This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

تم تنفيذ جميع الإجراءات التي تنطوي على الحيوانات وفقا للسياسة على الرعاية الإنسانية واستخدام الحيوانات المختبرية التي وضعها مكتب مختبر رعاية الحيوان (NIH) وفقط بموافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من جامعة مركز الصحة كونيتيكت. 1. إعداد الثقافات المختلطة الدبقية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم جميع الأدوات قبل استخدامها. إضافة 3 مل من محلول معقم الجليد الباردة هانك متوازن الملح (HBSS) التي لا تحتوي على الكاتيونات (المغنيسيوم أو الكالسيوم 2+ 2+) إلى ثلاثة العقيمة 60 ملم أطباق بتري الحفاظ على الجليد للحفاظ على برودة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل القشور من الجراء بعد الولادة الماوس P0-P2، 17،18 كما هو موضح سابقا. ملاحظة: هياكل تحت القشرية، مثل الحصين، ليست مدرجة في هذه الثقافات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة بعناية السحايا ومن ثم نقل إلى عزل القشور HBSS الطازجة وفصل الأنسجة إنزيمي، وذلك باستخدام نيالاورال عدة تشريح الأنسجة وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لوحة الخلايا في العقيمة T-175 قوارير واحتضان بين عشية وضحاها في وسائل الإعلام [Dulbecco لتعديل النسر المتوسط ​​(DMEM) مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) التي تحتوي على 1X البنسلين / الستربتومايسين]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال جميع وسائل الإعلام في اليوم التالي مع وسائل الإعلام الطازجة. الاستمرار في احتضان الثقافات، مع التغييرات الوسائط العادية، لحوالي 3 أسابيع أو حتى يتم تأسيس أحادي الطبقة الخلوية. ملاحظة: سيتم يتألف هذا أحادي الطبقة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة مع ما يقرب من 10: 1 نسبة 19. </li></ol> 2. الكروي التعريفي الخلايا الدبقية في الثقافات المختلطة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد لل coverslips المغلفة ECM. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقع coverslips دائرية مع معقم 1 N حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في طبق بتري معقمة لمدة 30 دقيقة. غسل coverslips مع 3X المياه المعقمة ومن ثم نقع في ETOH 95٪ لمدة 20 دقيقة على الأقل. ومن ثم السماح الهواء الجاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان قطرات من MATR خارج الخلية المخففالمواد التاسع (ECM) البروتين طلاء على ورقة من parafilm (على سبيل المثال 150-250 ميكرولتر / قطرة من laminin 10 ميكروغرام / مل في حل عقيم حل العازلة الفوسفات [PBS]). توزيع قطرات بحيث coverslips لن تلمس عند وضعها على هذه القطرات. ضع بلطف كل ساترة المجففة على قطرات باستخدام ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ترك لل coverslips على قطرات تقريبا. 4-6 ساعة داخل الثقافة هود مع وشاح مغلقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع لل coverslips المغلفة ECM (ECM المغلفة الجانب متابعة) في كل من الآبار من 24 لوحة جيدا. غسل كل بئر مع برنامج تلفزيوني العقيمة 3X والحفاظ على 4 درجات مئوية لحين الحاجة إليها. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الخلايا الدبقية لطلاء على coverslips. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح وسائل الإعلام من الثقافات الدبقية وغسل بلطف 3X أحادي الطبقة الدبقية مع 10 مل من برنامج تلفزيوني العقيمة. المقبل، إضافة 8-10 مل التربسين-EDTA حل لT-175، واحتضان لمدة 5-10 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما تم فصل أكثر من أحادي الطبقة، إضافة 20 مل من وسائل الإعلام كاملةإلى القارورة لوقف trypsinization. جمع وسائل الإعلام التي تحتوي على خلايا منفصلة في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور لمدة 10 دقيقة في 300 XG في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نضح طاف دون الإخلال بيليه، ومن ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام كاملة جديدة من قبل pipetting بلطف الحل باستخدام الماصة P1000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم اعادة تعليق الخلايا في المتوسط ​​كاملة في الكثافة المطلوبة (على سبيل المثال 10 5 خلية / مل). لوحة الخلايا على لل coverslips المغلفة ECM (على سبيل المثال 500 ميكرولتر في كل بئر من 24 لوحة جيدا). إضافة وسائط جديدة كاملة إضافية إلى كل بئر لمدة 3-5 أيام من الحضانة عند 37 درجة مئوية، أو حتى تنمو الخلايا لالتقاء البصري المطلوب. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلاج مع سيكوزين. