Bu çalışma Alman Araştırma Vakfı (DFG) SCHU-2681 / 1-1 (CS) ve KFO 146 (MF) tarafından desteklenmiştir, Savunma hibe PC DOD Bölümü 040972 (MO) ve Sağlık Ulusal Enstitüsü RO1&#39;e CA108835 verir , RO1 Ai44129 (Jps)

HLA-A2-lg Tabanlı KaAPC 1. Üretimi <ol><li> Steril borat tamponu hazırlayın. Su içinde borik asit içindeki bir 0.1 M bir solüsyon yapmak ve 7.0 pH değerinin ayarlanması. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril boncuk yıkama tamponu hazırlayın. Magnezyum ve kalsiyum içermeyen fosfat tamponlu serum fizyolojik (PBS) kullanılır. % 3 nihai konsantrasyon, insan AB serumu ekleyin. 2 mM nihai konsantrasyon için etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ilave edin. % 0.01 nihai konsantrasyona sodyum azid (NaN3) ekleyin. Steril filtre (0.22 um) tamponu ve 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> Steril içine stoktan epoksi boncuklar (yaklaşık 100 x 10 6 boncuk) 250 ul aktarın, cam tüpe vida. </li><li> Borat tampon 250 ul ilave edin. </li><li> Bir mıknatıs cam şişeyi koyun ve boncuk 2 dakika uymak edelim; aspirat tampon ve mıknatıstan cam şişeyi çıkarın. </li><li> 1 ml borat tamponu ile bir kez boncuk yıkayın. </li><li> 0.018 mcg 550 ul içine süspanse boncuklar/ Ml HLA-A2-lg ve 3.64 ug / ml anti-insan CD95 mAb (klon CH11) ve hafifçe sallanarak karıştırılır. (Ek bilgi için tartışma bölümüne bakınız.) </li><li> 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, ucuna bir döndürücü ucunda cam tüpe inkübe edin. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> 2 dakika için bir mıknatıs üzerine cam şişe yerleştirin ve &quot;KaAPC yükleme çözüm&quot; aspire; , mıknatıs cam flakonun çıkarılması boncuk yıkama tamponu 1 ml ekleyin ve sallayarak dikkatle tekrar süspansiyon. </li><li> Adımı yineleyin 1.10 iki kez. </li><li> 1 mi boncuk yıkama tampon maddesi içinde, 24 saat boyunca 4 ° C &#39;de, bir döndürücü üzerinde cam tüpe inkübe edin. Bu noktada, tüm bağlanma yerleri artan protein boncuk yıkama tamponu içinde bulunan insan AB serumu ile bloke edilir. </li><li> 2 dakika boyunca 300 xg&#39;de boncuk aşağı doğru döndürün. </li><li> Yer cam 2 dakika ve aspire boncuk yıkama tamponu için bir mıknatıs üzerine flakon; mıknatıstan cam tüpe çıkarın ve 1 ml PBS ile bir çözüm yerine. </li></ol> 2. Kalite Kontrol, Peptide Yükleme, Wkülleme, Depolama ve KaAPC Kararlılık <ol><li> Bir FACS tüpü içine, 1.5 x 10 5 KaAPC aktarın ve FACS yıkama tamponu 1 ml ile yıkayın. </li><li> Tampon ve tespiti için, ve anti-fare IgM FITC (klon R6-60.2 1 ul (HLA-A2-Ig Fc bölümü tespiti için), anti-fare IgG1 PE 1 ul yıkama 100 ul FACS içinde süspanse boncuk anti-insan CD95 mAb). </li><li> Tampon ve akış sitometrisi ile lekeleme yıkama oku 250 ul FACS 1 ml FACS yıkama tamponu ve tekrar süspansiyon ile yıkayınız, 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca inkübe edin. </li></ol><img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" width="500" /> Protokol bölümünde belirtildiği gibi yapılan bir KaAPC toplu Şekil 1. QC lekesi. Lekelenmesi anti-insan CD95 ise, 2. HLA-A2-lg bir anti-fare-PE IgG1 mAb protokolü kullanılarak tespit edilmiştir bölümünde tarif edildiği gibi gerçekleştirildi (anti-Fas) (se protokolüne bir anti-fare-FITC ile IgM mAb ile