This work was supported in part by grants from the National Multiple Sclerosis Society (RG 5001-A-3 to S.J.C.), the National Institutes of Health (NS065808 to E.R.B.; NS078392 to S.J.C.), start-up funds from the UConn Health Center (to SJC) and the Kim Family Fund (UCHC in support of K.I.C.).

Tutte le procedure che coinvolgono animali sono stati eseguiti in conformità con la politica sulla Humane cura e l&#39;uso di animali da laboratorio esposte dall&#39;Ufficio del Laboratorio Benessere degli Animali (NIH) e solo con l&#39;approvazione da Care and Use Committee Animal Istituzionale (IACUC) dell&#39;Università di Connecticut Health Center. 1 Preparazione delle Culture gliali miste <ol><li> Sterilizzare tutti gli strumenti prima dell&#39;uso. Aggiungere 3 ml di soluzione ghiacciata sterile di Hank equilibrata sale (HBSS) non contenenti cationi (Mg 2 + o Ca 2 +) a tre sterili 60 millimetri piastre Petri mantenute sul ghiaccio per mantenere il freddo. </li><li> Isolare le cortecce da postnatali cuccioli di topo P0-P2, come descritto in precedenza 17,18. NOTA: strutture sottocorticali, come l&#39;ippocampo, non sono incluse in queste culture. </li><li> Rimuovere con attenzione le meningi e poi trasferire le cortecce isolate di fresco HBSS e dissociare i tessuti enzimaticamente, utilizzando un neural kit di dissezione dei tessuti secondo il protocollo del produttore. </li><li> Piastra le cellule in sterili T-175 palloni e incubare una notte nei media [Modified Eagle Medium di Dulbecco (DMEM) con siero fetale bovino al 10% (FBS) contenente 1x penicillina / streptomicina]. </li><li> Sostituire tutti i media il giorno successivo con i media fresca. Continuare a incubare le culture, con cambi regolari di media, per circa 3 settimane o fino a quando viene stabilito un monostrato cellulare. NOTA: Questo monostrato sarà composto di astrociti e microglia con uno di circa 10: 1 ratio 19. </li></ol> 2 Globoid induzione delle cellule gliali in Culture misti <ol><li> Preparare i coprioggetti ECM rivestite. <ol><li> Immergere coprioggetto circolari con 1 acido sterile N cloridrico (HCl) in una piastra di Petri sterile per 30 min. Lavare coprioggetto con 3x acqua sterile e poi immergere nel 95% EtOH per almeno 20 min. e poi lasciare asciugare all&#39;aria. </li><li> Luogo goccioline di diluito matr extracellularemateriali ix (ECM) rivestimento proteina su un foglio di Parafilm (es 150-250 ml / gocciolina di laminina 10 mcg / ml disciolto in tampone fosfato sterile [PBS]). Distribuire le gocce in modo che vetrini non toccare, quando sono immessi su queste goccioline. Posizionare delicatamente ogni coprioggetto secca su una gocciolina con pinze. </li><li> Lasciare i coprioggetti sulle goccioline per ca. 4-6 hr all&#39;interno della cappa cultura con la fascia chiusa. </li><li> Posizionare i coprioggetti ECM rivestite (lato ECM rivestite up) in ciascuno dei pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. Lavare ogni pozzetto con PBS sterile 3x e conservare a 4 ° C fino al momento dell&#39;uso. </li></ol></li><li> Preparazione di cellule gliali per placcatura su vetrini. <ol><li> Aspirare il supporto dalle colture gliali e lavare delicatamente le 3x monostrato gliali con 10 ml di PBS sterile. Successivamente, aggiungere 8-10 ml di soluzione di tripsina-EDTA al T-175, e incubare per 5-10 min a 37 ° C. </li><li> Quando la maggior parte del monostrato è stato staccato, aggiungere 20 ml di completo supportoal pallone per fermare tripsinizzazione. Raccogliere i supporti contenenti le cellule staccate in un tubo conico da 50 ml e centrifugare per 10 minuti a 300 xg a temperatura ambiente. </li><li> Aspirare il sopranatante senza disturbare il pellet, e poi risospendere le cellule in 2 ml di mezzi freschi completo