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعادة تشكيل سيكوزين إلى تركيز الأسهم (108.3 ملم) في سلفوكسيد ثنائي ميثيل (DMSO). تمييع هذه الأسهم في ETOH 100٪ لجعل مخزون العمل التي يمكن للن أن يضاف إلى كل بئر من 24 لوحة جيدا لتحقيق تركيز النهائي من 10 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند إضافة سيكوزين، دوامة بلطف لوحة الثقافة لخلط سيكوزين إلى وسائل الإعلام الثقافة. تكملة سيكوزين بإضافة ما يعادل 10 ميكرومتر كل يوم لمدة أسبوع واحد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد 7 أيام من العلاج سيكوزين، وجمع وسائل الإعلام والماصة 500 ميكرولتر من البرد بارافورمالدهيد 4٪ (PFA) في كل بئر. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة لإصلاح الخلايا. ثم، وغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني ومن ثم الحفاظ وحات في 4 درجات مئوية حتى المجهزة للمناعية (انظر أدناه). ملاحظة: خلية الإعلام الثقافة يمكن جمع لالأنزيمية أو فحص ELISA في هذه المرحلة اذا شئت. </li></ol> 3. كيمياء سيتولوجية مناعية (ICC) لتصور خلايا الكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استبدال برنامج تلفزيوني مع عرقلة العازلة [PBS + 0.3٪ توين 20 + 5٪ مصل الماعز العادي (خ ع)]، واحتضان الخلايا لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فيcubate الخلايا الثابتة في أمصال مضادة ضد الأساسي إيبا-1 [(1: 1،000) المخفف في برنامج تلفزيوني + 0.3٪ توين 20 + 2٪ NGS] لا يقل عن 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ثم يغسل جيدا مع كل برنامج تلفزيوني 3X 5 دقيقة / يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة مضان مترافق الضد الثانوية المناسب للتعرف على العلامات الأولية للأجسام المضادة ومكافحة وصمة عار مع 4 &#39;، 6 diamidino-2-phenylindole (دابي، 1: 1،000) لتحديد نوى. احتضان في حل الضد الثانوية لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مع PBS 3X 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كل جبل ساترة لشرائح المجهر باستخدام المتوسطة المتزايدة. عرض الشرائح على المجهر الفلورسنت للتحليلات البصرية والكمية. </li></ol> 4. تحليل وتوصيف الخلايا الكروي في الثقافة الأولية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام ثلاثة معايير المورفولوجية التالية لتحديد خلية الكروي في الثقافة: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا الكروي باستخدام المجهر الفلورسنت من وضع العلامات immunopositive للعلامة دبقية صغيرة، إيبا-1 +. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديدخلايا الكروي ومتعدد النوى (أي التي تحتوي على اثنين أو أكثر من نوى دابي إيجابية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الخلايا الكروي من قبل مورفولوجيا مستدير متميزة من مظهر تشعبت للغاية من خلايا يستريح دبيقي. ملاحظة: يمكن أيضا أن تجمع الخلايا لتحليل علامة سطح الخلية وتقدير التدفق الخلوي من هذه الثقافات. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس تفعيل البلعمة من الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتقييم نشاط البلعمة من المعالجة سيكوزين الخلايا الدبقية الصغيرة، إضافة حبات اللاتكس FITC المسمى إلى الآبار وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. إضافة حبات اللاتكس الفلورسنت مترافق 48 ساعة قبل تثبيت مع PFA. إصلاح الخلايا تعامل مع الخرز (كما هو مذكور في القسم 2.4)، وعملية مناعية (كما هو موضح في القسم 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد الأجسام المضادة الثانوية مترافق fluorophore بحيث لا تتداخل أطياف الانبعاث فلوري من fluorophore المسمى الخرز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يحلله لمحات من بلعمية إيبا-1 + الخلايا الدبقية الصغيرة من خلال تحديد تلك الخلايا التي تشارك في توطين مع حبات fluorescently المسمى. ملاحظة: سوف سيكوزين تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وسيتم تحديد الخرز المبتلعة داخل mononucleated ومتعددة النوى إيبا-1 + الخلايا في هذا الإعداد الثقافة. </li></ol></li></ol> 5. تحريض الخلايا الكروي من الثقافات تنقية دبقية ملاحظة: نهج بديل فك الإشارات بين الخلايا بين نجمية والخلايا الدبقية الصغيرة هي ميزة أخرى لهذا في المختبر نموذج كروي الشكل الخلية. ويمكن تحقيق تنقية خلايا دبقية الأولية للreplating أو زملاء زراعة بانخفاض الملكية تمسكهم في الثقافة، كما هو موضح في الخطوات التالية (انظر القسم 5.2). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع وسائل الإعلام من ثقافات مختلطة الدبقية متكدسة في أنبوب مخروطي 50 مل والحفاظ عليه عند 37 درجة مئوية في الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل دبقية صغيرة من الثقافات المختلطة الدبقية الأولية.