This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

動物に関わるすべての手順は、実験動物の愛護管理と使用に関する方針に従って行った実験動物福祉（NIH）の事務所が定めるだけの大学の施設内動物管理使用委員会（IACUC）から承認を得てコネチカット保健センター。 混合グリア培養物の調製<ol><li>使用前にすべての楽器を滅菌する。冷たい保つために氷の上で維持さ3の滅菌60ミリメートルペトリ皿にマグネシウム（Mg 2 +またはCa 2 +を）全くの陽イオンを含まない氷冷滅菌ハンクス液（HBSS）の3ミリリットルを追加します。 </li><li>以前に17,18に記載されているように、出生後のP0〜P2の仔マウスからの皮質を分離します。 注：このような海馬などの皮質下構造は、これらの培養物に含まれていません。 </li><li>ねを使って、慎重に髄膜を除去した後、新鮮なHBSSに隔離皮質を転送し、酵素的に組織を解離製造業者のプロトコルに従ってウラル組織切開キット。 </li><li>プレート細胞無菌T-175フラスコに及び[1×ペニシリン/ストレプトマイシンを含む10％ウシ胎児血清（FBS）を含むダ​​ルベッコ改変イーグル培地（DMEM）]を培地中で一晩インキュベートする。 </li><li>新鮮な培地と次の日、すべてのメディアを交換してください。約3週間または携帯単層が確立されるまで、通常のメディアの変化と、文化をインキュベートし続けます。 注：1の比率19：この単層は、約10とアストロサイトとミクログリアから構成されます。 </li></ol>混合グリア培養における2球様細胞の誘導<ol><li> ECMでコーティングされたカバースリップを準備します。 <ol><li> 30分間滅菌したペトリ皿中の滅菌1N塩酸酸（HCl）で円形のカバースリップを浸す。滅菌水の3倍とカバーガラスを洗浄した後、少なくとも20分間、95％エタノールに浸します。した後、空気乾燥させます。 </li><li>希釈された細胞外MATR地滴パラフィルムのシート上九（ECM）タンパク質コーティング材料（滅菌リン酸緩衝液[PBS]中に溶解ラミニンを10μg/ mlの、例えば 150〜250μlの/滴）。これらの液滴の上に置かれたときにカバーガラスが接触しないように液滴を配布します。静かに鉗子を用いて、液滴上にそれぞれ乾燥したカバースリップを配置。 </li><li>約のための小滴上にカバースリップのままにしておきます。サッシと培養フード内部の4-6時間はクローズ。 </li><li> 24ウェルプレートのウェルのそれぞれにECMコーティングされたカバースリップ（ECMコーティングされた面を上）を配置します。滅菌PBSで3回で各ウェルを洗浄し、必要になるまで4℃で保管してください。 </li></ol></li><li>カバーガラス上にめっき用のグリア細胞を調製する。 <ol><li>グリア培養物から培地を吸引除去し、穏やかに滅菌PBS 10mlでグリア単層3回洗う。次に、T-175 8〜10 mlトリプシン-EDTA溶液を加え、37℃で5〜10分間インキュベートする。 </li><li>単層の大部分が分離されたら、完全培地20mlのを追加フラスコにトリプシン処理を停止します。 50mlの円錐チューブに分離した細胞を含む培地を収集し、室温で300×gで10分間スピン。 </li><li>優しくP1000ピペットを用いて溶液をピペッティングすることによって新鮮な完全培地2ml中で細胞を再懸濁後、ペレットを乱すことなく、上清を吸引します。 </li><li>所望の密度（ 例えば 、10 5細胞/ ml）での血球計算板を用いて細胞、完全培地中で再懸濁した細胞の数を決定します。プレートのECMコーティングされたカバーガラス上に細胞（ 例えば 500μlの24ウェルプレートの各ウェルに）。 37℃でのインキュベーションの3〜5日間の各ウェルに追加の新鮮な完全メディアを追加するか、細胞が所望の視覚コンフルエンスに成長するまで。 </li></ol></li><li>サイコシンでの治療。 <ol><li>ストック濃度のジメチルスルホキシド（108.3ミリモル）（DMSO）にサイコシンを再構成。ワーキングストックを作るために100％EtOHにこのストックを希釈することができますnは10μMの最終濃度を達成するために、24ウェルプレートの各ウェルに添加すること。 </li><li>プシコシンを追加する時に、穏やかに培養培地中にプシコシンを混合する培養プレートを旋回させる。一週間一日おきに、10μMと同等のものを追加することでサイコシンサプリメント。 </li></ol></li><li>プシコシン処置の7日後、各ウェルに冷4％パラホルムアルデヒド（PFA）の培地および500μlのピペットを収集する。細胞を固定するために20分間室温でインキュベートする。その後、PBSで各ウェル3回洗浄し（下記参照）、免疫細胞化学のために処理するまで、4℃でプレートを保つ。 注記：所望であれば、細胞培養培地は、この時点で酵素的またはELISAアッセイ用に回収することができる。 </li></ol>球様細胞を可視化するために3。免疫細胞化学（ICC） <ol><li>ブロッキング緩衝液をPBSに交換し、[PBS + 0.3％のTween-20 + 5％正常ヤギ血清（NGS）]、そして室温で1時間、細胞をインキュベートする。 </li><li>中に伊庭-1に対する一次抗血清中の固定された細胞をcubate [（1：1,000）PBSで希釈+ 0.3％+ 2％NGS-20トゥイーン]室温で少なくとも1時間、その後PBSで3回、5分間でそれぞれをよく洗う/洗う。 </li><li>核を識別するための4 &#39;、6 - ジアミジノ-2 - フェニルインドール（千DAPI、1）で抗体標識及び対比染色のプライマリを識別するために適切な二次蛍光標識抗体を加える。室温で1時間、二次抗体溶液中でインキュベートし、PBSで3×5分間洗浄する。 </li><li>封入剤を使用したスライドを顕微鏡に、各カバーガラスをマウントします。ビューは、視覚的·定量分析のための蛍光顕微鏡にスライドさせる。 </li></ol> 4。分析と初代培養中球様細胞の特性評価<ol><li>培養中の球様細胞を識別するために、次の3つの形態学的基準を使用します。 <ol><li>ミクログリアマーカー、伊庭-1 +のための免疫標識により、蛍光顕微鏡を用いて、球様細胞を識別します。 </li><li>確認する多核として球様細胞（ すなわち 2つ以上のDAPI陽性核を含む）。 </li><li>ミクログリア細胞休止の高度に分岐した外観とは異なる丸い形態によって球様細胞を識別します。 注：細胞はまた、これらの培養物からのフローサイトメトリーによる細胞表面マーカー分析および定量のために回収することができる。 </li></ol></li><li>ミクログリアおよび球様細胞の貪食活性化を測定する<ol><li>プシコシン処理したミクログリアの食作用活性を評価するために、メーカーの指示に従ってウェルにFITCで標識したラテックスビーズを加える。前PFAで固定し、蛍光共役ラテックスビーズ48時間を追加します。ビーズで処理した細胞（セクション2.4で述べたように）、および免疫細胞化学のためのプロセスを（セクション3で説明したように）修正しました。 </li><li>彼らは、フルオロフォア標識されたビーズの蛍光発光スペクトルと重複しないようにフルオロフォア結合二次抗体を選択する。 </li><li> ANALYZ電子蛍光標識ビーズと共局在する細胞を同定することにより、伊庭-1 +ミクログリアの貪食プロファイル。 注：サイコシンがミクログリアを活性化します。貪食ビーズは、この培養設定で単核および多核伊庭-1 +細胞内で識別されます。 </li></ol></li></ol>精製ミクログリア培養から球様細胞の誘導5。 注：アストロサイトとミクログリアの間に間シグナルを解読するための代替アプローチは、 この in vitro球様細胞モデルのもう1つの利点である。次の手順（セクション5.2を参照）で説明したように再播種または共培養のための一次ミクログリア細胞の精製は、培養中のそれらのより低い粘着性によって達成することができる。 <ol><li> 50mlの円錐チューブにコンフルエント混合グリア培養物からメディアを集め、インキュベーター中、37℃で、それを維持する。 </li><li>次混合グリア培養物からミクログリア離。<ol><li>コンフルエント混合グリア培養T175フラスコから培地を除去した後、[+ 25mMの4-（2 - ヒドロキシエチル）-1 - ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）+ 25 mMの重炭酸ナトリウム（Sigma）を完全培地からなる]暖かい振盪メディアを追加する。 