pipettando delicatamente la soluzione con una pipetta P1000. </li><li> Determinare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi risospendere le cellule in terreno completo alla densità desiderata (ad esempio 10 5 cellule / ml). Piastra le cellule sui vetrini ECM rivestite (ad esempio 500 ml in ciascun pozzetto della piastra da 24 pozzetti). Aggiungere ulteriori mezzi freschi completi a ciascun pozzetto per 3-5 giorni di incubazione a 37 ° C, o fino a quando le cellule crescono alla confluenza visivo desiderato. </li></ol></li><li> Il trattamento con psicosina. <ol><li> Ricostituire il psicosina ad una concentrazione magazzino (108,3 mm) in dimetilsolfossido (DMSO). Diluire questo stock in 100% EtOH per fare una scorta di lavoro che può lan essere aggiunti in ogni pozzetto della piastra da 24 pozzetti per ottenere una concentrazione finale di 10 mM. </li><li> Al momento di aggiungere il psicosina, agitare delicatamente la piastra di coltura per mescolare il psicosina nella cultura dei media. Supplemento alla psicosina aggiungendo l&#39;equivalente di 10 micron ogni altro giorno per una settimana. </li></ol></li><li> Dopo 7 giorni di trattamento psicosina, raccogliere i media e pipetta 500 ml di freddo 4% paraformaldeide (PFA) in ogni pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 20 min per fissare le cellule. Poi, lavare i pozzetti 3 volte con PBS e poi tenere le piastre a 4 ° C fino a quando trattati per immunoistochimica (vedi sotto). NOTA: cellule di coltura possono essere raccolti per enzimatici o test ELISA a questo punto se lo si desidera. </li></ol> 3. immunocitochimica (ICC) per visualizzare le cellule Globoid <ol><li> Sostituire PBS con tampone di bloccaggio [+ 0,3% Tween-20 + 5% di siero di capra normale PBS (NGS)], e incubare le cellule per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubate le cellule fissate in antisieri primaria contro Iba-1 [(1: 1.000) diluita in PBS + 0.3% Tween-20 + 2% NGS] per almeno 1 ora a temperatura ambiente, poi lavare i pozzetti con PBS 3x 5 min / lavare. </li><li> Aggiungere l&#39;anticorpo coniugato fluorescenza secondaria opportuno identificare il primario etichettatura anticorpi e anti-macchia con 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1: 1.000) per identificare i nuclei. Incubare in soluzione anticorpo secondario per 1 ora a temperatura ambiente e lavata con PBS 3x 5 min. </li><li> Montare ogni coprioggetti al microscopio diapositive utilizzando un mezzo di montaggio. Lettura dei vetrini su un microscopio a fluorescenza per l&#39;analisi visive e quantitative. </li></ol> 4 Analisi e caratterizzazione di cellule in coltura primaria Globoid <ol><li> Utilizzare i seguenti tre criteri morfologici per identificare una cella globoidi nella cultura: <ol><li> Identificare le cellule globoidi usando la microscopia a fluorescenza, mediante l&#39;etichettatura immunopositive per il marcatore microglia, Iba-1 +. </li><li> Identificarecellule globoidi come polynucleated (cioè che contengono due o più nuclei positivi DAPI). </li><li> Identificare le cellule globoidi da una morfologia arrotondata distinto l&#39;aspetto altamente ramificata di riposo cellule microgliali. NOTA: Le cellule possono essere raccolte anche per la superficie cellulare marcatore analisi e quantificazione mediante citometria a flusso da queste culture. </li></ol></li><li> Misurare l&#39;attivazione fagocitaria della microglia e cellule globoidi <ol><li> Per valutare l&#39;attività fagocitaria della microglia psicosina trattati, aggiungere perline di lattice FITC-etichettati ai pozzetti in accordo con le istruzioni del produttore. Aggiungi sfere di lattice fluorescente-coniugati 48 ore prima della fissazione con PFA. Fissare le cellule trattate con