saptandıavranış 2.2) (mavi çizgi). Dolgulu siyah grafikler, sırasıyla anti-fare-PE IgG1 mAb ya da anti-fare FITC-lgM mAb ile lekelenmiş, boş boncuklar temsil eder. Sağ üst köşedeki sayılar ortalama floresan yoğunluğu (MFI) gösterir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="4"><li> Yeni bir steril cam şişenin içine peptid yükleme devri 20 x 10 6 KaAPC için, 2 dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin, 5 ug peptit ile 500 ul taze PBS içine aspire PBS ve tekrar süspansiyon boncuk (Unutmayın, sadece HLA-A2 kısıtlı peptidler olacak dimer üzerine bağlanan!). </li><li> Mağaza HLA-A2-lg dimer üzerine yeterli bir peptit yüklenmesine olanak sağlamak üzere, en az 3 gün süre ile, kullanılana kadar 4 ° C &#39;de KaAPC yüklendi. </li><li> Kullanımdan hemen önce, 1,14 belirtildiği gibi KaAPC yüklenen peptidi yıkama; Bu adımı en az 6x tekrarlayın. NOT: Bu ücretsiz peptid t sahip olmasını sağlamak için önemli bir adımdıro yalancı pozitif öldürme sonuçları önlemek için tamamen çıkarılmalıdır; artık serbest peptid antijene özgü T hücre kültürlerinin 9 apoptosisi teşvik ettiği gösterilmiştir. Çözünebilir peptid etkisini ortadan kaldırabilmek için, yüklenen peptid süpernatant kontrol örnekleri çalıştırmak ve KaAPC (3.8 bakınız) yıkandı. </li><li> Hemasitometre kullanarak boncuk saymak ve peptit ve konsantrasyon tarih, adı ile etiketleyin. NOT: Yüklü KaAPC en az bir ay boyunca 4 ° C &#39;de işlevsel kalır. Bir ay sonra, aynı peptid ile yeniden yükleme KaAPC bir yıla kadar kullanılmasını sağlar. </li></ol> 3. KaAPC İn Vitro Öldürme Deneyi <ol><li> Ko-kültür ortamı hazırlayın. Ve% 3 otolog plazma verici (laboratuarda yapılan 6) 3% T hücre büyüme faktörü ile desteklenmiş tam RPMI ortamı hazırlayın. Donör otolog plazma mevcut değilse, ısı ile inaktive edilmiş insan AB serumu kullanın. </li><li> AnnexinV bağlama tamponu hazırlanmasını hazırlayın. 8.12 g sodyum klorür (NaCI) ve 0.12 g kireci çözündürün990 mi ile kombine edilmiştir 2&#39;ye amonyum klorür (CaCl2), 10 ml 1 M HEPES tamponu O.Add. </li><li> Insan antijen-spesifik T hücrelerini oluşturur. (Ayrıntılı bir protokol için yapay antijen sunan hücreler (aAPC) kullanan bir önceki yayını 7 bakınız). Bu peptid özgünlüğü tetramer boyama ile saptandığı haliyle en azından&gt;% 75 olduğundan emin olun. </li><li> Nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde 48 saat boyunca KaAPC 1 oranında, 37 ° C de Her numune için, 2 x 10 5 antijene spesifik T hücre / göz (96 yuvarlak tabanlı plaka içindeki), 1 ortak-kültür ortamı içinde 200 ul inkübe C ve% 5 CO2. </li><li> Hasat örnekler ve bir FACS tüpü içine transferi; 1 ml bağlayıcı tampon ile AnnexinV yıkama 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de spin AnnexinV bağlayıcı tampon 100 ul supernatant ve tekrar süspansiyon atmak </li><li> 1 ul AnnexinV FITC ve oda sıcaklığında 10-15 dakika boyunca 5 ul 7-AAD ile Leke örnekleri, 1 mi AnnexinV bağlama tamponu ile yıkama; , 5 dakika boyunca 300 xg&#39;de dönme üst sıvı bir atın250 ul AnnexinV bağlama tamponu içinde tekrar süspansiyon d </li><li> Akış sitometresi örnekleri hemen okuyun. </li><li> KaAPC antijen spesifik öldürmeyi belirlemek için aşağıdaki örnekleri hazırlayın: T hücrelerinin sadece; + T hücreleri, çözünür