This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con la Política de Cuidado Humano y Uso de Animales de Laboratorio establecidos por la Oficina de Laboratorio Animal Welfare (NIH) y sólo con la aprobación del Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional (IACUC) de la Universidad de Connecticut Health Center. 1 Preparación de mezcla de culturas gliales <ol><li> Esterilice todos los instrumentos antes de su uso. Añadir 3 ml de solución enfriada con hielo estéril salina equilibrada de Hank (HBSS) que no contiene cationes (Mg2 + o Ca2 +) a tres estériles 60 mm placas de Petri mantenidas en hielo para mantener frío. </li><li> Aislar las cortezas de postnatales crías de ratón P0-P2, como se describió previamente 17,18. NOTA: las estructuras subcorticales, como el hipocampo, no están incluidos en estas culturas. </li><li> Retire con cuidado las meninges y luego transferir las cortezas aisladas al fresco HBSS y disociar los tejidos enzimáticamente, usando un nekit de disección de tejido ural de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Placa de las células en frascos estériles T-175 e incubar durante la noche en medios de comunicación [medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con suero bovino fetal al 10% (FBS) que contiene 1x penicilina / estreptomicina]. </li><li> Vuelva a colocar todos los medios de comunicación al día siguiente con medio fresco. Continuar incubar culturas, con cambios regulares de los medios de comunicación, por aproximadamente 3 semanas o hasta que se establezca una monocapa celular. NOTA: Esta monocapa estará compuesto por astrocitos y microglia con un aproximadamente 10: 1 19. </li></ol> 2. globoides inducción celular en cultivos mixtos gliales <ol><li> Preparar los cubreobjetos ECM-revestido. <ol><li> Remojar cubreobjetos circulares con 1 N de ácido estéril clorhídrico (HCl) en una placa de Petri estéril durante 30 min. Lavar 3x cubreobjetos con agua estéril y luego sumergirse en EtOH al 95% durante al menos 20 min. y luego dejar que se seque al aire. </li><li> Coloque las gotas de matr extracelular diluidomateriales ix (ECM) de recubrimiento proteína en una hoja de Parafilm (por ejemplo, 150-250 l / gotita de laminina 10 mg / ml disuelto en solución tampón de fosfato estéril [PBS]). Distribuir las gotas para que cubreobjetos no tocar cuando se coloca en estas gotitas. Coloque con cuidado cada cubreobjetos secos sobre una gotita con fórceps. </li><li> Deja los cubreobjetos sobre las gotas para aprox. 4-6 horas dentro de la campana de cultivo con la hoja cerrada. </li><li> Coloque el cubreobjetos recubiertos (ECM ECM laterales recubiertos de arriba) en cada uno de los pocillos de una placa de 24 pocillos. Lavar cada pocillo con PBS estéril 3x y mantener a 4 ° C hasta que se necesite. </li></ol></li><li> Preparación de células gliales para Plating en cubreobjetos. <ol><li> Aspirar los medios de comunicación de las culturas gliales y lavar suavemente los 3x monocapa gliales con 10 ml de PBS estéril. A continuación, agregue ml de solución de tripsina-EDTA 8-10 a la T-175, y se incuba durante 5-10 minutos a 37 ° C. </li><li> Cuando la mayoría de la monocapa se ha separado, añadir 20 ml de medio completoal matraz para detener la tripsinización. Recoger los medios que contienen las células separadas en un tubo cónico de 50 ml y centrifugar durante 10 min a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aspirar el sobrenadante sin perturbar el sedimento, y luego volver a suspender las células en 2 ml de medio completo fresco pipeteando suavemente la solución con una pipeta P1000. </li><li> Determinar el número de células usando un hemocitómetro y luego volver a suspender las células en medio completo a la densidad deseada (por ejemplo, 10 5 células / ml). Placa de las células sobre los cubreobjetos recubiertos con ECM (por ejemplo, 500 l en cada pocillo de la placa de 24 pocillos). Añadir medio completo fresco adicional a cada pocillo durante 3-5 días de incubación a 37 ° C, o hasta que las células crecen hasta la confluencia visual deseado. </li></ol></li><li> El tratamiento con psicosina. <ol><li> Reconstituir el psicosina a una concentración de reserva (108,3 mM) en dimetilsulfóxido (DMSO). Diluir esta población en EtOH al 100% para hacer una reserva de trabajo que puede eln ser añadido en cada pocillo de placa de 24 pocillos para conseguir una concentración final de 10 mM. </li><li> En el momento de añadir el psicosina, agitar suavemente la placa de cultivo para mezclar el psicosina en medios de cultivo. Complementar la psicosina añadiendo el equivalente de 10 mM cada dos días durante una semana. </li></ol></li><li> Después de 7 días de tratamiento psicosina, recoger los medios de comunicación y de pipeta 500 l de frío 4% de paraformaldehído (PFA) en cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente durante 20 min para fijar las células. A continuación, lavar cada pocillo 3 veces con PBS y luego mantener las placas a 4 ° C hasta su procesamiento para inmunocitoquímica (ver más abajo). NOTA: medios de cultivo celular puede ser recogido para enzimático o ensayo ELISA en este punto, si se desea. </li></ol> 3. inmunocitoquímica (CPI) para visualizar las células globosas <ol><li> Reemplazar PBS con tampón de bloqueo [PBS + 0,3% Tween-20 + 5% de suero normal de cabra (NGS)], e incubar las células durante 1 hora a temperatura ambiente. </li><li> EnCubate las células fijadas en antisueros primaria contra Iba-1 [(1: 1000) diluido en PBS + 0,3% Tween-20 + 2% NGS] durante al menos 1 hora a temperatura ambiente, luego lavar cada pocillo con PBS 3x 5 min / lavar. </li><li> Añadir el anticuerpo secundario conjugado de fluorescencia correspondiente para identificar el anticuerpo etiquetado y la contra-tinción primaria con 4 &#39;, 6-diamino-2-fenilindol (DAPI, 1: 1000) para identificar los núcleos. Incubar en solución de anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente y lavar con PBS 3x 5 min. </li><li> Montar cada cubreobjetos a portaobjetos de microscopio utilizando un medio de montaje. Ver diapositivas en un microscopio de fluorescencia para los análisis visuales y cuantitativos. </li></ol> 4. Análisis y caracterización de las células en cultivo primario globoid <ol><li> Utilice los siguientes tres criterios morfológicos para identificar una célula globosas en la cultura: <ol><li> Identificar células globoides utilizando microscopía de fluorescencia, mediante el etiquetado immunopositive para el marcador microglial, Iba-1 +. </li><li> Identificarcélulas globoides como polinucleadas (es decir, que contienen dos o más núcleos positivos DAPI). </li><li> Identificar células globoides por una morfología redondeada distinta de la apariencia altamente ramificado de descansar células microgliales. NOTA: Las células también pueden ser recogidas para análisis de marcadores de la superficie celular y cuantificación por citometría de flujo de estos cultivos. </li></ol></li><li> La medición de la activación de la microglía fagocítica y células globoides <ol><li> Para evaluar la actividad fagocítica de microglia psicosina tratados, añadir perlas de látex marcadas con FITC a los pocillos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Añadir perlas de látex fluorescentes conjugados 48 horas antes de la fijación con PFA. Fijar las células tratadas con los granos (como se mencionó en la sección 2.4), y el proceso para inmunocitoquímica (como se describe en la sección 3). </li><li> Seleccionar anticuerpos secundarios fluoróforo conjugado de modo que no se