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إزالة وسائل الإعلام من متكدسة مختلطة الثقافة الدبقية T175 قارورة، إضافة وسائط اهتزاز الدافئة [تتألف من وسائل الإعلام كاملة + 25 ملي 4- (2 هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic (HEPES) + 25 ملي بيكربونات الصوديوم (سيغما)]. يهز قوارير لمدة 3-4 ساعة في شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة (37 ° C). جمع وسائل الإعلام من هذه قوارير اهتزت في 50 مل أنابيب مخروطية. ملاحظة: وسوف تشمل هذه الوسائط على الخلايا الدبقية الصغيرة ملتصقة أقل من قوارير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تدور في وسائل الإعلام في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. نضح طاف ثم اعادة تعليق الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام مكيفة نجمية (تم جمعها في الخطوة 5.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد عدد الخلايا المكتسبة باستخدام عدادة الكريات ثم لوحة الخلايا دبقية صغيرة على coverslips المغلفة الركيزة (انظر القسم 2.1) للمناعية، أو لوحة على لوحات فائقة الانخفاض تمسك جيدا لجمع الخلايا في المستقبل الكروي للثقافة مشتركة مع أنواع الخلايا الأخرى، مثل الخلايا قليلة التغصن (كما تنازلياribed في القسم التالي). ملاحظة: مطلي مرة واحدة يمكن التعامل مع الخلايا الدبقية الصغيرة مع سيكوزين (10 ميكرومتر) كما هو موضح أعلاه (انظر القسم 2.3). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شارك في الثقافة مع الخلايا قليلة التغصن الابتدائية للتحليل السمسة. ملاحظة: مجموعة من الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين من لوحات التقيد منخفضة لاحقة شارك في ثقافة على الثقافات الأولية من الخلايا قليلة التغصن، أو خلايا دبقية قليلة التغصن السلف، ويمكن استخدامها لدراسة وظيفة السامة المحتملة لمثل هذه الخلايا في المختبر كروي الشكل. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطوير ثقافات قليلة التغصن الأولية باستخدام أساليب أنشئت 18،20. لجمع الخلايا الدبقية الصغيرة المعالجة سيكوزين، الماصة بلطف لفصل الخلايا الملتصقة فضفاضة من أسفل الآبار. جمع الخلايا، وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة، وresuspend ثم بعناية في وسائل الإعلام دبقية قليلة التغصن التمايز [مكونة من Neurobasal وسائل الإعلام، L-الجلوتامين (1X)، B-27 ملحق (1X)، و triiodothyronine (T3، 10 نانوغرام / مل )]. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات ثم بذر الخلايا الدبقية الصغيرة على ثقافة دبقية قليلة التغصن في 1 × 10 5 خلية / مل، مما أدى إلى تقارب 1: 2 الخلايا الدبقية الصغيرة / نسبة دبقية قليلة التغصن. احتضان باعتباره الثقافة المشتركة لمدة تصل إلى 3 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح خلايا مناعية ل(انظر القسم 2.4). جمع وسائل الإعلام ثقافة الخلية لELISA أو التحاليل الكيميائية حسب الحاجة. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. K., Jalal, K., Carter, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Hunter's+Hope+Krabbe+family+database.">The Hunter's Hope Krabbe family database.</a> Pediatr Neurol. 40, 13-18 (2009).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Newborn+screening+for+Krabbe+disease:+the+New+York+State+model.">Newborn screening for Krabbe disease: the New York State model.</a> Pediatr Neurol. 40, 245-252 (2009).</li><li>Krabbe, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+familial,+infantile+form+of+brain+sclerosis.">A new familial, infantile form of brain sclerosis.</a> Brain. 39, 74-114 (1916).</li><li>Percy, A. K., Odrezin, G. T., Knowles, P. D., Rouah, E., Armstrong, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Globoid+cell+leukodystrophy:+comparison+of+neuropathology+with+magnetic+resonance+imaging.">Globoid cell leukodystrophy: comparison of neuropathology with magnetic resonance imaging.</a> Acta Neuropathol. 88, 26-32 (1994).</li><li>Itoh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistological+study+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Immunohistological study of globoid cell leukodystrophy.</a> Brain Dev. 24, 284-290 (2002).</li><li>Reddy, A. S., Patel, J. R., Vogler, C., Klein, R. S., Sands, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+pathology+progresses+independently+of+KC+and+CXCR2+in+globoid-cell+leukodystrophy.">Central nervous system pathology progresses independently of KC and CXCR2 in globoid-cell leukodystrophy.