anti-CD95; T hücreleri boşaltılmış KaAPC +; T hücreleri + olmayan soydaş peptid KaAPC yüklenir; T hücreleri, ortak kökenli + peptid KaAPC yüklenir; Ortak kökenli peptitin T hücreleri + yüzer KaAPC yüklendi. </li></ol><img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" width="500" /> ., CMVpp65 spesifik T hücreleri (~% 80) 1 oranında, hasat edilmiş ve daha sonra AnnexinV ile boyanmıştır: Şekil 2. KaAPC öldürme deneyi bir Peptid 1 de 48 saat süre ile kültüre KaAPC ya da kontrol boncuk (HLA-A2-lg sadece boncuk) yüklendi edildi ve propidyum iyodür (PI). flow sitometri (bkz protokol bölüm 3.3-3.7) tarafından &quot;soydaş&quot; apopitozun olmak &quot;non-soydaş&quot; CMVpp65 ve yüklü boncuk atıfta içinMart-1 peptid ile yüklü reklamlar. Sayılar her arsa sol alt kadranda canlı T hücrelerinin yüzdesini göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <ol start="9"><li> , Çapraz-deneyler yaparak, iki farklı özelliklerin antijene-özgü T hücrelerinin üretilmesi için. </li><li> Bundan başka, T hücre popülasyonunun heterojen T hücrelerinin antijene özgü bir eleme analizi ile eşzamanlı KaAPC antijene spesifik tükenmesinin-yeteneklerini değerlendirmek. (Ayrıntılı bir protokol için Schütz ark bakınız. 10). </li></ol>

<ol>
	<li>Bizzaro, N., Tozzoli, R., Shoenfeld, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+we+at+a+stage+to+predict+autoimmune+rheumatic+diseases.">Are we at a stage to predict autoimmune rheumatic diseases.</a> Arthritis and rheumatism. 56 (6), 1736-1744 (2007).</li><li>Sch&#252;tz, C., Oelke, M., Schneck, J. P., Mackensen, A., Killer Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells:+the+synthetic+embodiment+of+a+&#8220;guided+missile.">artificial antigen-presenting cells: the synthetic embodiment of a &#8220;guided missile.</a> Immunotherapy. 2 (4), 539-550 (2010).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mature+but+not+immature+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+human+monocyte-derived+dendritic+cells+are+protected+from+Fas-mediated+apoptosis+and+can+be+used+as+killer+APC.">Mature but not immature Fas ligand (CD95L)-transduced human monocyte-derived dendritic cells are protected from Fas-mediated apoptosis and can be used as killer APC.</a> Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 170 (11), 5406-5413 (2003).</li><li>Hoves, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elimination+of+activated+but+not+resting+primary+human+CD4++and+CD8++T+cells+by+Fas+ligand+(FasL/CD95L)-expressing+Killer-dendritic+cells.">Elimination of activated but not resting primary human CD4+ and CD8+ T cells by Fas ligand (FasL/CD95L)-expressing Killer-dendritic cells.</a> Immunobiology. 208 (5), 463-475 (2004).</li><li>Sch&#252;tz, C., Hoves, S., Halbritter, D., Zhang, H. -. G., Mountz, J. D., Fleck, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alloantigen+specific+deletion+of+primary+human+T+cells+by+Fas+ligand+(CD95L)-transduced+monocyte-derived+killer-dendritic+cells.">Alloantigen specific deletion of primary human T cells by Fas ligand (CD95L)-transduced monocyte-derived killer-dendritic cells.</a> Immunology. 133 (1), 115-122 (2011).