superponen los espectros de emisión de fluorescencia de las perlas de fluoróforo marcado. </li><li> Analyze los perfiles phagocytotic de Iba-1 + microglia mediante la identificación de las células que co-localizar con las cuentas marcadas con fluorescencia. NOTA: psicosina se activará microglia. Perlas fagocitados serán identificados dentro de Iba-1 + células mononucleadas y multinucleadas en esta configuración cultura. </li></ol></li></ol> 5. inducción de células globosas de cultivos purificados microgliales NOTA: Un enfoque alternativo para descifrar la señalización intercelular entre el astrocitos y microglia es otra ventaja de este modelo de células in vitro globoid en. La purificación de las células microgliales primarias para replating o co-cultivo se puede lograr mediante su propiedad menor adhesión en la cultura, tal como se describe en los siguientes pasos (ver Sección 5.2). <ol><li> Reunir los medios de comunicación de los confluentes mezcla de culturas gliales en 50 ml tubo cónico y mantenerla a 37 ° C en la incubadora. </li><li> Aislamiento Microglial de mezcla de culturas gliales primarios.<ol><li> Después de extraer el soporte de un frasco mixta confluente T175 cultura glial, añadir medios temblorosas cálidos [consistentes en medio completo + 25 mM de 4 (2-hidroxietil) -1-piperazinetanosulfónico (HEPES) + 25 mM de bicarbonato de sodio (Sigma)]. Agitar los frascos de 3-4 horas en un agitador orbital a 100 rpm (37 ° C). Recoge los medios de estos matraces sacudidos en 50 ml tubos cónicos. NOTA: Este material debe incluir la microglia menos adherente de los frascos. </li><li> Haga girar los medios de comunicación a 300 xg durante 10 min a temperatura ambiente. Aspirar el sobrenadante y volver a suspender las células en 2 ml de los medios de comunicación de los astrocitos acondicionado (recogido en el paso 5.1). </li><li> Establecer el número de células adquirida usando un hemocitómetro y luego la placa de las células microgliales en cubreobjetos sustrato recubierto (ver sección 2.1) para inmunocitoquímica, o placa sobre placas de pocillos adherencia ultrabajo para la futura colección de células globoides para co-cultivo con otros tipos de células, tales como oligodendrocitos (como descRibed en la siguiente sección). NOTA: Una vez adherido la microglia se puede tratar con psicosina (10 M) como se describe anteriormente (ver sección 2.3). </li></ol></li><li> Co-cultivo con oligodendrocitos primarios para el análisis de citotoxicidad. NOTA: Colección de psicosina tratados con microglia de las placas de adherencia bajas para co-cultivo posterior en cultivos primarios de oligodendrocitos o células progenitoras de oligodendrocitos, se puede utilizar para examinar el potencial función citotóxica de estas células globosas-como in vitro. <ol><li> Desarrollar cultivos de oligodendrocitos primarios utilizando métodos establecidos 18,20. Para recoger la microglia psicosina tratados, pipetear suavemente para desprender las células poco adherentes desde el fondo de los pocillos. Recoger las células, centrifugar a 300 xg durante 10 min, y luego resuspender cuidadosamente en medio de diferenciación de oligodendrocitos [compuesto por los medios de comunicación Neurobasal, L-glutamina (1x), B-27 suplemento (1x), y triyodotironina (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Contar el número de células utilizando un hemocitómetro y luego sembrar las microglia en el cultivo de oligodendrocitos a 1 x 10 5 células / ml, resultando en un aproximado 1: 2 relación microglia / oligodendrocitos. Incubar como un co-cultivo por hasta 3 días. </li><li> Fijar las células para inmunocitoquímica (ver sección 2.4). Reunir los medios de cultivo celular para ELISA o análisis químicos según sea necesario. </li></ol></li></ol>