perline (come indicato nella sezione 2.4), e il processo di immunocitochimica (come descritto nella sezione 3). </li><li> Selezionare anticorpi secondari fluoroforo coniugato in modo che non si sovrappongano gli spettri di emissione a fluorescenza del fluoroforo etichettato perline. </li><li> Analyze i profili phagocytotic di Iba-1 + microglia di individuare le cellule che co-localizzano con le perline fluorescenza marcata. NOTA: psicosina attiverà microglia. Perline fagocitati saranno definiti nell&#39;ambito mononucleate e multinucleate Iba-1 + cellule in questa impostazione cultura. </li></ol></li></ol> 5. induzione di Globoid Le cellule ottenute da colture purificate microgliali NOTA: Un approccio alternativo per decifrare la segnalazione intercellulare tra astrociti e microglia è un altro vantaggio di questo vitro globoidi modello cellulare in. Purificazione di cellule microgliali primarie per replating o co-coltura può essere ottenuto mediante la loro proprietà aderenza minore nella cultura, come descritto nei passaggi seguenti (vedi Sezione 5.2). <ol><li> Raccogliere il supporto dalle confluenti colture gliali miste in tubo da 50 ml e mantenerla a 37 ° C in incubatore. </li><li> Isolamento microglia da primari Culture gliali miste.<ol><li> Dopo aver rimosso il supporto da un pallone T175 cultura gliali miste confluenti, aggiungere i media si stringono caldi [comprensivi di supporti completi + 25 mm 4-(2-idrossietil) -1 acido-piperazineethanesulfonic (HEPES) + bicarbonato di sodio 25 mM (Sigma)]. Agitare i flaconi per 3-4 ore in un agitatore orbitale a 100 rpm (37 ° C). Raccogliere i media di questi flaconi scosso in 50 ml provette coniche. NOTA: Questo supporto include la microglia meno aderente dai fiaschi. </li><li> Spin media a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in 2 ml di media-astrociti condizionata (raccolte nella fase 5.1). </li><li> Stabilire il numero di cellule acquisiti utilizzando un emocitometro e poi piastra le cellule microgliali su vetrini substrato rivestito (vedi sezione 2.1) per immunocitochimica, o piastra su piastre aderenza e Ultralow per la futura raccolta di cellule globoidi per co-coltura con altri tipi di cellule, come oligodendrociti (come described nella sezione seguente). NOTA: Una volta placcato la microglia può essere trattata con psicosina (10 mM) come descritto sopra (vedi sezione 2.3). </li></ol></li><li> Co-coltura con oligodendrociti primari per l&#39;analisi di citotossicità. NOTA: Collezione di psicosina trattati microglia dalle piastre di aderenza bassi per la successiva co-coltura su colture primarie di oligodendrociti, o cellule progenitrici degli oligodendrociti, può essere utilizzato per esaminare la funzione potenziale citotossico di queste cellule globoidi simili in vitro. <ol><li> Sviluppare colture di oligodendrociti primarie che utilizzano metodi stabiliti 18,20. Per ritirare la microglia psicosina trattati, pipettare delicatamente per staccare le cellule aderenti liberamente dal fondo dei pozzetti. Raccogliere le cellule, centrifugare a 300 xg per 10 minuti, e poi risospendere con attenzione nella differenziazione degli oligodendrociti dei media [composto Neurobasal supporti, L-glutammina (1x), B-27 supplemento (1x) e triiodotironina (T3, 10 ng / ml )]. </li><li> Contare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e poi seminare le microglia sulla cultura oligodendrociti a 1 x 10 5 cellule / ml, con un conseguente approssimativa 1: 2 microglia / rapporto oligodendrociti. Incubare come co-coltura per un massimo di 3 giorni. </li><li> Fissare le cellule per immunocitochimica (vedere paragrafo 2.4). Raccogliere coltura cellulare supporti per ELISA o analisi chimiche a seconda delle necessità. </li></ol></li></ol>