</li><li>Oelke, M., Maus, M. V., Didiano, D., June, C. H., Mackensen, A., Schneck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+induction+and+expansion+of+antigen-specific+cytotoxic+T+cells+by+HLA-Ig-coated+artificial+antigen-presenting+cells.">Ex vivo induction and expansion of antigen-specific cytotoxic T cells by HLA-Ig-coated artificial antigen-presenting cells.</a> Nature. 9 (5), 619-624 (2003).</li><li>Chiu, Y. -. L., Schneck, J. P., Oelke, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HLA-Ig+based+artificial+antigen+presenting+cells+for+efficient+ex+vivo+expansion+of+human+CTL.">HLA-Ig based artificial antigen presenting cells for efficient ex vivo expansion of human CTL.</a> Journal of Visualized Experiments : JoVE. (50), (2011).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Killer+artificial+antigen-presenting+cells:+a+novel+strategy+to+delete+specific+T+cells.">Killer artificial antigen-presenting cells: a novel strategy to delete specific T cells.</a> Blood. 111 (7), 3546-3552 (2008).</li><li>Snow, A. L., Pandiyan, P., Zheng, L., Krummey, S. M., Lenardo, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+power+and+the+promise+of+restimulation-induced+cell+death+in+human+immune+diseases.">The power and the promise of restimulation-induced cell death in human immune diseases.</a> Immunological reviews. 236 (1), 68-82 (2010).</li><li>Sch&#252;tz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+flow+cytometric+assay+for+the+simultaneous+analysis+of+antigen-specific+elimination+of+T+cells+in+heterogeneous+T+cell+populations.">A new flow cytometric assay for the simultaneous analysis of antigen-specific elimination of T cells in heterogeneous T cell populations.</a> Journal of immunological. 344 (2), 98-108 (2009).</li><li>Shen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=artificial+antigen-presenting+cells+deplete+alloantigen-specific+T+cells+in+a+murine+model+of+alloskin+transplantation.">artificial antigen-presenting cells deplete alloantigen-specific T cells in a murine model of alloskin transplantation.</a> Immunology letters. 138 (2), 144-155 (2011).</li><li>Perica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+artificial+antigen+presenting+Cells+for+T+cell+immunotherapy.">Nanoscale artificial antigen presenting Cells for T cell immunotherapy.</a> Nanomedicine nanotechnology, biology, and medicine. 10 (1), 119-129 (2013).</li><li>Sunshine, J. C., Perica, K., Schneck, J. P., Green, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Particle+shape+dependence+of+CD8++T+cell+activation+by+artificial+antigen+presenting+cells.">Particle shape dependence of CD8+ T cell activation by artificial antigen presenting cells.</a> Biomaterials. 35 (1), 269-277 (2013).</li></ol>

CS ve MF ifşa hiçbir şey yok. NexImmune ve Johns Hopkins Üniversitesi, Dr arasında bir lisans anlaşması altında. Schneck ve Oelke bu makalede açıklanan aAPC ürünlerinin satışlarında Üniversitesi tarafından alınan lisanslı hisse hakkına sahiptir. Onlar da Üniversite politikası uyarınca belirli kısıtlamalara tabidir NexImmune stok sahibi. Dr Schneck şirket &quot;ler Yönetim Kurulu ve Bilimsel Danışma Kurulu üyesidir. Bu düzenlemenin koşulları faiz politikalarında ihtilafı uyarınca Johns Hopkins Üniversitesi tarafından yönetiliyor.