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The authors declare no conflicts of interest.

El protocolo descrito en el presente documento proporciona un nuevo sistema modelo para estudiar el desarrollo y la caracterización funcional de microglia activadas y células globoides. Antes de trabajo por Im et al. utilizando una línea celular HEK293 proporciona un modelo para el desarrollo del presente protocolo para el estudio de la formación de células globosas 21. También es importante señalar que las células globoides derivados en el modelo se diferencian de las células globoides nati...

Leucodistrofia de células globoides (GLD), también conocida como enfermedad de Krabbe, es una enfermedad desmielinizante fatal resultante de la pérdida de mutaciones de función en el galatocerebrosidase (GALC) gen 1. La forma más frecuente de GLD es la variante infantil, que se caracteriza por un inicio en la primera infancia y se caracteriza por un curso clínico agresivo del motor y el deterioro cognitivo que conduce a la muerte prematura a menudo antes de los cinco años de edad 2,3. Las pruebas genéticas se utiliza para verificar el diagnóstico de GLD 4. Neuropatología de GLD revela desmielinización generalizada, atrofia neuronal, astrogliosis y presencia de microglia multi-nucleadas llena de sangre llamadas células globoides 5-7. La identificación de células globoides, que a menudo contienen inclusiones tubulous en su citoplasma, ha sido una característica definitoria de GLD durante los últimos 97 años, aunque la función específica de estas células conspicuos ha permanecido esquivo. La participación de los no-Myelginarios gliales (astrocitos y microglia) en la patogénesis de GLD ha sido considerado una respuesta secundaria a la profunda desmielinización en esta enfermedad 8. Curiosamente, la primera descripción de esta enfermedad, hecho por Knud Krabbe en 1916 5, la formación informado de los fagocitos multinucleadas que contienen restos de lípidos que se han llamado &#39;globoides células&#39; y son una característica definitoria de esta enfermedad. Células globosas son el rasgo distintivo de GLD patología, aunque su papel en GLD mucho tiempo se ha ignorado. Curiosamente, estas células se encuentran entre los primeros cambios característicos en el tejido del SNC de GLD. Esta falta de conocimiento puede haber sido debido a la suposición de que la formación de los fagocitos multinucleadas, llamadas células gigantes en otras enfermedades, se considera típicamente como consecuencia de la patología y no una fuerza impulsora patogénico inicial 9. Por lo tanto, ha habido pocos estudios que investigan el mecanismo por el whicélulas globoides ch se forman a partir de los fagocitos, particularmente en el SNC de GLD. El procedimiento descrito en este informe se centra en la importancia de la formación de células globosas en el SNC y nuestra demostración previa de que multinucleación inducida psicosina de microglia in vitro y estas células mostraron niveles más altos de actividad fagocítica. Consistente con estas observaciones, las células globoides en los cerebros twitcher frecuentemente contienen restos PAS positivo, lo que sugiere altos niveles de actividad fagocítica. Células globosas también se encuentran para ser immunopositive de ferritina (un marcador de microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcador de monocitos), y algunos son también positivas para vimentina (una proteína intermedia de filamento y el marcador de astrocitos y microglia activada) 11, HLA-DRa (un receptor de la superficie MHCII), y TNF-α 7, y Iba-1 (una proteína de unión de calcio utilizado para identificar microglia) 12. Sobre la base de esta colección de marcadores, las células globoides originan a partir de microglia que se desarrollanun fenotipo único. A pesar de su singularidad, la función y la contribución de los GC a GLD patogénesis específica ha sido pasado por alto. Células globosas se han pensado para ser una consecuencia secundaria de la desmielinización crónica. Sin embargo, estudios anteriores que examinaron la asociación temporal de células globoides a la patología de la materia blanca del GLD han identificado la presencia de células globoides a finales de embriones para el periodo posnatal temprana; tiempos anteriores apoptosis de los oligodendrocitos y desmielinización abierta 13. Por lo tanto, la secuencia temporal de desarrollo de la neuropatología en GLD sugiere que las células globoides se forman antes de desmielinización en esta enfermedad 14. Esto condujo a la hipótesis de que la formación temprana de células globoides en GLD puede representar un acontecimiento patogénico definir en lugar de una respuesta reactiva secundaria a daño de oligodendrocitos 15. Además, la desregulación de la actividad microglial en GLD se ha considerado un factor limitar la eficacia a largo plazo de las terapias de células madre hematopeotic para el tratamiento de esta enfermedad 16. Por lo tanto, se espera que la investigación de las funciones celulares y la regulación de la microglia y células globoides, en respuesta a psicosina para proporcionar nuevos conocimientos en la patogénesis de GLD. Hasta hace poco, la falta de un modelo apropiado para estudiar la formación de células globosas había limitado la comprensión de la función precisa y la contribución de estas células a la patología de GLD. En estudios recientes, se determinó que las células globoides-como se pueden formar en respuesta directa a psicosina, una toxina de lípidos patógena que se acumula en GLD. Encontramos que la microglia, pero no los macrófagos, se activan y se transforman en células globoides en cultivos gliales primarios en respuesta a psicosina 15. Esta transformación en células globoides se encontró que es mediado por la proteasa extracelular, metaloproteinasa de matriz (MMP) -3 15. Más recientemente, hemoshan ampliado estos hallazgos y determinó que las células de la microglia y globoides psicosina activado desarrollados en este sistema modelo in vitro en son potencialmente tóxicos para los oligodendrocitos y las células progenitoras de oligodendrocitos. Por lo tanto, cuando se considera en el contexto de GLD, la acumulación temprana de psicosina y la formación de células globoides anteriores a la desmielinización apoyaría un papel primario y posiblemente patógena emergente para la microglia en esta enfermedad. Proponemos que el estudio de la formación de células globosas revelará nueva información acerca de la patogénesis de la División de Asuntos Jurídicos, que contribuirá a nuestra comprensión de esta enfermedad. Por otra parte, este nuevo modelo celular de GLD puede proporcionar un nuevo formato de la que nuevos enfoques terapéuticos para abordar los cambios patológicos en la enfermedad podrían ser probados. Por lo tanto, en este informe se proporciona un protocolo detallado para el desarrollo in vitro de células globoides inducida psicosina-de cultivos primarios de células gliales no mielinizantes.

