、異なるエピトープに向けKaAPCを使用して考えることができます。 要約すると、KaAPCはのための柔軟なプラットフォーム技術を表しているtigen特異的T細胞枯渇。彼らの「レゴのような」性質は、in vitroおよびin vivoの適用におけるそれらのその後を広げ、強化することができ、さまざまな行列、上のようなPD1又はTRAILなどの追加の共刺激または阻害シグナルなどの新しい信号を含めることができます。私たちは、本明細書KaAPC、異なる特異性を有するT細胞の混合物からの抗原特異的T細胞の除去のための第1のビードベースのアプローチを生成するためのステップバイステップのプロトコルを提示する。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> 。図3 KaAPCが、抗原特異的な様式でCTLをなくす PKH26で標識し、同じドナーからのFas +エフェクターメモリーCTLを活性化し、PKH67で標識したCMVpp65特異的CTLを1に混合した：CMVpp65 KaAPCと1の比率と共培養し48時間。対照培養はアンロード KaAPC、または1μg/ mlので処理したの可溶性抗Fas-モノクローナル抗体（クローンCH11）。生存細胞の最小限の損失を、未処理の混合CTL培養物（T ミックス ）で測定した。 T ミックスの各CTL集団の元のFACSデータを示している。以前に両方のT細胞集団10上の別のゲーティングによって発行されたアポトーシスの分析を行った。左上の象限に描か数値は、全細胞の％を占める。説明図は、3つの独立した実験のうちの1つの代表的な実験に由来する。この研究は、もともと血液に掲載されました。シュッツ、C. らキラー人工抗原提示細胞：特異的T細胞を削除するための新規戦略ブラッド。 2008; 111、3546から52。著作権米国血液学会。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a>

最後の20年間に多くの進歩は、自己免疫疾患の発症機序を理解する上でなされた。しかし、最も一般的な治療法はまだコステロイドならびにそのようなプリン類似体などの免疫抑制剤、アルキル化剤およびカルシニューリン阻害剤1に依存しています。そのような薬物の使用は、患者の予後を大幅に改善されている、まだ治療は、基礎免疫学誤動作の硬化を提供していません。さらに、患者は感染症および癌の発生に対して脆弱になる。 したがって、T細胞媒介自己免疫疾患および同種移植片拒絶の治療のための究極の目標は、具体的に、同時に、手付かずおよび免疫学的疾患と戦うために有能な残りの免疫系を残してT細胞を生じさせるだけの疾患を標的とすることである。末梢T細胞応答を抑制するための治療を最初に早けれ説明したように、抗原提示細胞（APC）を利用しいくつかのグループによって、1970。その後、多くの細胞ベースのアプローチが開発されているので（シュッツら 2に概説される）。免疫調節細胞は、自己免疫、移植片拒絶および慢性感染症の治療のための治療的可能性を示す有望な結果を示したように、FasLの発現キラー-APCを用いた戦略。しかし、最終的にそれらの臨床的適用性が制限されているのFasLキラー-APCを利用する戦略に重大な制限があります。 （ⅰ）、APCの生成または単離は時間、労力、集中コスト（ⅱ）による免疫抑制に血球減少症を患っている患者は、細胞の限られた量と品質を提供（iii）のような高度でのFasLの結果としてのアポトーシス誘導シグナルと、APCのコーティングまたは形質導入を変数の表現型および（iv）キラー-APCは、T細胞の細胞傷害性エフェクター機能は、結果としてその治療可能性を低減することに敏感である。したがって、定義された再現可能なキラー-APCのフェノを保証することは困難であるin vivoで T細胞応答の抗原特異的変調のために利用することができるタイプ。 キラー-APC 3-5および人工抗原提示細胞に発現のFasLとの以前の研究（のaAPC）6,7に基づき、私たちは中に自己反応性T細胞の抗原特異的阻害または除去のために、ビーズベースのアプローチ（KaAPC）を開発試験管 。 KaAPCは、HLA-A2-Ig二量体（信号1）と共有結合さ4.5μmの常磁性ラテックスビーズの表面上に固定化された抗Fasモノクローナル抗体（アポトーシス誘導シグナル）で構成されています。彼らは、Fas / FasLの抗原特異的様式で複数の特異性のT細胞の培養物からファッションを媒介活性化誘導細胞死（AICD）経路とは無関係に抗原特異的T細胞を枯渇させる。標的T細胞において用量依存性アポトーシスは、すでに30分8後に急速に誘導される。 KaAPCを容易棚phenotオフに定義確実に制御された様式で生成することができYPEおよび細胞ベースの枯渇戦略の欠点のほとんどを克服する。したがって、KaAPCは、T細胞特異的治療戦略のフィールドを進め、T細胞媒介自己免疫疾患および同種移植片拒絶の治療のための大きな可能性を表示する。