Protokolde en önemli nokta sinyali 1 (peptid-MHC) ve sinyal 2 (anti-Fas mAb) uygun oranının sağlamaktır. Biz sinyali 1 ve 2 için mükemmel oranını tanımlamak için yoğun titrasyon deneyleri var; nedeniyle HLA-A2 ile lg dimer ya da anti-Fas mAb konsantrasyonlarında çok az farklar varyasyonlar KaAPC işlevselliği de müdahale edebildiği de ortaya çıkmıştır. Böylece, hem sinyallerin yoğunluğunun her zaman kontrol edilmelidir ve her iki protein kalitesi genellikle bu ticari bir kaynaktan sipariş olsa bile test edilmelidir. Farklı tespit deneyleri, farklı konsantrasyonlarda neden olabilir Dahası, konsantrasyon her zaman aynı deneyi ile tespit edilir. HLA-A2-Ig işlevselliği, aynı zamanda, tam olmayan katlama ve / veya verimsiz peptit yüküne bozulabilir. Ayrıca dimer molekülleri proteinin işlevsel etkinliği üzerindeki etkisi olabilir, farklı derecelerde burada toplayabilir. Bu nedenle, actudimer ark miktarı değişebilir ve belirli fonksiyonel KaAPC üretilmesi için gerekli. Ayrıca, sinyal KaAPC anti Fas mAb indükleyici ölümü için ideal aralık son derece sıkı olduğu bulunmuştur. Bizim elimizde büyük miktarlarda 3.64 ug / ml &#39;nin altında miktarları, doza bağlı olarak, indirgenmiş öldürme aktivitesi ile sonuçlanırken mi, Fas pozitif T hücre spesifik olmayan öldürülmesine yol / 3.64 ug. Bu koşullar oldukça sıkı gibi ise de, bu ayrıntıları bir dikkat ve spesifik fonksiyonel KaAPC üretilmesiyle sonuçlanacaktır. Mevcut KaAPC fenotipi saf ya da dinlenme antijen-spesifik T hücrelerini hedefleyen antijene özel aktive edilmiş T hücreleri, ön deneylerde tükenmesi için işlevsel olduğunu da bu popülasyonlar, Fas düşürülmüş sentezlenmesine sahip antijen-özel apoptosis anlamlı endüksiyonunu gösterdi. Bu nedenle, bunları açmak yapmak Hareketsiz T hücreleri üzerinde Fas yukarı düzenlenmesini teşvik etmek için KaAPC üzerine ko-stimülatör bir sinyal ekleme olabilir tasavvurKaAPC için bir hedef haline. Bunun mümkün olduğu da her üç sinyal, dikkatli bir şekilde fonksiyonel bir KaAPC fenotip temin etmek için titre edilmesi gerekir. Bir biyo-uyumlu ya da biyo-bozunabilir matris, damak platformu ayarlanması in vivo uygulanabilirliği KaAPC arttıracaktır. Son zamanlarda, Shen ve ark. KaAPC -TRP2 11b, anti-Fas (klon Jo2) ve anti-His / H2-Kd konjüge 5 um lateks boncuklar kullanılarak in vivo kullanımı başarılı bildirmişlerdir. Bu yapay antijen sunan hücreler (aAPC) &#39;deki genel kavramı başarılı bir şekilde mil boyutlu parçacıklar 12 um büyüklükte transfer edilebilir ve bu işlevsellik parçacık geometrisine 13 etkisi olduğunu göstermek mümkün olmuştur. Bu yüzden, boyutu ve / veya gelecekteki KaAPC şekli değiştirilerek bir organa özgü otoimmün hastalıkların başarılı bir tedavisi için bir anahtar olabilir in vivo işlevselliği ve biyo-dağılımı üzerindeki etkisi mümkün olabilir tasarlar. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; KaAPC donör durumu ve ön arıtma bağımsızdır, zaman ve maliyet etkin bir yaklaşım &quot;raftan&quot; kullanımı kolay bir hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin önemli eksikliklerin üstesinden. KaAPC kişisel ya da parakrin öldürme sinyal hedefleri ve CTL&#39;nin sitolitik efektör fonksiyonlara duyarlı değildirler. KaAPC ilgili hastalık antijenin belirlenmesini gerektirir ve spesifik HLA tipi üzerinde de durulacaktır. Tip 1 diyabet için halen çeşitli uygun HLA-A2 ile kısıtlı antijenler birlikte, GvHH skleroz ve katları 2, i daha da artırmak ve uygulanabilirliğini genişletecektir moleküllerin yanı sıra, yeni otoimmün ilgili antijenlerin tanımlanmasını eden dimer ilave HLA sınıf gelişimini tespit edilmiştir KaAPC. Ayrıca tek bir aynı anda birden fazla antijenleri hedeflemek üzere farklı epitoplarına yönelik KaAPC kullanılarak düşünülebilir. Özetle, KaAPC bir için esnek bir platformdur teknolojiyi temsilantigene-özgü T hücresi kaybı. Onların &quot;lego benzeri&quot; yapısı örneğin genişletmek ve in vitro ve in vivo uygulanabilirliği ve bunların daha sonradan arttırabildiğini gibi çeşitli matrisler üzerinde PD1 veya izleme aracı olarak ek yardımcı-uyarıcı ya da inhibitör sinyalleri, yeni sinyalleri dahil sağlar. Bu yazıda KaAPC farklı özellikteki T hücresi bunların karışımlarından antijen-spesifik T hücrelerinin ortadan kaldırılması için, birinci kordon dayalı yaklaşımı oluşturmak için adım adım protokol mevcut. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" width="500" /> Şekil 3. KaAPC antijen spesifik şekilde CTL ortadan kaldırmak veya 1 Fas + efektör-hafızalı CTL aktive PKH26-etiketlenmiş ve karıştırıldı aynı donörden alınan CMVpp65 özgü CTL PKH67 etiketli:. CMVpp65 KaAPC 1 oranında, ve ko-kültive 48 saat karıştırıldı. Kontrol kültürleri yüksüz KaAPC ya da 1 ug / ml ile muamele edildisuda çözünür, anti-Fas mAb (klon CH11). Canlı hücreler minimum kaybı muamele edilmemiş karışık CTL kültürlerinde (t karışımı) olarak tespit edilmiştir. T karışımı her CTL nüfus için orijinal FACS verileri gösterilmiştir. Önce her iki T hücre popülasyonlarının 10 ayrı yolluk tarafından yayınlanan apoptoz analizi yapıldı. Sol üst kadranda tasvir Numaraları toplam hücrelerin% temsil eder. Gösteren Şekil, üç bağımsız deneyin üzerinden, temsilci bir deneyden elde edilir. Bu araştırma aslında Blood yayınlandı. . Schütz, C. ve ark katil yapay antijen sunan hücreler: yeni bir strateji spesifik T hücreleri silmek için kan.. 2008, 111, 3546-52. Telif Amerikan Hematoloji Derneği. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51859/51859fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Son yirmi yıl içinde çok fazla ilerleme otoimmün hastalıkların patojenik mekanizmasının anlaşılması yönünde gerçekleştirilen edilmiştir. Bununla birlikte, en yaygın tedavi yaklaşımları kortikosteroidler yanı sıra, purin analogları gibi bağışıklık bastırıcı ilaçlar, alkile edici maddeler ve kalsinörin inhibitörü 1 dayanmaktadır. Bu tür ilaçların kullanımı büyük ölçüde hastaların prognozu gelişmiş, henüz tedavi altta yatan immünolojik arıza tedavi sağlamaz. Ayrıca, hastalar enfeksiyonlara ve kanser gelişmesine karşı savunmasız hale gelir. Bu nedenle T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların ve allograft reddinin tedavisi için nihai hedefi özel olarak ise, aynı zamanda, el değmemiş ve immünolojik bozuklukları mücadele için yetkili kalan bağışıklık sistemini terk ederken neden olan T hücrelerinin sadece hastalık hedef etmektir. Kullanarak antijen-sunan hücreler (APC), periferal T hücresi tepkilerini bastırmak için bir tedavi olarak birinci kadar erken olarak nitelendirildiçeşitli gruplar tarafından 1970&#39;lerde. Daha sonra pek çok hücre tabanlı yaklaşımlar geliştirilmiştir beri (Schütz&#39;ün ve ark. 2 gözden). Immunoregülatuar hücreleri otoimmünite, allogreft reddi ve kronik enfeksiyonların tedavisi için terapötik potansiyelini gösteren umut verici sonuçlar gösterdi FasL ifade katil-APC kullanarak Stratejileri. Ancak, sonuçta kendi klinik uygulanabilirliğini sınırlı FasL&#39;nin Killer-APC kullanan stratejileri ile önemli kısıtlamalar vardır; APC (i) üretimi veya izolasyonu zaman, işgücü ve maliyet yoğun olan, (ii) ikinci sitopeni bağlı bağışıklık bastırma şikayetçi olan hastalar, sınırlı miktarda ve hücrelerin kalitesi sağlar (iii) bu tür çok FasL sonuçlar olarak apoptozu teşvik edici sinyallerle yapılan kaplama ya da APC&#39;nin transdüksiyon Değişken fenotipleri ve (iv) Killer APC sonuç olarak terapötik potansiyelini azaltır T hücreleri efektör fonksiyonlarını sitotoksik duyarlıdır. Bu nedenle, belirli bir tekrarlanabilir katil APC fenoksi garanti etmek zordurin vivo T hücresi tepkilerinin, antijene özel modülasyonu için kullanılabilir