<table><tbody><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Life technologies</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Neural Tissue Dissociation Kit</td><td>Miltenyi</td><td>130-092-628</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;#956;m cell-strainer</td><td>Fisherbrand</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Hank&amp;rsquo;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;).</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s modified eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>fetal bovine serum (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Penicilin/Streptomycin</td><td>Life technologies</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution</td><td>Life technologies</td><td>25299-056</td><td></td></tr><tr><td>Psychosine</td><td>Sigma</td><td>P9256</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Electron Microscopy Science</td><td>19208</td><td></td></tr><tr><td>Normal Goat Serum (NGS)</td><td>Invitrogen</td><td>PCN5000</td><td></td></tr><tr><td>Iba-1</td><td>WAKO</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor conjugated antisera</td><td>Life Technologies</td><td>Various</td><td></td></tr><tr><td>Mounting Media</td><td>Southern Biotech</td><td>OB100-01</td><td></td></tr><tr><td>Phagocytic Assay Kit</td><td>Cayman Chemicals</td><td>500290</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>BP310-500</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

La función precisa de la microglia multi-nucleado, llamadas células globoides, que son únicamente abundantes en el sistema nervioso central de leucodistrofia de células globoides (GLD) no está clara. Esta brecha en el conocimiento se ha visto obstaculizado por la falta de un adecuado modelo in vitro para el estudio. Aquí se describe un sistema de cultivo glial murino primaria en el que el tratamiento con resultados psicosina en multinucleación de microglia se asemejan a las células globoides característicos encontrados en GLD. El uso de este novedoso sistema, se definieron las condiciones y modos de análisis para el estudio de las células globoides. El uso potencial de este sistema modelo fue validado en nuestro estudio anterior, que identificó un posible papel de metaloproteinasas de matriz (MMP) -3 en GLD. Este novedoso sistema in vitro puede ser un modelo útil para estudiar la formación y función, sino también el potencial manipulación terapéutica, de estas células únicas.

Este protocolo, como está escrito, se espera que tome aproximadamente 36 días para completar de principio a fin (Ver Figura 1: Esquema de flujo de trabajo experimental). Ha sido nuestra experiencia que el desarrollo de células globosas-como &quot;en este sistema de cultivo primario es a la vez fiable y reproducible: la formación de células multinucleadas en respuesta a psicosina se observó consistentemente con 7 días de tratamiento. La tinción inmunocitoquímica de m...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo para el Estudio del Celular Fisiopatología en globoides Leucodistrofia Celular

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

an-vitro-model-for-study-cellular-pathophysiology-globoid-cell

Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K vistas.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and Schwann cells in the peripheral nervous system (PNS). We use an in vitro myelination assay, an established model for studying CNS myelination in vitro. To do this, oligodendrocyte precursor cells (OPCs) are added to the purified primary rodent dorsal root ganglion (DRG) neurons to form myelinating co-cultures. In order to specifically interrogate the roles that particular proteins expressed by oligodendrocytes exert upon myelination we have developed protocols that selectively transduce OPCs using the lentivirus overexpressing wild type, constitutively active or dominant negative proteins before being seeded onto the DRG neurons. This allows us to specifically interrogate the roles of these oligodendroglial proteins in regulating myelination. The protocols can also be applied in the study of other cell types, thus providing an approach that allows selective manipulation of proteins expressed by a desired cell type, such as oligodendrocytes for the targeted study of signaling and compensation mechanisms. In conclusion, combining the in vitro myelination assay with lentiviral infected OPCs provides a strategic tool for the analysis of molecular mechanisms involved in myelination.