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Human AB serum</td><td>Atlanta biologicals</td><td>S40110</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sodium azide</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>71289</td><td></td></tr><tr><td>M-450 epoxybeads</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>14011</td><td></td></tr><tr><td>MPC-1 magnet</td><td>Invitrogen/Dynal</td><td>12001D</td><td></td></tr><tr><td>Screw top glass vial</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-338AA</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Tube Rotator</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-753</td><td></td></tr><tr><td>anti-CD95 (clone CH11)</td><td>Milliore</td><td>05-201</td><td></td></tr><tr><td>HLA-A2-Ig dimer</td><td>BD/Pharmingen</td><td>551263</td><td></td></tr><tr><td>Cryo-tube 2 ml</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgG1 PE</td><td>BD/Pharmingen</td><td>559320</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse IgM FITC</td><td>BD/Pharmingen</td><td>553408</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride</td><td>Merck</td><td>S271-3</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride</td><td>Sigma/Aldrich</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>cellgro/Mediatech</td><td>25-060-CI</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>gibco/life technologies</td><td>11875-085</td><td></td></tr><tr><td>96-well Round bottom plate</td><td>Falcon</td><td>353077</td><td></td></tr><tr><td>AnnexinV FITC</td><td>PromoKine</td><td>PK-CA577-1001-1000</td><td></td></tr><tr><td>7-AAD</td><td>BD/Pharmingen</td><td>51-68981E</td><td></td></tr><tr><td>FACS tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr></tbody></table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

T細胞媒介性自己免疫疾患の現在の治療は長期的には、そのような感染または悪性腫瘍を制御する能力の低下などの有害な副作用を伴う、グローバル免疫抑制の戦略に主に依存している。したがって、新しいアプローチが唯一の疾患を媒介する細胞を標的とし、無傷で残っている免疫システムを残すことが開発される必要がある。過去10年間T細胞媒介免疫応答を調節するための細胞ベースの免疫療法戦略の多様な開発されてきた。これらのアプローチのほとんどは、寛容誘導抗原提示細胞（APC）に依存している。しかし、技術的に困難で面倒であることに加えて、そのような細胞ベースのアプローチは、それらの治療的能力を制限細胞傷害性T細胞応答に非常に敏感である。ここでは、再を残しながら病的なT細胞の枯渇を可能にする非細胞キラー人工抗原提示細胞の生成（KaAPC）のためのプロトコルを提示maining免疫系手つかずで機能的。 KaAPCは、抗原特異的な様式で、望ましくないT細胞応答を調節することにより、自己免疫疾患および同種移植片拒絶反応を治療するための可能性を有する細胞免疫療法に代わる解決策である。

このプロトコルの特徴は、HLA-A2-Igの（シグナル1）および細胞ベースのアプローチと比較してコーティングすることによって変更されないと同時に、抗Fasモノクローナル抗体を（アポトーシスシグナル）、表示KaAPC表現型の定義された発生を含むまたは形質導入の有効性と簡単に生産します（ 図1）の間に変調することができる。さらに、KaAPCは、T細胞の細胞傷害性エフェクター機能に敏感ではなく、それらの機能は、 インビトロ操作で事前および事後自家抗原提示細胞の品質に依存しない。 KaAPC KaAPCロードされた非同族のT細胞（ 図2）を枯渇させ、一方、同族ペプチドを負荷したとき、インビトロで抗原特異的T細胞を枯渇させることが可能である。したがって、KaAPCは、抗原特異的にT細胞のアポトーシスを誘導する。続いて、本発明者らは、異なるT細胞のSPEの混合物から抗原特異的T細胞の選択的枯渇KaAPCを使用最小限の細胞毒性は、隣接するT細胞に漏れたことを実証cificities、（ 図3）。したがって、KaAPCは、自己免疫疾患および同種移植片拒絶反応の治療のための潜在的な臨床適用性を有するヒト活性化した抗原特異的T細胞のインビトロ抗原特異的枯渇のための精巧なツールを表す。