<ol>
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The authors declare no conflicts of interest.

Il protocollo qui descritto fornisce un nuovo modello di sistema in cui studiare lo sviluppo e la caratterizzazione funzionale di microglia attivate e cellule globoidi. Lavoro preliminare da Im et al. utilizzando una linea cellulare HEK293 ha fornito un modello per lo sviluppo del presente protocollo per lo studio della formazione delle cellule globoidi 21. E &#39;inoltre importante sottolineare che le cellule derivate globoidi nel modello differiscono dalle cellule globoidi native identificabili in ...

Leucodistrofia cellule Globoid (GLD), nota anche come malattia di Krabbe, è una malattia demielinizzante mortale derivante dalla perdita di funzione mutazioni nel galatocerebrosidase (GALC) gene 1. La forma più diffusa di GLD è la variante infantile, che è caratterizzata da esordio nella prima infanzia e caratterizzata da un decorso clinico aggressivo del motore e del declino cognitivo che porta alla morte prematura, spesso prima di cinque anni di 2,3 anni. Il test genetico viene utilizzato per verificare una diagnosi di GLD 4. Neuropatologia di GLD rivela demielinizzazione diffusa, atrofia neuronale, astrogliosis e la presenza di microglia gonfie multi-nucleate chiamato cellule globoidi 5-7. L&#39;identificazione delle cellule globoidi, spesso contenenti inclusioni tubulosi nel loro citoplasma, è stata una caratteristica distintiva della GLD negli ultimi 97 anni, anche se la specifica funzione di queste cellule cospicui è rimasta inafferrabile. Il coinvolgimento di non-myelnari glia (astrociti e microglia) nella patogenesi della GLD è stata a lungo considerata una risposta secondaria alla profonda demielinizzazione in questa malattia 8. È interessante notare che la prima descrizione di questa malattia, realizzato da Knud Krabbe nel 1916 5, la formazione riferito fagociti multinucleate contenenti lipidi detriti che sono stati chiamati &#39;Globoid cellule&#39; e sono una caratteristica di questa malattia. Cellule globoidi sono la caratteristica segno distintivo di GLD patologia, anche se il loro ruolo nella GLD è stata a lungo ignorata. È interessante notare che queste cellule sono tra i primi cambiamenti caratteristici CNS tessuto GLD. Questa mancanza di conoscenza può essere dovuto al presupposto che la formazione dei fagociti multinucleate, dette cellule giganti in altre malattie, sono tipicamente considerati come conseguenza della patologia piuttosto che una forza trainante patogeno iniziale 9. Pertanto, ci sono stati pochi studi che hanno valutato il meccanismo attraverso il whicellule globoidi ch sono formate da fagociti, soprattutto nel SNC di GLD. La procedura descritta in questo rapporto si concentra sull&#39;importanza della formazione delle cellule globoidi nel sistema nervoso centrale e la nostra precedente dimostrazione che psicosina indotta multinucleazione della microglia in vitro e queste cellule esposte livelli più elevati di attività fagocitaria. Coerentemente con queste osservazioni, globoidi cellule nel cervello twitcher spesso contengono residui PAS-positivo, suggerendo elevati livelli di attività fagocitaria. Globoidi cellule si trovano anche ad essere immunopositive di ferritina (un marcatore microglia) 10, KP-1 / CD68 (un marcatore monociti), e alcuni sono anche positivi per vimentina (una proteina intermedia filamento e marker di astrociti e microglia attivata) 11, HLA-dra (un recettore di superficie MHCII), e TNF-α 7, e Iba-1 (una proteina legante calcio-antagonista usato per identificare microglia) 12. Sulla base di questa collezione di marcatori, cellule globoidi provengono da microglia che si sviluppanoun fenotipo unico. Nonostante la loro unicità, la funzione e il contributo di GC a GLD patogenesi specifico è stato ampiamente trascurato. Cellule globoidi sono stati pensati per essere una conseguenza secondaria di demielinizzazione cronica. Tuttavia, studi precedenti che esaminano l&#39;associazione temporale delle cellule globoidi alla materia patologia bianco di GLD hanno identificato la presenza di cellule globoidi nel tardo embrionale ai primi periodi post-natale; tempi precedenti l&#39;apoptosi degli oligodendrociti e demielinizzazione conclamata 13. Così, la sequenza temporale di sviluppo della neuropatologia in GLD suggerisce che le cellule globoidi sono formate in anticipo di demielinizzazione in questa malattia 14. Ciò ha portato alla nostra ipotesi che la precoce formazione di cellule globoidi in GLD può rappresentare un evento patogeno che definisce piuttosto che una risposta reattiva