türü. Katil APC 3-5 ve yapay antijen sunan hücreler (aAPC) ifade FasL ile daha önceki çalışmalara dayanarak 6,7 oto-reaktif T hücrelerinin antijen-belirgin önlenmesi ya da ortadan kaldırılması için bir tane bazlı yaklaşım (KaAPC) geliştirmiştir in vitro. KaAPC bir HLA-A2-lg dimer (sinyal 1) kovalent bir 4.5 um paramanyetik lateks boncuk bir yüzeyi üzerinde hareketsiz kılınmış bir anti-Fas mAb (apoptoz uyarıcı sinyali) oluşur. Bu antijen-spesifik şekilde birden fazla özgüllüklerinin T hücre kültürlerinden bir Fas / FasL aracılı antijen-spesifik T hücrelerinin tüketilmesi ve etkinleştirme indüklenen hücre ölümü (AICD) yolunun bağımsız olarak gerçekleştirilir. Hedeflenen T hücrelerinde doza bağlı apoptoz zaten 30 dakika 8 sonra hızla uyarılır. KaAPC kolayca kontrollü bir şekilde oluşturulabilir bir raf phenot kapalı tanımlandığı sağlanmasını gerektirmektedirype hem de hücre bazlı tükenmesi stratejilerinin eksikliklerin üstesinden en. Sonuç olarak, T hücresi KaAPC spesifik tedavi stratejilerinin alanını ilerleyen T-hücresi kaynaklı otoimmün hastalıklar ve allograft reddinin tedavisi için büyük bir potansiyel gösterir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="654">
	<tbody>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:185px;">Name</td>
			<td style="width:157px;">Company</td>
			<td style="width:148px;">Cat #</td>
			<td style="width:164px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS</td>
			<td>Corning</td>
			<td>21-040-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">human AB serum</td>
			<td>Atlanta biologicals</td>
			<td>S40110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EDTA</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium azide</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>71289</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">M-450 epoxybeads</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>14011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MPC-1 magnet</td>
			<td>Invitrogen/Dynal</td>
			<td>12001D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">screw top glass vial</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>03-338AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MACSmix Tube Rotator</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-090-753</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CD95 (clone CH11)</td>
			<td>Milliore</td>
			<td>05-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HLA-A2-Ig dimer</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>551263</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cryo-tube 2ml</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430488</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgG1 PE</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>559320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-mouse IgM FITC</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>553408</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">sodium chloride</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S271-3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">calcium chloride</td>
			<td>Sigma/Aldrich</td>
			<td>C5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES&#160;</td>
			<td>cellgro/Mediatech</td>
			<td>25-060-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RPMI</td>
			<td>gibco/life technologies</td>
			<td>11875-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">96well round bottom plate</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">AnnexinV FITC</td>
			<td>PromoKine</td>
			<td>PK-CA577-1001-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">7-AAD</td>
			<td>BD/Pharmingen</td>
			<td>51-68981E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FACS tubes</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352008</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