</a> PLoS One. 8, (2013).</li><li>McNally, A. K., Anderson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+fusion+and+multinucleated+giant+cells+of+inflammation.">Macrophage fusion and multinucleated giant cells of inflammation.</a> Adv Exp Med Biol. 713, 97-111 (2011).</li><li>Kaneko, Y., Kitamoto, T., Tateishi, J., Yamaguchi, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ferritin+immunohistochemistry+as+a+marker+for+microglia.">Ferritin immunohistochemistry as a marker for microglia.</a> Acta Neuropathol. 79, 129-136 (1989).</li><li>Graeber, M. B., Streit, W. J., Kreutzberg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+microglial+cytoskeleton:+vimentin+is+localized+within+activated+cells+in+situ.">The microglial cytoskeleton: vimentin is localized within activated cells in situ.</a> J Neurocytol. 17, 573-580 (1988).</li><li>Kondo, Y., Adams, J. M., Vanier, M. T., Duncan, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophages+counteract+demyelination+in+a+mouse+model+of+globoid+cell+leukodystrophy.">Macrophages counteract demyelination in a mouse model of globoid cell leukodystrophy.</a> J Neurosci. 31, 3610-3624 (2011).</li><li>Pollanen, M. S., Brody, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+globoid+cell+leukodystrophy.">Fetal globoid cell leukodystrophy.</a> Arch Pathol Lab Med. 114, 213-216 (1990).</li><li>Martin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fetal+Krabbe+leukodystrophy.+A+morphologic+study+of+two+cases.">Fetal Krabbe leukodystrophy. A morphologic study of two cases.</a> Acta Neuropathol. 53, 87-91 (1981).</li><li>Ijichi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MMP-3+mediates+psychosine-induced+globoid+cell+formation:+Implications+for+leukodystrophy+pathology.">MMP-3 mediates psychosine-induced globoid cell formation: Implications for leukodystrophy pathology.</a> Glia. , (2013).</li><li>Pellegatta, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+potential+of+neural+stem/progenitor+cells+in+murine+globoid+cell+leukodystrophy+is+conditioned+by+macrophage/microglia+activation.">The therapeutic potential of neural stem/progenitor cells in murine globoid cell leukodystrophy is conditioned by macrophage/microglia activation.</a> Neurobiol Dis. 21, 314-323 (2006).</li><li>Crocker, S. J., Milner, R., Pham-Mitchell, N., Campbell, I. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+and+agonist-specific+regulation+of+genes+for+matrix+metalloproteinases+and+their+tissue+inhibitors+by+primary+glial+cells.">Cell and agonist-specific regulation of genes for matrix metalloproteinases and their tissue inhibitors by primary glial cells.</a> Journal of Neurochemistry. 98, 812-823 (2006).</li><li>Schildge, S., Bohrer, C., Beck, K., Schachtrup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+mouse+cortical+astrocytes.">Isolation and culture of mouse cortical astrocytes.</a> J Vis Exp. , (2013).</li><li>Crocker, S. J., Frausto, R. F., Whitton, J. L., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+to+establish+microglia-free+astrocyte+cultures:+comparison+of+matrix+metalloproteinase+expression+profiles+in+pure+cultures+of+astrocytes+and+microglia.">A novel method to establish microglia-free astrocyte cultures: comparison of matrix metalloproteinase expression profiles in pure cultures of astrocytes and microglia.</a> Glia. 56, 1187-1198 (2008).</li><li>Moore, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytic+Tissue+Inhibitor+of+Metalloproteinase-1+(TIMP-1)+Promotes+Oligodendrocyte+Differentiation+and+Enhances+CNS+Myelination.">Astrocytic Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1 (TIMP-1) Promotes Oligodendrocyte Differentiation and Enhances CNS Myelination.</a> J Neurosci. 31, 6247-6254 (2011).</li><li>Im, D. S., Heise, C. E., Nguyen, T., O'Dowd, B. F., Lynch, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+molecular+target+of+psychosine+and+its+role+in+globoid+cell+formation.">Identification of a molecular target of psychosine and its role in globoid cell formation.</a> J Cell Biol. 153, 429-434 (2001).</li></ol>