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Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

ガイドラインが提示細胞キラー人工抗原の生成のために提示され、KaAPC、ヒト抗原特異的T細胞のインビトロ枯渇および抗原のT細胞媒介性自己免疫疾患の治療のための細胞免疫療法の代替ソリューションのための効率的なツール残りの免疫系を損なうことなく、特定の方法。

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）<em&gt;体外</em&gt;ヒト抗原特異的T細胞の枯渇

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.7K ビュー.  Johns Hopkins University. ガイドラインが提示細胞キラー人工抗原の生成のために提示され、KaAPC、ヒト抗原特異的T細胞のインビトロ枯渇および抗原のT細胞媒介性自己免疫疾患の治療のための細胞免疫療法の代替ソリューションのための効率的なツール残りの免疫系を損なうことなく、特定の方法。 

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Induction of Alloantigen-specific Anergy in Human Peripheral Blood Mononuclear Cells by Alloantigen Stimulation with Co-stimulatory Signal Blockade

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic diseases. Unfortunately, transplantation of alloreactive donor T cells which recognize and damage healthy patient tissues can result in Graft-versus-Host Disease (GvHD)1. One challenge to successful AHSCT is the prevention of GvHD without associated impairment of the beneficial effects of donor T cells, particularly immune reconstitution and prevention of relapse. GvHD can be prevented by non-specific depletion of donor T cells from stem cell grafts or by administration of pharmacological immunosuppression. Unfortunately these approaches increase infection and disease relapse2-4. An alternative strategy is to selectively deplete alloreactive donor T cells after allostimulation by recipient antigen presenting cells (APC) before transplant. Early clinical trials of these allodepletion strategies improved immune reconstitution after HLA-mismatched HSCT without excess GvHD5, 6. However, some allodepletion techniques require specialized recipient APC production6, 7and some approaches may have off-target effects including depletion of donor pathogen-specific T cells8and CD4 T regulatory cells9.One alternative approach is the inactivation of alloreactive donor T cells via induction of alloantigen-specific hyporesponsiveness. This is achieved by stimulating donor cells with recipient APC while providing blockade of CD28-mediated co-stimulation signals10.This "alloanergization" approach reduces alloreactivity by 1-2 logs while preserving pathogen- and tumor-associated antigen T cell responses in vitro11. The strategy has been successfully employed in 2 completed and 1 ongoing clinical pilot studies in which alloanergized donor T cells were infused during or after HLA-mismatched HSCT resulting in rapid immune reconstitution, few infections and less severe acute and chronic GvHD than historical control recipients of unmanipulated HLA-mismatched transplantation12. Here we describe our current protocol for the generation of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) which have been alloanergized to HLA-mismatched unrelated stimulator PBMC. Alloanergization is achieved by allostimulation in the presence of monoclonal antibodies to the ligands B7.1 and B7.1 to block CD28-mediated costimulation. This technique does not require the production of specialized stimulator APC and is simple to perform, requiring only a single and relatively brief ex vivo incubation step. As such, the approach can be easily standardized for clinical use to generate donor T cells with reduced alloreactivity but retaining pathogen-specific immunity for adoptive transfer in the setting of AHSCT to improve immune reconstitution without excessive GvHD.

This paper describes a simple technique to induce alloantigen-specific anergy in human peripheral blood mononuclear cells. The technique can be applied clinically to generate non-alloreactive donor cells. Infusion of these cells could improve immune reconstitution and reduce toxicity after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.

共刺激シグナル遮断によるアロ抗原刺激によるヒト末梢血単核球のアロ抗原特異的アネルギーの誘導

Allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (AHSCT) offers the best chance of cure for many patients with congenital and acquired hematologic ...