100rpmで（37℃）で、オービタルシェーカーで3〜4時間にわたってフラスコを振る。 50mlコニカルチューブにこれらの振とうフラスコから培地を収集します。 注：このメディアは、フラスコからあまり付着性ミクログリアが含まれます。 </li><li>室温で10分間300×gでメディアをスピン。アストロサイト馴化培地2ml中の細胞を再懸濁後、上清を吸引し、（ステップ5.1に集め）。 </li><li>血球計数器を用いて獲得したセルの数を確立した後、基板コーティングしたカバーガラス上にミクログリア細胞をプレート（セクション2.1を参照）免疫細胞化学のために、または他の細胞型との共培養のための球様細胞の将来の収集のために超低付着ウェルプレート上にプレート、そのようなオリゴデンドロサイトなど（DESCなど次の項のribed）。 注：一度（セクション2.3を参照）のようにミクログリアはサイコシン（10μM）で処理することができるメッキ。 </li></ol></li><li>細胞毒性分析のための一次オリゴデンドロサイトとの共培養。 NOTE：オリゴデンドロサイト、またはオリゴデンドロサイト前駆細胞の初代培養物へのその後の共培養のための低接着プレートからプシコシン処理したミクログリアの収集は、 インビトロでのこれらのグロボイド細胞様細胞の潜在的な細胞傷害性機能を調べるために使用することができる。 <ol><li>確立された方法18,20を使用して、プライマリオリゴデンドロサイトの培養液を開発する。サイコシン処理したミクログリアを収集するには、静かに井戸の底から緩く接着細胞を分離するためにピペット。細胞を収集し、10分間300×gで遠心分離し、次に注意深くオリゴデンドロサイト分化培地に再懸濁[（1×）L-グルタミン、神経基本培地からなる、B-27サプリメント（1×）、およびトリヨードチロニン（T3、10ng / mlの）]。 </li><li>血球計数器を用いて細胞数をカウントした後、おおよそ1になり、1×10 5細胞/ mlで、オリゴデンドロサイト培養上ミクログリアをシード：2ミクログリア/オリゴデンドロサイトの比率。最大3日間共培養として培養する。 </li><li>免疫細胞化学のために細胞を修正しました。（セクション2.4を参照）。 ELISAのために細胞培養培地を収集したり、必要に応じて化学分析。 </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Rafi, M. A., Luzi, P., Chen, Y. Q., Wenger, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+large+deletion+together+with+a+point+mutation+in+the+GALC+gene+is+a+common+mutant+allele+in+patients+with+infantile+Krabbe+disease.">A large deletion together with a point mutation in the GALC gene is a common mutant allele in patients with infantile Krabbe disease.</a> Hum Mol Genet. 4, 1285-1289 (1995).</li><li>Duffner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+long-term+outcomes+of+presymptomatic+infants+transplanted+for+Krabbe+disease:+report+of+the+workshop+held+on+July+11+and+12.">The long-term outcomes of presymptomatic infants transplanted for Krabbe disease: report of the workshop held on July 11 and 12.</a> Genet Med. 11, 450-454 (2008).</li><li>Duffner, P. 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The authors declare no conflicts of interest.