The authors declare no conflicts of interest.

بروتوكول الموصوفة هنا يوفر النظام نموذج جديد للدراسة تطوير وتوصيف وظيفي لتنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا الكروي. العمل مسبق من ايم وآخرون. باستخدام خط الخلية HEK293 قدمت نموذجا لتطوير هذا البروتوكول لدراسة تشكيل خلية الكروي 21. ومن المهم أيضا أن نشير ?...

حثل المادة البيضاء الكروي الخلية (GLD)، المعروف أيضا باسم مرض كرابه، هو مرض قاتل المزيل الناتجة عن فقدان وظيفة الطفرات في galatocerebrosidase (galc) الجين 1. الشكل الأكثر شيوعا من GLD هو البديل الطفولي الذي تمثله في بداية مرحلة الطفولة المبكرة وتتميز نمطا سريريا من السيارات والتدهور المعرفي يؤدي إلى الوفاة المبكرة غالبا قبل سن الخامسة 2،3. وتستخدم الاختبارات الجينية للتحقق من تشخيص GLD 4. أمراض الأعصاب من GLD يكشف إزالة الميالين على نطاق واسع، وضمور الخلايا العصبية، دباق النجمي وجود محتقن الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية تسمى خلايا كروي الشكل 5-7. تحديد خلايا كروي الشكل، وغالبا ما تحتوي على شوائب نبيبي في السيتوبلازم بها، لقد كان السمة المميزة لشعبة الشؤون القانونية العامة على مدى السنوات 97 الماضية، على الرغم من أن ظلت وظيفة معينة من هذه الخلايا واضحة بعيد المنال. مشاركة غير myel-منذ فترة طويلة تعتبر inating الدبقية (الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية) في التسبب في GLD استجابة الثانوية إلى إزالة الميالين عميق في هذا المرض 8. ومن المثير للاهتمام، وأول وصف لهذا المرض، الذي أدلى به كنود كرابه 5 في عام 1916، وتشكيل ذكرت من البالعات متعددة النوى التي تحتوي على الدهون الحطام التي تم اسمه &#39;الكروي الخلايا وهي السمة المميزة لهذا المرض. خلايا الكروي هي سمة مميزة لGLD علم الأمراض، على الرغم منذ فترة طويلة تجاهل دورها في GLD. ومن المثير للاهتمام، وهذه الخلايا هي من بين أولى التغييرات المميزة في أنسجة الجهاز العصبي المركزي GLD. هذا النقص في المعرفة قد يكون بسبب افتراض أن تشكيل البالعات متعددة النوى، تسمى الخلايا العملاقة في أمراض أخرى، تعتبر عادة نتيجة للأمراض المسببة للأمراض بدلا من القوة الدافعة الأولية 9. ولذلك، كانت هناك دراسات قليلة للتحقق من الآلية التي كتبها مبادرة الخوذ البيضاءتتشكل خلايا الكروي CH من البالعات، وخاصة في الجهاز العصبي المركزي من GLD. الإجراء الموضح في هذا التقرير يركز على أهمية تشكيل الكروي الخلايا في الجهاز العصبي المركزي ومظاهرة لدينا السابقة التي يسببها سيكوزين الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، وعرضت هذه الخلايا مستويات أعلى من النشاط البلعمة. واتساقا مع هذه الملاحظات، والخلايا في أدمغة الكروي twitcher كثيرا ما تحتوي-PAS إيجابي الحطام، مما يشير إلى ارتفاع مستويات نشاط البلعمة. تم العثور على خلايا كروي الشكل أيضا أن يكون immunopositive لالفيريتين (علامة الخلايا الدبقية الصغيرة) 10، KP-1 / CD68 (علامة الوحيدات)، وبعضها أيضا إيجابية لvimentin (بروتين خيوط وسيطة وعلامة من الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة تفعيلها) 11، HLA-DRA (وهي مستقبلات سطح MHCII)، و TNF-α 7، وإيبا-1 (بروتين ملزمة الكالسيوم المستخدمة لتحديد الخلايا الدبقية الصغيرة) 12. وبناء على هذه المجموعة من علامات، وخلايا الكروي تنشأ من الخلايا الدبقية الصغيرة التي تنميالنمط الظاهري فريدة من نوعها. على الرغم من طابعها الفريد، تم التغاضي عن وظيفة محددة ومساهمة GCS إلى GLD المرضية إلى حد كبير. كان يظن خلايا الكروي لتكون نتيجة ثانوية للإزالة الميالين المزمن. ومع ذلك، فقد حددت دراسات سابقة دراسة جمعية الزمنية للخلايا الكروي لعلم الأمراض المسألة الأبيض من GLD وجود خلايا الكروي في أواخر الجنينية لفترة ما بعد الولادة في وقت مبكر؛ الأوقات التي سبقت موت الخلايا المبرمج دبقية قليلة التغصن وإزالة الميالين العلني 13. وهكذا، فإن التسلسل الزمني لتطور أمراض الأعصاب في GLD تشير إلى أن الخلايا الكروي تتشكل في وقت مبكر من إزالة الميالين في هذا المرض 14. وأدى ذلك إلى فرضيتنا أن تشكيل المبكر للخلايا الكروي في GLD قد تمثل حدثا الممرضة تحديد بدلا من الثانوية، والاستجابة التفاعلية للتلف دبقية قليلة التغصن 15. بالإضافة إلى ذلك، فقد اعتبر ديسريغولاتيون النشاط دبقية في GLD والواقعص تحد من فعالية على المدى الطويل hematopeotic العلاج بالخلايا الجذعية لعلاج هذا المرض 16. وهكذا، والتحقيق في الوظائف الخلوية وتنظيم الخلايا الدبقية الصغيرة، وخلايا الكروي، ردا على سيكوزين من المتوقع أن توفر رؤى جديدة في التسبب في GLD. حتى وقت قريب، كان عدم وجود نموذج مناسب للدراسة تشكيل خلية الكروي محدودة فهم وظيفة محددة ومساهمة هذه الخلايا للأمراض من GLD. في الدراسات الحديثة، تقرر أن الخلايا الكروي مثل يمكن تشكيلها في استجابة مباشرة لسيكوزين، وهو توكسين الدهون التي تتراكم العدوى في GLD. وجدنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة، ولكن ليس الضامة، يتم تنشيط وتحويلها إلى خلايا الكروي في الثقافات الدبقية الأولية ردا على سيكوزين 15. تم العثور على هذا التحول إلى خلايا الكروي أن بوساطة البروتيني خارج الخلية، الفلزي مصفوفة (MMP) -3 15. وفي الآونة الأخيرة، فإنناقمنا بمد هذه النتائج وقرر أن الخلايا الدبقية الصغيرة وتنشيط خلايا الكروي سيكوزين المتقدمة في هذا المختبر في نظام نموذجي هي أكثر قدرة سامة للخلايا والخلايا قليلة التغصن دبقية قليلة التغصن السلف. وبالتالي، عندما اعتبر في سياق GLD، وتراكم في وقت مبكر من سيكوزين وتشكيل خلايا الكروي قبل إزالة الميالين ستدعم دورا الابتدائي وربما العدوى الناشئة عن الخلايا الدبقية الصغيرة في هذا المرض. نقترح دراسة تشكيل خلية الكروي سوف تكشف معلومات جديدة عن التسبب في GLD من شأنها أن تسهم في فهمنا لهذا المرض. وعلاوة على ذلك، هذا النموذج الخلوي الجديد من GLD قد توفر شكلا جديدا من النهج الذي علاجية جديدة لمعالجة يمكن اختبارها تغيرات مرضية في هذا المرض. وبالتالي، في هذا التقرير نقدم بروتوكول مفصلة لتطوير في المختبر من خلايا كروي الشكل الناجم عن سيكوزين من الثقافات الأولية من غير myelinating الدبقية.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