免疫・感染学

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals may exhibit suppressive immune microenvironment and, in contrast to activating CTL, their autologous antigen presenting cells may tend to tolerize or anergize antigen specific CTL. As a result, although still in the experimental phase, CTL-based adoptive immunotherapy has evolved to become a promising treatment for various diseases such as cancer and virus infections. In initial experiments ex vivo expanded CMV (cytomegalovirus) specific CTL have been used for treatment of CMV infection in immunocompromised allogeneic bone marrow transplant patients. While it is common to have life-threatening CMV viremia in these patients, none of the patients receiving expanded CTL develop CMV related illness, implying the anti-CMV immunity is established by the adoptively transferred CTL1. Promising results have also been observed for melanoma and may be extended to other types of cancer2. 
While there are many ways to ex vivo stimulate and expand human CTL, current approaches are restricted by the cost and technical limitations. For example, the current gold standard is based on the use of autologous DC. This requires each patient to donate a significant number of leukocytes and is also very expensive and laborious. Moreover, detailed in vitro characterization of DC expanded CTL has revealed that these have only suboptimal effector function 3. 
Here we present a highly efficient aAPC based system for ex vivo expansion of human CMV specific CTL for adoptive immunotherapy (Figure 1). The aAPC were made by coupling cell sized magnetic beads with human HLA-A2-Ig dimer and anti-CD28mAb4. Once aAPC are made, they can be loaded with various peptides of interest, and remain functional for months. In this report, aAPC were loaded with a dominant peptide from CMV, pp65 (NLVPMVATV). After culturing purified human CD8+ CTL from a healthy donor with aAPC for one week, CMV specific CTL can be increased dramatically in specificity up to 98% (Figure 2) and amplified more than 10,000 fold. If more CMV-specific CTL are required, further expansion can be easily achieved by repetitive stimulation with aAPC. Phenotypic and functional characterization shows these expanded cells have an effector-memory phenotype and make significant amounts of both TNF&alpha; and IFN&gamma; (Figure 3).

HLA-Ig Based Artificial Antigen Presenting Cells for Efficient ex vivo Expansion of Human CTL

A new DC independent method for induction and expansion of antigen-specific T cells is described. HLA A2-Ig based artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) are loaded with HLA-A2 restricted peptides to efficiently expand CTL of diverse antigen specificity. This technology holds great potential for CTL-based adoptive immunotherapy.

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

CTL with optimal effector function play critical roles in mediating protection against various intracellular infections and cancer. However, individuals ...

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response following an infection. Despite efforts to identify unique surface marker on Tregs, the only unique feature is their ability to suppress the proliferation and function of effector T cells. While it is clear that only in vitro assays can be used in assessing human Treg function, this becomes problematic when assessing the results from cross-sectional studies where healthy cells and cells isolated from subjects with autoimmune diseases (like Type 1 Diabetes-T1D) need to be compared. There is a great variability among laboratories in the number and type of responder T cells, nature and strength of stimulation, Treg:responder ratios and the number and type of antigen-presenting cells (APC) used in human in vitro suppression assays. This variability makes comparison between studies measuring Treg function difficult. The Treg field needs a standardized suppression assay that will work well with both healthy subjects and those with autoimmune diseases. We have developed an in vitro suppression assay that shows very little intra-assay variability in the stimulation of T cells isolated from healthy volunteers compared to subjects with underlying autoimmune destruction of pancreatic &beta;-cells. The main goal of this piece is to describe an in vitro human suppression assay that allows comparison between different subject groups. Additionally, this assay has the potential to delineate a small loss in nTreg function and anticipate further loss in the future, thus identifying subjects who could benefit from preventive immunomodulatory therapy1. Below, we provide thorough description of the steps involved in this procedure. We hope to contribute to the standardization of the in vitro suppression assay used to measure Treg function. In addition, we offer this assay as a tool to recognize an early state of immune imbalance and a potential functional biomarker for T1D.

Human In Vitro Suppression as Screening Tool for the Recognition of an Early State of Immune Imbalance

Tregs are potent suppressors of the immune system. There is a lack of unique surface markers to define them, hence, definitions of Tregs are primarily functional. Here we describe an optimized in vitro assay capable of identifying immune imbalance in subjects at risk to develop T1D.