Production and Use of Lentivirus to Selectively Transduce Primary Oligodendrocyte Precursor Cells for In Vitro Myelination Assays

Here we present protocols that offer a flexible and strategic foundation for virally manipulating oligodendrocyte precursor cells to overexpress proteins of interest in order to specifically interrogate their role in oligodendrocytes via the in vitro model of central nervous system myelination.

Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para<em&gt; In Vitro</em&gt; Ensayos de mielinización

Myelination is a complex process that involves both neurons and the myelin forming glial cells, oligodendrocytes in the central nervous system (CNS) and ...

Investigación

Biología del Desarrollo

Preparation of Rat Oligodendrocyte Progenitor Cultures and Quantification of Oligodendrogenesis Using Dual-infrared Fluorescence Scanning

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating diseases such as multiple sclerosis and transverse myelitis. Myelination is required to not only facilitate rapid impulse propagation within the central nervous system, but also to provide trophic support to underlying axons. Oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) can be studied in vitro to help identify factors that may promote or inhibit oligodendrocyte differentiation. To date, many of the methods available to evaluate this process have either required large numbers of cells, thus limiting the number of conditions that can be investigated at any one time, or labor-intensive methods of quantification. Herein, we describe a protocol for the isolation of large numbers of highly pure OPCs together with a fast and reliable method to determine oligodendrogenesis from multiple conditions simultaneously. OPCs are isolated from P5-P7 neonatal rat cortices and grown in vitro for three days prior to differentiation. Four days after differentiation, oligodendrogenesis is evaluated using a dual-infrared fluorescence-scanning assay to determine expression of the myelin protein.

Oligodendrocytes are the myelinating cells of the central nervous system. This protocol describes a method for the isolation and culture of their precursors, oligodendrocyte progenitor cells, from rat cortices, as well as a fast and reliable quantitative method to evaluate oligodendrogenesis in vitro in response to experimental factors.

Preparación de la rata progenitoras de oligodendrocitos culturas y cuantificación de Oligodendrogenesis Uso del análisis de fluorescencia de doble infrarrojo

Efficient oligodendrogenesis is the therapeutic goal of a number of areas of research including spinal cord injury, neonatal hypoxia, and demyelinating ...

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors within the oligodendrocytic cell lineage. Recently, these cells have been studied as potential source for restorative therapies in white matter diseases. Periventricular leukomalacia (PVL) is the leading cause of non-genetic white matter disease in childhood and affects up to 50% of extremely premature infants. The data suggest a heightened susceptibility of the developing brain to hypoxia-ischemia, oxidative stress and excitotoxicity that selectively targets nascent white matter. Glial restricted precursors (GRP), oligodendrocyte progenitor cells (OPC) and immature oligodendrocytes (preOL) seem to be key players in the development of PVL and are the subject of continuing studies. Furthermore, previous studies have identified a subset of CNS tissue that has increased susceptibility to glutamate excitotoxicity as well as a developmental pattern to this susceptibility. Our laboratory is currently investigating the role of oligodendrocyte progenitors in PVL and use cells at the GRP stage of development. We utilize these derived GRP cells in several experimental paradigms to test their response to select stresses consistent with PVL. GRP cells can be manipulated in vitro into OPCs and preOL for transplantation experiments with mouse PVL models and in vitro models of PVL-like insults including hypoxia-ischemia. By using cultured cells and in vitro studies there would be reduced variability between experiments which facilitates interpretation of the data. Cultured cells also allows for enrichment of the GRP population while minimizing the impact of contaminating cells of non-GRP phenotype.

This protocol outlines the derivation of Glial Restricted Precursors from fetal spinal cords and maintained in vitro either for transplantation or for the study of oligodendrocytic lineage.