وظيفة محددة من الخلايا الدبقية الصغيرة متعددة الأنوية، تسمى خلايا الكروي، التي هي وفيرة فريد في النظام العصبي المركزي من حثل المادة البيضاء الكروي الخلايا (GLD) غير واضحة. وقد أعاقت هذه الفجوة في المعرفة من خلال عدم وجود الاقتضاء في النموذج المختبر للدراسة. هنا، نحن تصف الفئران نظام الثقافة الدبقية الأساسي في العلاج مع النتائج التي سيكوزين في الانوية من الخلايا الدبقية الصغيرة تشبه الخلايا كروي الشكل المميزة وجدت في شعبة الشؤون القانونية العامة. باستخدام هذا النظام المبتكر، حددنا شروط وطرق التحليل للدراسة الخلايا الكروي. تم التحقق من صحة الاستخدام المحتمل لهذا النظام نموذجا في دراستنا السابقة، والتي حددت دور محتمل للمصفوفة الفلزي (MMP) -3 في شعبة الشؤون القانونية العامة. هذه الرواية في نظام المختبر قد تكون نموذجا مفيدا للدراسة تشكيل وظيفة، ولكن أيضا التلاعب العلاجية المحتملة، من هذه الخلايا الفريدة من نوعها.

هذا البروتوكول، كما هو مكتوب، ومن المتوقع أن تستغرق نحو 36 يوما لاستكمال من البداية الى النهاية (انظر الشكل 1: مخطط سير العمل التجريبية). فقد كان من تجربتنا أن تطوير الخلايا مثل كروي الشكل &#39;في هذا النظام الأساسي الثقافة على حد سواء موثوقة وقابلة للتكرار: لوحظ...