ヒトのインビトロ</em免疫バランスの初期状態の認識のためのスクリーニングツールとして>抑制

Regulatory T cells (Tregs) are critical mediators of immune tolerance to self-antigens. In addition, they are crucial regulators of the immune response ...

Fabrication of Anisotropic Polymeric Artificial Antigen Presenting Cells for CD8+ T Cell Activation

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular substrates offer key advantages over cell-based aAPC, including precise control of signal presentation parameters and physical properties of the aAPC surface to modulate its interactions with T cells. aAPC constructed from anisotropic particles, particularly ellipsoidal particles, have been shown to be more effective than their spherical counterparts at stimulating T cells due to increased binding and larger surface area available for T cell contact, as well as reduced nonspecific uptake and enhanced pharmacokinetic properties. Despite increased interest in anisotropic particles, even widely accepted methods of generating anisotropic particles such as thin-film stretching can be challenging to implement and use reproducibly.
To this end, we describe a protocol for the rapid, standardized fabrication of biodegradable anisotropic particle-based aAPC with tunable size, shape, and signal presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo, along with methods to characterize their size, morphology, and surface protein content, and to assess their functionality. This approach to fabricating anisotropic aAPC is scalable and reproducible, making it ideal for generating aAPC for &#34;off-the-shelf&#34; immunotherapies.

Here, we present a protocol to quickly and reproducibly generate biologically inspired, biodegradable articifical antigen presenting cells (aAPC) with tunable size, shape, and surface protein presentation for T cell expansion ex vivo or in vivo.

異方性高分子人工抗原提示細胞 cd 8 + T 細胞活性化のための加工

Artificial antigen presenting cells (aAPC) are a promising platform for immune modulation due to their potent ability to stimulate T cells. Acellular ...

環境学

Using Human Induced Pluripotent Stem Cells for the Generation of Tumor Antigen-specific T Cells

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of patients with advanced cancer. Adoptive T cell transfer (ACT) of highly enriched tumor antigen-specific T cells has been shown to cause durable regression of metastatic cancer in some patients. However, during expansion, these cells may become exhausted or senescent, limiting their effector function and persistence in vivo. Induced pluripotent stem cell (iPSC) technology may overcome these obstacles by leading to in vitro generation of large numbers of less differentiated tumor antigen-specific T cells. Human iPSC (hiPSC) have the capacity to differentiate into any type of somatic cell, including lymphocytes, which retain the original T cell receptor (TCR) genomic rearrangement when a T cell is used as a starting cell. Therefore, reprogramming of human tumor antigen-specific T cells to hiPSC followed by redifferentiation to T cell lineage has the potential to produce rejuvenated tumor antigen-specific T cells. Described here is a method for generating tumor antigen-specific CD8&#945;&#946;+ single positive (SP) T cells from hiPSC using OP9/DLL1 co-culture system. This method is a powerful tool for in vitro T cell lineage generation and will facilitate the development of in vitro derived T cells for use in regenerative medicine and cell-based therapies.

This article describes a method to generate functional tumor antigen-specific induced pluripotent stem cell-derived CD8&#945;&#946;+ single positive T cells using OP9/DLL1 co-culture system.

腫瘍抗原特異的T細胞の生成にヒト誘導多能性幹細胞を用いた

The generation and expansion of functional T cells in vitro can lead to a broad range of clinical applications. One such use is for the treatment of ...