Derivación de los precursores gliales restringidas de los ratones E13

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

Neurociencias

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter lesions in inflammatory demyelinating disorders like multiple sclerosis (MS). In these disorders, mainly CD8+ T-cells of putative specificity for myelin- and oligodendrocyte-related antigens are found, so that neuronal apoptosis in grey matter lesions may be a collateral effect of these cells. Different types of animal models are established to study the underlying mechanisms of the mentioned pathophysiological processes. However, although they mimic some aspects of MS, it is impossible to dissect the exact mechanism and time course of &#8216;&#8216;collateral&#8217;&#8217; neuronal cell death. To address this course, here we show a protocol to study the mechanisms and time response of neuronal damage following an oligodendrocyte-directed CD8+ T cell attack. To target only the myelin sheath and the oligodendrocytes, in vitro activated oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells are transferred into acutely isolated brain slices. After a defined incubation period, myelin and neuronal damage can be analysed in different regions of interest. Potential applications and limitations of this model will be discussed.

An Ex vivo Model of an Oligodendrocyte-directed T-Cell Attack in Acute Brain Slices

To address mechanisms of demyelination and neuronal apoptosis in cortical lesions of inflammatory demyelinating disorders, different animal models are used. We here describe an ex vivo approach by using oligodendrocyte-specific CD8+ T-cells on brain slices, resulting in oligodendroglial and neuronal death. Potential applications and limitations of the model are discussed.

Una<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modelo de un ataque de células T Oligodendrocyte dirigida en Rebanadas cerebral agudo

Death of oligodendrocytes accompanied by destruction of neurons and axons are typical histopathological findings in cortical and subcortical grey matter ...

Inmunología e Infección

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

Análisis de linfocitos extravasación El uso de una<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la barrera sangre-cerebro humano

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

Modeling Myotonic Dystrophy 1 in C2C12 Myoblast Cells

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are still important because they offer an efficient cellular alternative for studying cellular and molecular events. Though C2C12 myoblast cells have been widely used to study myogenesis, resistance to gene transfection, or viral transduction, hinders research in C2C12 cells. Here, we describe an optimized protocol that includes daily maintenance, transfection and transduction procedures to introduce genes into C2C12 myoblasts and the induction of myocyte differentiation. Collectively, these procedures enable best transfection/transduction efficiencies, as well as consistent differentiation outcomes. The protocol described in establishing DM1 myoblast cell models would benefit the study of myotonic dystrophy, as well as other muscular diseases.

In this protocol, we present the procedures in establishing myotonic dystrophy 1 myoblast models, including optimized C2C12 cell maintenance, gene transfection/transduction, and myocyte differentiation.

Modelado de la distrofia miotónica 1 en las células C2C12 mioblastos

Myotonic dystrophy 1 (DM1) is a common form of muscular dystrophy. Although several animal models have been established for DM1, myoblast cell models are ...

Medicina

Adult Mouse DRG Explant and Dissociated Cell Models to Investigate Neuroplasticity and Responses to Environmental Insults Including Viral Infection

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory neurons and glial satellite cells. These are useful and versatile models to investigate a variety of biological responses associated with physiological and pathological conditions of the peripheral nervous system (PNS) ranging from neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and viral infection. The usage of DRG explant is scientifically advantageous compared to simplistic single cells models for multiple reasons. For instance, as an organotypic culture, the DRG explant allows ex vivo transfer of an entire neuronal network including the extracellular microenvironment that play a significant role in all the neuronal and glial functions. Further, DRG explants can also be maintained ex vivo for several days and the culture conditions can be perturbed as desired. In addition, the harvested DRG can be further dissociated into an in vitro co-culture of primary sensory neurons and satellite glial cells to investigate neuronal-glial interaction, neuritogenesis, axonal cone interaction with the extracellular microenvironment, and more general, any aspect associated with the neuronal metabolism. Therefore, the DRG-explant system offers a great deal of flexibility to study a wide array of events related to biological, physiological, and pathological conditions in a cost-effective manner.

In this report, the advantages of organotypic cultures and dissociated primary cultures of mouse-derived dorsal root ganglia are highlighted to investigate a wide range of mechanisms associated with neuron-glial interaction, neuroplasticity, neuroinflammation, and response to viral infection.