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy at JoVE.com

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

و<em&gt; في المختبر</em&gt; نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية الخلوي في الخلية حثل المادة البيضاء الكروي

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

Video: An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

وسحق العصب البصري النموذجي إصابة الفئران لدراسة الخلايا الشبكية بقاء العقدة

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

جيل من الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ الفئران مخلد الخط الخلية البطانية باعتبارها<em&gt; في المختبر</em&gt; حاجز الدم في الدماغ الموديل

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

التلاعب الجيني للمخيخي الحبيبة الخلايا العصبية<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em&gt; لدراسة مورفولوجيا الخلايا العصبية والهجرة

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

النظام الشمي كنموذج لدراسة أنماط نمو محور عصبي ومورفولوجيا<em&gt; في فيفو</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

الظهرية جذر العقد الخلايا العصبية والخلايا الجذعية المتباينة الدهنية المشتقة: ل<em&gt; في المختبر</em&gt; المشارك الثقافة نموذج لدراسة الأعصاب الطرفية التجديد

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

في المختبر نمذجة السرطانية العصبية الغزو: وظهري الجذر العقدة نموذج

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

وغير المباشرة العصبية نجمية Coculture الفحص: هناك<em&gt; في المختبر</em&gt; مجموعة المتابعة للتحقيق مفصل من التفاعلات العصبية، الدبقية

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

في الرحم النهج Electroporation لللدراسة استثارة الخلايا العصبية القطعان والربط وحيدة الخلية

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

زيادة تعتمد على الوقت في استجابة الشبكة لتحفيز الثقافات خلية الخلايا العصبية على صفائف الدقيقة الكهربائي

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

In vivo Imaging of Fully Active Brain Tissue in Awake Zebrafish Larvae and Juveniles by Skull and Skin Removal

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at cellular and subcellular resolution. Advances in molecular and imaging technologies have allowed us to gain numerous detailed insights into cellular and molecular mechanisms of brain development in the transparent zebrafish embryo. Recently, processes of refinement of neuronal connectivity that occur at later larval stages several weeks after fertilization, which are for example control of social behavior, decision making or motivation-driven behavior, have moved into focus of research. At these stages, pigmentation of the zebrafish skin interferes with light penetration into brain tissue, and solutions for embryonic stages, e.g., pharmacological inhibition of pigmentation, are not feasible anymore.
Therefore, a minimally invasive surgical solution for microscopy access to the brain of awake zebrafish is provided that is derived from electrophysiological&#160;approaches. In teleosts, skin and soft skull cartilage can be carefully removed by micro-peeling these layers, exposing underlying neurons and axonal tracts without damage. This allows for recording neuronal morphology, including synaptic structures and their molecular contents, and the observation of physiological changes such as Ca2+ transients or intracellular transport events. In addition, interrogation of these processes by means of pharmacological inhibition or optogenetic manipulation is feasible. This brain exposure approach provides information about structural and physiological changes in neurons as well as the correlation and interdependence of these events in live brain tissue in the range of minutes or hours. The technique is suitable for in vivo brain imaging of zebrafish larvae up to 30 days post fertilization, the latest developmental stage tested so far. It, thus, provides access to such important questions as synaptic refinement and scaling, axonal and dendritic transport, synaptic targeting of cytoskeletal cargo or local activity-dependent expression. Therefore, a broad use for this mounting and imaging approach can be anticipated.

Here we present a method to image the zebrafish embryonic brain in vivo upto larval and juvenile stages. This microinvasive procedure, adapted from electrophysiological approaches, provides access to cellular and subcellular details of mature neuron and can be combined with optogenetics and neuropharmacological studies for characterizing brain function and drug intervention.

في التصوير الحي لأنسجة الدماغ النشطة بالكامل في يرقات حمار وحشي مستيقظا والأحداث عن طريق إزالة الجمجمة والجلد

Understanding the ephemeral changes that occur during brain development and maturation requires detailed high-resolution imaging in space and time at ...