secondaria a danno degli oligodendrociti 15. Inoltre, disregolazione delle attività di microglia in GLD è stato considerato un fattor limitando l&#39;efficacia a lungo termine di terapie con cellule staminali hematopeotic per il trattamento di questa malattia 16. Così, indagando le funzioni cellulari e regolazione della microglia e cellule globoidi, in risposta a psicosina dovrebbe fornire nuove intuizioni nella patogenesi della GLD. Fino a poco tempo, la mancanza di un modello appropriato in cui studiare la formazione delle cellule globoidi aveva limitato la comprensione della funzione e il contributo di queste cellule alla patologia di GLD preciso. In studi recenti, è stato stabilito che le cellule globoidi-come possono essere formati in risposta diretta a psicosina, una tossina lipidi patogeno che si accumula in GLD. Abbiamo scoperto che la microglia, ma non macrofagi, vengono attivati ​​e trasformati in cellule gliali globoidi in colture primarie in risposta a psicosina 15. Questa trasformazione in cellule globoidi è risultato essere mediata dalla proteasi extracellulare, metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 15. Più di recente, abbiamohanno esteso questi risultati e determinato che la microglia e cellule globoidi psicosina attivati ​​sviluppate in questo sistema modello in vitro sono potentemente tossico per gli oligodendrociti e le cellule progenitrici degli oligodendrociti. Quindi, se considerato nel contesto della GLD, la precoce accumulo di psicosina e la formazione di cellule globoidi prima di demielinizzazione sosterrebbe un ruolo primario ed eventualmente patogeni emergenti per microglia in questa malattia. Noi proponiamo che lo studio della formazione delle cellule globoidi rivelerà nuove informazioni sulla patogenesi della GLD che contribuiranno alla nostra comprensione di questa malattia. Inoltre, questo nuovo modello cellulare di GLD può fornire un nuovo formato da cui nuovi approcci terapeutici per affrontare i cambiamenti patologici in questa malattia potrebbero essere testati. Quindi, in questa relazione forniamo un protocollo dettagliato per lo sviluppo in vitro di cellule globoidi psicosina indotta da colture primarie di cellule gliali non-mielinizzanti.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="884">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:500px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing no cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td style="width:297px;">Life technologies</td>
			<td style="width:87px;">14175-095</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Neural Tissue Dissociation Kit</td>
			<td>Miltenyi</td>
			<td>130-092-628</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">40 uM cell-strainer</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>22363547</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hank&#8217;s balanced salt solution (HBSS) containing cations (Mg2+ and Ca2+).&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025-092</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dulbecco&#39;s modified eagle medium (DMEM)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>11995-065</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td>Atlanta Biologicals</td>
			<td>S11150</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>15070-063</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Laminin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2020</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Trypsin-EDTA solution</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>25299-056</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Psychosine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9256</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Science</td>
			<td>19208</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PCN5000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Iba-1</td>
			<td>WAKO</td>
			<td>019-19741</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor conjugated antisera</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Various</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mounting Media</td>
			<td>Southern Biotech</td>
			<td>OB100-01</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phagocytic Assay Kit</td>
			<td>Cayman Chemicals</td>
			<td>500290</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HEPES</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>BP310-500</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an in vitro model for the study of cellular pathophysiology in globoid cell leukodystrophy