ここに記載されているプロトコルは、活性化したミクログリアと球様細胞の発達および機能的特徴を研究するための新しいモデルシステムを提供します。イムらによる以前の研究。 HEK293細胞株を使用する球様細胞形成の研究のための21本のプロトコルの開発のためのテンプレートを提供した。それは、モデルで導出球様細胞がGLDにおける識別可能なネイティブ球様細胞とは異?...

また、クラッベ病として知られている球様細胞白質萎縮症（GLD）は、galatocerebrosidase（GALC）遺伝子1における機能変異の喪失に起因する致命的な脱髄性疾患である。 GLDの最も一般的な形態は、幼児期に発症に代表される、多くの場合、年齢2,3、5年前にモーターと早死につながる認知機能低下の積極的な臨床経過することを特徴とする乳児変種です。遺伝子検査は、GLD 4の診断を確認するために使用される。 GLDの神経病理は、球様細胞5-7と呼ばれる広範な脱髄、神経細胞の萎縮、アストログリオーシスおよび充血多核ミクログリアの存在が明らかになる。これらの目立つ細胞の特定の機能は、とらえどころのない推移しているものの、多くの場合、それらの細胞質内に管のある介在物を含む球様細胞の同定は、過去97年間のGLDの決定的な特徴となっている。 非myelの関与GLDの病因におけるinatingグリア（ミクログリアおよびアストロサイト）は、長いこの病気8における深遠な脱髄に二次応答と考えられてきた。興味深いことに、1916年5クヌードクラッベによるこの病気の最初の説明は、「球様細胞」と命名し、この病気の決定的な特徴であるされた脂質の破片を含む多核食細胞の形成を報告した。 GLDでの役割は長い間無視されてきたが、球様細胞は、GLDの病理学の顕著な特徴である。興味深いことに、これらの細胞は、GLDのCNS組織における最も初期の特徴的な変化の一つである。知識の欠如が原因多核食細胞の形成は、他の疾患における巨細胞と呼ばれることを前提に、一般的に病理の結果ではなく、初期の病原性駆動力9とみなされている可能性があります。したがって、WHIのメカニズムを調査し、いくつかの研究がなされているchのグロボイド細胞が特にGLDのCNSにおいて、食細胞から形成される。本報告書に記載されている手順は、CNS中球様細胞の形成及びin vitroでのミクログリアのこれまでのデモサイコシン誘発性多核化の重要性に焦点を当て、これらの細胞は食作用活性の高いレベルを示した。これらの観​​察と一致して、トウィッチャー脳における球様細胞は、頻繁に食作用活性の高いレベルを示唆し、PAS陽性の破片が含まれています。グロボイド細胞はまた、フェリチンのために免疫陽性であることが見出されている（小膠細胞のマーカー）10、KP-1 / CD68（単球マーカー）、およびいくつかはまた、ビメンチンに対して陽性である（中間径フィラメントタンパク質およびアストロサイトのマーカーおよび活性化ミクログリア）11、 HLA-DRA（MHCII表面受容体）、およびTNF-α7、及び伊庭-1 12（小膠細胞を識別するために使用されるカルシウム結合タンパク質）。マーカーのこのコレクションをもとに、球様細胞が発達ミクログリアから発信ユニークな表現型。 彼らの独自性にもかかわらず、特定の機能とGLDの病因へのGCの寄与が大部分は見落とされています。球様細胞は、慢性脱髄の二次的な結果であると考えられてきた。しかし、GLDの白質の病理学に球様細胞の時間的関連性を検討し、過去の研究では、出生後早期の期間に、後期胚形成中球様細胞の存在を同定した。オリゴデンドロサイトのアポトーシスおよび明白な脱髄13に先行回。したがって、GLDにおいて神経病理の発症の時間的シーケンスは、グロボイド細胞がこの疾患の14脱髄の予め形成されていることを示唆している。これはGLD中球様細胞の初期形成はオリゴデンドロサイトのダメージ15に二次的に、反応性応答ではなく、定義する病原性事象を表すことが私たちの仮説につながった。さらに、GLDにおけるミクログリアの活性の調節不全は、事実上考えられてきたrは、この疾患を治療するための16 hematopeotic幹細胞治療の長期有効性を制限する。したがって、プシコシンに応答して細胞機能及びミクログリアの規制、グロボイド細胞を、調査GLDの病因に新たな洞察を提供することが期待される。 最近まで、球様細胞の形成を研究するための適切なモデルの欠如は、GLDの病理学にこれらの細胞の正確な機能と貢献の理解を制限されていた。最近の研究では、グロボイド細胞様細胞がプシコシンに直接応答して、GLDに蓄積する病原性脂質毒素を形成することができることが判明した。私たちは、ミクログリアを発見したではなく、マクロファージは、活性化され、15をサイコシンに応じて、一次グリア培養における球様細胞に形質転換する。球様細胞へのこの変換は、細胞外プロテアーゼ、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）-3 15により媒介されることが見出された。さらに最近では、私たちこのin vitroモデル系で開発されたものサイコシン活性化ミクログリアと球様細胞をこれらの調査結果を拡張し、決定したオリゴデンドロサイトおよびオリゴデンドロサイト前駆細胞に強力に有毒である。したがって、GLD、サイコシンやこの疾患におけるミクログリアのための新たなプライマリおよびおそらく病原性の役割を支持する脱髄の前に球様細胞の形成の初期の蓄積の文脈で考えると。 私たちは、球様細胞形成の研究は、この病気の理解に貢献するGLDの病因に関する新しい情報を明らかにすることを提案する。また、GLDこの新しい細胞モデルは、この疾患の病理学的変化に対処するための新規な治療的アプローチをテストすることができ、そこから新たなフォーマットを提供することができる。したがって、本報告書で、私たちは、非ミエリン形成グリアの初代培養からサ ​​イコシン誘発性球様細胞のインビトロ開発のための詳細なプロトコルを提供する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