がん研究

Artificial Antigen Presenting Cell (aAPC) Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike classical T cells, NKT cells recognize lipid antigen in the context of CD1 molecules2. NKT cells express an invariant TCR&alpha; chain rearrangement: V&alpha;14J&alpha;18 in mice and V&alpha;24J&alpha;18 in humans, which is associated with V&beta; chains of limited diversity3-6, and are referred to as canonical or invariant NKT (iNKT) cells. Similar to conventional T cells, NKT cells develop from CD4-CD8- thymic precursor T cells following the appropriate signaling by CD1d 7. The potential to utilize NKT cells for therapeutic purposes has significantly increased with the ability to stimulate and expand human NKT cells with &alpha;-Galactosylceramide (&alpha;-GalCer) and a variety of cytokines8. Importantly, these cells retained their original phenotype, secreted cytokines, and displayed cytotoxic function against tumor cell lines. Thus, ex vivo expanded NKT cells remain functional and can be used for adoptive immunotherapy. However, NKT cell based-immunotherapy has been limited by the use of autologous antigen presenting cells and the quantity and quality of these stimulator cells can vary substantially. Monocyte-derived DC from cancer patients have been reported to express reduced levels of costimulatory molecules and produce less inflammatory cytokines9,10. In fact, murine DC rather than autologous APC have been used to test the function of NKT cells from CML patients11. However, this system can only be used for in vitro testing since NKT cells cannot be expanded by murine DC and then used for adoptive immunotherapy. Thus, a standardized system that relies on artificial Antigen Presenting Cells (aAPC) could produce the stimulating effects of DC without the pitfalls of allo- or xenogeneic cells12, 13. Herein, we describe a method for generating CD1d-based aAPC. Since the engagement of the T cell receptor (TCR) by CD1d-antigen complexes is a fundamental requirement of NKT cell activation, antigen: CD1d-Ig complexes provide a reliable method to isolate, activate, and expand effector NKT cell populations.

Artificial Antigen Presenting Cell aAPC Mediated Activation and Expansion of Natural Killer T Cells

Here we describe a method for activating and expanding human NKT cells from bulk T cell populations using artificial antigen presenting cells (aAPC). The use of CD1d-based aAPC provides a standardized method for generating high numbers of functional NKT cells.

ナチュラルキラーT細胞の細胞（AAPC）媒介活性化と増殖を提示する人工抗原

Natural killer T (NKT) cells are a unique subset of T cells that display markers characteristic of both natural killer (NK) cells and T cells1. Unlike ...

Enrich and Expand Rare Antigen-specific T Cells with Magnetic Nanoparticles

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of antigen-specific T cells, B) probe the dynamics of antigen-specific responses, C) understand how antigen-specific responses affect disease state such as autoimmunity, D) demystify heterogeneous responses for antigen-specific T cells, or E) utilize antigen-specific cells for therapy. The tool is based on a magnetic particle that we conjugate antigen-specific and T cell co-stimulatory signals, and that we term as artificial antigen presenting cells (aAPCs). Consequently, since the technology is simple to produce, it can easily be adopted by other laboratories; thus, our purpose here is to describe in detail the fabrication and subsequent use of the aAPCs. We explain how to attach antigen-specific and co-stimulatory signals to the aAPCs, how to utilize them to enrich for antigen-specific T cells, and how to expand antigen-specific T cells. Furthermore, we will highlight engineering design considerations based on experimental and biological information of our experience with characterizing antigen-specific T cells.

Antigen-specific T cells are difficult to characterize or utilize in therapies due to their extremely low frequency. Herein, we provide a protocol to develop a magnetic particle which can bind to antigen-specific T cells to enrich these cells and then to expand them several hundred-fold for both characterization and therapy.

豊かにし、磁性ナノ粒子でまれな抗原特異的 T 細胞を展開

We have developed a tool to both enrich and expand antigen-specific T cells. This can be helpful in cases such as to A) detect the existence of ...

工学

Generation of Human Alloantigen-specific T Cells from Peripheral Blood

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide antigens presented by MHC (human ortholog HLA) molecules through the T cell receptor (TCR) in a highly sensitive and specific manner. While the primary function of T cells is to mediate protective immune responses to foreign antigens presented by self-MHC, T cells respond robustly to antigenic differences in allogeneic tissues. T cell responses to alloantigens can be described as either direct or indirect alloreactivity. In alloreactivity, the T cell responds through highly specific recognition of both the presented peptide and the MHC molecule. The robust oligoclonal response of T cells to allogeneic stimulation reflects the large number of potentially stimulatory alloantigens present in allogeneic tissues. While the breadth of alloreactive T cell responses is an important factor in initiating and mediating the pathology associated with biologically-relevant alloreactive responses such as graft versus host disease and allograft rejection, it can preclude analysis of T cell responses to allogeneic ligands. To this end, this protocol describes a method for generating alloreactive T cells from naive human peripheral blood leukocytes (PBL) that respond to known peptide-MHC (pMHC) alloantigens. The protocol applies pMHC multimer labeling, magnetic bead enrichment and flow cytometry to single cell in vitro culture methods for the generation of alloantigen-specific T cell clones. This enables studies of the biochemistry and function of T cells responding to allogeneic stimulation.