killer artificial antigen presenting cells (kaapc) for efficient in vitro depletion of human antigen-specific t cells

T hücresi kaynaklı otoimmün hastalıkların tedavisinde yeni yaklaşımlar gibi enfeksiyonlar veya maligniteler kontrol etmek için bir azaltılmış yeteneği gibi uzun vadede yan etkiler eşlik eder, bağışıklık sisteminin bastırılması ile, stratejileri çoğunlukla dayanır. Bu nedenle, yeni yaklaşımlar sadece hastalık aracılık hücreleri hedef ve sağlam kalan bağışıklık sistemini terk etmesini geliştirilmesi gerekmektedir. Geçtiğimiz on yıl içinde hücre bazlı immunoterapi çeşitli stratejiler T hücre aracılı bağışıklık tepkileri geliştirilmiştir modüle etmek. Bu yaklaşımlardan en çok tolerans uyarıcı, antijen sunan hücreler (APC) dayanmaktadır. Bununla birlikte, teknik olarak zor ve külfetli olmanın yanı sıra, bu tür yaklaşımlar, hücre bazlı bir tedavi edici kapasitesini sınırlar ve sitotoksik T hücresi tepkilerinin, son derece duyarlıdır. Burada yeniden bırakırken, patolojik T hücrelerinin tükenmesi sağlayan hücresel olmayan killer, yapay antijen sunan hücrelerin üretimi (KaAPC) için bir protokol mevcutisti bağışıklık sistemi bakir ve fonksiyonel. KaAPC bir antijen belirli bir tarz içinde istenmeyen T hücre yanıtını düzenleyerek, otoimmün hastalıkların ve allograft reddi tedavisinde bir potansiyele sahip hücresel immünoterapiye alternatif bir çözümdür.

Bu protokolün özellikleri hücre bazlı yaklaşımlar ile karşılaştırıldığında kaplama değişmez, aynı zamanda HLA-A2-Ig (1 sinyal) ve anti-Fas mAb (apoptoz sinyali) görüntüleyen bir KaAPC fenotip tanımlanmış kuşağı ya da transdüksiyon etkinliklerinin ve kolay bir üretim (Şekil 1) modüle edilebilir. Ayrıca, KaAPC, T hücrelerinin sitotoksik efektör fonksiyonlara duyarlı değildir ve bunların işlevselliği nitro manipülasyon öncesi ve sonrası otolog antijen sunan hücreler kalitesine bağlı değildir. KaAPC olmayan ortak kökenli KaAPC T hücrelerini (Şekil 2) tüketmek olmaz yüklü iken, ortak kökenli peptid ile yüklü olduğunda in vitro ortamda antijen-spesifik T hücrelerini tüketme yeteneğine sahiptir. Bu nedenle, KaAPC antijene özel bir şekilde T hücresi apoptosis. Daha sonra, farklı T hücresi SPE karışımından antijen-spesifik T hücrelerinin seçici tükenmesi için ikinci KaAPCsadece asgari sitotoksisite komşu T hücreleri sızması olduğunu gösteren cificities, (Şekil 3). Böylece, KaAPC otoimmün hastalıklar ve allograft tedavisi için potansiyel klinik uygulanabilirliği olan insan aktive antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro antijen ile spesifik azaltımı için mükemmel bir araç temsil eder.

Watch this Scientific Journal Video about Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells at JoVE.com

Killer Artificial Antigen Presenting Cells KaAPC for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim.

Etkin Killer yapay antijen sunan hücreler (KaAPC)<em&gt; İn Vitro</em&gt; İnsan Antijen-spesifik T hücrelerinin tükenmesi

Current treatment of T cell mediated autoimmune diseases relies mostly on strategies of global immunosuppression, which, in the long term, is accompanied ...

killer-artificial-antigen-presenting-cells-kaapc-for-efficient-vitro

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Killer Artificial Antigen Presenting Cells (KaAPC) for Efficient In Vitro Depletion of Human Antigen-specific T Cells

9.6K Görüntüleme.  Johns Hopkins University.  Topluluk oluşturan hücreler katil yapay antijen üretimi için sunulmuştur, KaAPC insan antijen-spesifik T hücrelerinin in vitro tüketimi ve bir antijene T hücre aracılı bağışıklık hastalıklarının tedavisi için selüler immünoterapi için alternatif bir çözüm için etkin bir araç Kalan bağışıklık sistemini ödün vermeden özel biçim. 