球様細胞白質萎縮症（GLD）の中枢神経系においてユニークに豊富に存在する球様細胞と呼ばれる多核ミクログリアの正確な機能は、不明である。知識のこのギャップは、研究のためのin vitroモデルで適切なの欠如によって妨げられてきた。ここで、私たちは初代マウスグリア培養系を記述するGLDで見られる特徴的な球様細胞に似たミクログリアの多核化におけるサイコシン結果による治療中。この新規なシステムを用いて、グロボイド細胞の研究のための条件および分析のモードを定義した。このモデル系の使用の可能性は、マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）のための潜在的な役割を同定し、当社の以前の研究で検証された-3 GLDに。 インビトロ系でのこの小説はこれらのユニークな細胞の形成と機能だけでなく、潜在的な治療操作を、研究するのに有用なモデルかもしれません。

このプロトコルは、書かれたように、（：実験ワークフロースキーム図1を参照してください）最初から最後まで完了するのに約36日かかると予想される。サイコシンに応答した多核細胞の形成は、一貫して7日間の処理で観察されている：それは、この初代培養系における「球様様」細胞の開発は信頼性と再現性の両方であることを私たちの経験をされています。 <p class="jove_co...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

アン<em&gt;体外</em球様細胞白質萎縮症における細胞病態の研究のための&gt;モデル

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K ビュー.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

網膜色素上皮生理学と病態の研究のための実験的モデル

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

神経科学

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

網膜神経節細胞の生存を研究するために視神経挫滅モデルマウス

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The blood-brain barrier (BBB) consisting of EC, astrocyte end-feet, pericytes and the basal membrane is responsible for the protection and homeostasis of the brain parenchyma. In vitro BBB models are common tools to study the structure and function of the BBB at the cellular level. A considerable number of different in vitro BBB models have been established for research in different laboratories to date. Usually, the cells are obtained from bovine, porcine, rat or mouse brain tissue (discussed in detail in the review by Wilhelm et al. 1). Human tissue samples are available only in a restricted number of laboratories or companies 2,3. While primary cell preparations are time consuming and the EC cultures can differ from batch to batch, the establishment of immortalized EC lines is the focus of scientific interest.
Here, we present a method for establishing an immortalized brain microvascular EC line from neonatal mouse brain. We describe the procedure step-by-step listing the reagents and solutions used. The method established by our lab allows the isolation of a homogenous immortalized endothelial cell line within four to five weeks. The brain microvascular endothelial cell lines termed cEND 4 (from cerebral cortex) and cerebEND 5 (from cerebellar cortex), were isolated according to this procedure in the F&ouml;rster laboratory and have been effectively used for explanation of different physiological and pathological processes at the BBB. Using cEND and cerebEND we have demonstrated that these cells respond to glucocorticoid- 4,6-9 and estrogen-treatment 10 as well as to pro-infammatory mediators, such as TNFalpha 5,8. Moreover, we have studied the pathology of multiple sclerosis 11 and hypoxia 12,13 on the EC-level. The cEND and cerebEND lines can be considered as a good tool for studying the structure and function of the BBB, cellular responses of ECs to different stimuli or interaction of the EC with lymphocytes or cancer cells.

Generation of an Immortalized Murine Brain Microvascular Endothelial Cell Line as an In Vitro Blood Brain Barrier Model

This method describes how to isolate and immortalize microvascular endothelial cells from mouse brain. We describe a step-by-step protocol starting from the homogenization of brain tissue, digestion steps, seeding and immortalization of the cells. Usually, it takes about five weeks to obtain a homogenous, immortalized microvascular endothelial cell line.

として不死化マウス脳微小血管内皮細胞株の生成<em&gt; in vitroで</em&gt;血液脳関門モデル

Epithelial and endothelial cells (EC) are building paracellular barriers which protect the tissue from the external and internal environment. The ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

モデルとしての嗅覚系は、軸索の成長パターンと形態を研究する<em&gt;インビボ</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

根神経節ニューロンと差別化された脂肪由来幹細胞を背：<em&gt;インビトロ</em末梢神経再生を研究するために&gt;共培養モデル

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

後根神経節モデル：癌性神経浸潤のin vitroモデルでは

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

間接ニューロン、星状細胞共培養アッセイ：<em&gt;インビトロ</em&gt;ニューロングリアの相互作用の詳細な調査のためのセットアップ

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

子宮内エレクトロポレーションは、神経部分集団の興奮とシングルセルの接続を研究するためのアプローチ

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Methods Article

アン