Ratón adulto DRG explante y disociado modelos celulares para investigar respuestas a insultos ambientales incluyendo infección Viral y la neuroplasticidad

This protocol describes an ex vivo model of mouse-derived dorsal root ganglia (DRG) explant and in vitro DRG-derived co-culture of dissociated sensory ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

En Vivo Modelado del Genoma Humano Morbid usando Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Biología

Ex Vivo Myelination and Remyelination in Cerebellar Slice Cultures as a Quantitative Model for Developmental and Disease-Relevant Manipulations

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in vitro, although scalable,&#160;does not recapitulate axonal myelination. OPC-neuron cocultures and OPC-fiber cultures allow for the examination of in vitro myelination, but they lack additional cell types that are present in vivo, such as astrocytes and microglia. In vivo&#160;mouse models, however, are less amenable to chemical, environmental, and genetic manipulation and are much more labor intensive. Here, we describe&#160;an&#160;ex vivo mouse cerebellar slice culture (CSC) quantitative system that is useful for: 1) studying developmental myelination, 2) modeling demyelination and remyelination, and 3) conducting translational research. Sagittal sections of the cerebellum and hindbrain are isolated from postnatal day (P) 0&#8211;2 mice, after which they myelinate&#160;ex vivo&#160;for 12 days. During this period, slices can be manipulated in various ways, including the addition of compounds to test for an effect on developmental myelination. In addition, tissue can be fixed for electron microscopy to assess myelin ultrastructure and compaction. To model disease, CSC can be subjected to acute hypoxia to induce hypomyelination. Demyelination in these explants can also be induced by lysolecithin, which allows for the identification of factors that promote remyelination. Aside from chemical and environmental modifications, CSC can be isolated from transgenic mice and are responsive to genetic manipulation induced with Ad-Cre adenoviruses and tamoxifen. Thus, cerebellar slice cultures are a fast, reproducible, and quantifiable model for recapitulating myelination.

Presented is a protocol for an ex vivo quantitative model of demyelination and remyelination using mouse cerebellar slice cultures. This method closely recapitulates an in vivo model with its full complement of CNS cell types in intact tissue, while maintaining the chemical, genetic, and environmental amenability of an in vitro system.

Studying myelination&#160;in vitro&#160;and&#160;in vivo poses numerous challenges. The differentiation of oligodendrocyte precursor cells (OPCs)&#160;in ...

Dissection and Isolation of Murine Glia from Multiple Central Nervous System Regions

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine neonates for the isolation of glial subpopulations. The purpose of the procedure is to dissociate microglia, oligodendrocyte progenitor cells (OPCs), and astrocytes from cortical, cerebellar, brainstem, and spinal cord tissue to facilitate further in vitro analysis. The CNS region isolation procedures allow for the determination of regional heterogeneity among glia in multiple cell culture systems. Rapid CNS region isolation is performed, followed by the mechanical removal of meninges to prevent meningeal cell contamination of glia. This protocol combines gentle tissue dissociation and plating on a specified matrix designed to preserve cell integrity and adherence. Isolating mixed glia from multiple CNS regions provides a comprehensive analysis of potentially heterogenous glia while maximizing the use of individual experimental animals. Additionally, following dissociation of regional tissue, mixed glia are further divided into multiple cell types including microglia, OPCs, and astrocytes for use in either single cell type, cell culture plate inserts, or co-culture systems. Overall, the demonstrated techniques provide a comprehensive protocol of broad applicability for careful dissection of four individual CNS regions from murine neonates and includes methods for the isolation of three individual glia cell types to examine regional heterogeneity in any number of in vitro cell culture systems or assays.

Here we present a protocol for in vitro isolation of multiple glial cell populations from a mouse CNS. This method allows for the segregation of regional microglia, oligodendrocyte precursor cells, and astrocytes to study the phenotypes of each in a variety of culture systems.

Disección y aislamiento de la glía murina de múltiples regiones del sistema nervioso central

The methods presented here demonstrate laboratory procedures for the dissection of four different regions of the central nervous system (CNS) from murine ...

Un

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Producción y Uso de lentivirus de células selectivamente la transducción primaria Oligodendrocyte precursor para