This article describes a method for the generation and propagation of human T cell clones that specifically respond to a defined alloantigen. This protocol can be adapted for cloning human T cells specific for a variety of peptide-MHC ligands.

末梢血からのヒトアロ抗原特異的T細胞の生成

The study of human T lymphocyte biology often involves examination of responses to activating ligands. T cells recognize and respond to processed peptide ...

High-Efficiency Generation of Antigen-Specific Primary Mouse Cytotoxic T Cells for Functional Testing in an Autoimmune Diabetes Model

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the spontaneous non-obese diabetes (NOD) mouse model, insulin is the primary target, and genetic manipulation of these animals to remove a single key insulin epitope prevents disease. Thus, selective elimination of professional antigen presenting cells (APCs) bearing this pathogenic epitope is an approach to inhibit the unwanted insulin-specific autoimmune responses, and likely has greater translational potential.
Chimeric antigen receptors (CARs) can redirect T cells to selectively target disease-causing antigens. This technique is fundamental to recent attempts to use cellular engineering for adoptive cell therapy to treat multiple cancers. In this protocol, we describe an optimized T-cell retrovirus (RV) transduction and in vitro expansion protocol that generates high numbers of functional antigen-specific CD8 CAR-T cells starting from a low number of naive cells. Previously multiple CAR-T cell protocols have been described, but typically with relatively low transduction efficiency and cell viability following transduction. In contrast, our protocol provides up to 90% transduction efficiency, and the cells generated can survive more than two weeks in vivo and significantly delay disease onset following a single infusion. We provide a detailed description of the cell maintenance and transduction protocol, so that the critical steps can be easily followed. The whole procedure from primary cell isolation to CAR expression can be performed within 14 days. The general method may be applied to any mouse disease model in which the target is known. Similarly, the specific application (targeting a pathogenic peptide/MHC class II complex) is applicable to any other autoimmune disease model for which a key complex has been identified.

This article describes a protocol for the generation of antigen-specific CD8 T cells, and their expansion in vitro, with the aim of yielding high numbers of functional T cells for use in vitro and in vivo.

自己免疫性糖尿病モデルにおける機能試験用抗原特異的一次マウス細胞傷害性T細胞の高効率生成

Type 1 Diabetes (T1D) is characterized by islet-specific autoimmunity leading to beta cell destruction and absolute loss of insulin production. In the ...

Generation of Human Regulatory T Cell Clones

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based on the identification of Treg through several activation-dependent cellular surface markers with varying expression levels in different physiologic and pathologic conditions. Populations isolated as &#8220;Treg&#8221; therefore often contain considerable numbers of non-Treg effector cells (i.e., Teff) which hamper the precise phenotypic and functional characterization of these cells, their genomic and proteomic characterization, their reliable enumeration in different states of health and disease, as well as their isolation and expansion for therapeutic purposes. The latter, in particular, remains a major hurdle, as the inadvertent expansion of effector cells homing in Treg-relevant cellular compartments (e.g., CD4+CD25+ T cells) may render Treg-based immunotherapy ineffective, or even harmful. This work presents a method that circumvents the problems associated with population-based isolation and expansion of Treg and shows that the generation of Treg candidate clones with the subsequent selection, culture, and expansion of only carefully vetted, monoclonal cells, enables the generation of an ultrapure Treg cell product that can be kept in culture for many months, enabling downstream investigation of these cells, including for possible therapeutic applications.

This protocol describes the cloning and expansion of human regulatory T cells for the generation of ultra-high purity viable human Treg with stable demethylation at the Treg-specific demethylated region (TSDR) and Treg-specific phenotypic features.

Human regulatory T cells (Treg) are notoriously difficult to isolate in high purity given the current methods of Treg enrichment. These methods are based ...

効率的なためキラー人工抗原提示細胞（KaAPC）

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