La precisa funzione di microglia multi-nucleata, chiamate cellule globoidi, che sono unicamente abbondanti nel sistema nervoso centrale di leucodistrofia cellulare globoidi (GLD) è chiaro. Questo divario nella conoscenza è stato ostacolato dalla mancanza di un adeguato modello in vitro per lo studio. Qui, descriviamo un sistema di coltura gliale murino primario in cui il trattamento con risultati psicosina in multinucleazione della microglia che ricordano le caratteristiche cellule globoidi trovate in GLD. Con questo nuovo sistema, abbiamo definito le condizioni e le modalità di analisi per lo studio delle cellule globoidi. L&#39;uso potenziale di questo sistema modello è stato validato nel nostro studio precedente, che ha individuato un potenziale ruolo di metalloproteinasi della matrice (MMP) -3 in GLD. Questo nuovo sistema in vitro può essere un modello utile per studiare la formazione e funzione, ma anche il potenziale manipolazione terapeutica di queste cellule uniche.

Questo protocollo, come scritto, è prevista per circa 36 giorni per completare dall&#39;inizio alla fine (vedere Figura 1: Schema del flusso di lavoro sperimentale). E &#39;stata la nostra esperienza che lo sviluppo delle cellule globoidi-like &quot;in questo sistema di coltura primaria sia affidabile e riproducibile: la formazione di cellule multinucleate in risposta a psicosina è costantemente osservata con 7 giorni di trattamento. Colorazione immunocitochimica della mic...

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An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per lo Studio della Fisiopatologia Cellulare in Globoid Leucodistrofia cellulare

The precise function of multi-nucleated microglia, called globoid cells, that are uniquely abundant in the central nervous system of globoid cell ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

An In Vitro Model for the Study of Cellular Pathophysiology in Globoid Cell Leukodystrophy

7.8K Views.  University of Connecticut Health Center. Globoid cells are a defining pathological feature of Krabbe disease, a leukodystrophy currently lacking an effective long-term therapy. We have developed a cell culture model to study the innate biology and pathogenic potential of activated microglia and their transformation into globoid cells. 

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Experimental Models for Study of Retinal Pigment Epithelial Physiology and Pathophysiology

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium (hfRPE) cultures with morphological, physiological and genetic characteristics of native human RPE. These hfRPE cell cultures exhibit heavy pigmentation, and electron microscopy show extensive apical membrane microvilli. The junctional complexes were identified with immunofluorescence labeling of various tight junction proteins. Epithelial polarity and function of these easily reproducible primary cultures closely resemble previously studied mammalian models of native RPE, including human. These results were extended by the development of therapeutic interventions in several animal models of human eye disease. We have focused on strategies for the removal of abnormal fluid accumulation in the retina or subretinal space. The extracellular subretinal space separates the photoreceptor outer segments and the apical membrane of the RPE and is critical for maintenance of retinal attachments and a whole host of RPE/retina interactions.

We provide a reproducible method for culturing confluent monolayers of human fetal retinal pigment epithelial cells (hfRPE) cells that exhibit morphology, physiology, polarity, and protein and gene expression patterns of adult native tissue. This work has been extended to an animal model of several eye diseases.

Modelli sperimentali per lo Studio di Fisiologia dell&#39;epitelio pigmentato retinico e fisiopatologia

We have developed a cell culture procedure that can produce large quantities of confluent monolayers of primary human fetal retinal pigment epithelium ...

Ricerca

Neuroscienze

An Optic Nerve Crush Injury Murine Model to Study Retinal Ganglion Cell Survival

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible vision loss. Examples of such diseases in human include traumatic optic neuropathy and optic nerve degeneration in glaucoma. It is characterized by typical changes in the optic nerve head, progressive optic nerve degeneration, and loss of retinal ganglion cells, if uncontrolled, leading to vision loss and blindness.
The optic nerve crush (ONC) injury mouse model is an important experimental disease model for traumatic optic neuropathy, glaucoma, etc. In this model, the crush injury to the optic nerve leads to gradual retinal ganglion cells apoptosis. This disease model can be used to study the general processes and mechanisms of neuronal death and survival, which is essential for the development of therapeutic measures. In addition, pharmacological and molecular approaches can be used in this model to identify and test potential therapeutic reagents to treat different types of optic neuropathy.
Here, we provide a step by step demonstration of (I) Baseline retrograde labeling of retinal ganglion cells (RGCs) at day 1, (II) Optic nerve crush injury at day 4, (III) Harvest the retinae and analyze RGC survival at day 11, and (IV) Representative result.

This protocol shows how to retrogradely label retinal ganglion cells, and how to subsequently make an optic nerve crush injury in order to analyze retinal ganglion cell survival and apoptosis. It is an experimental disease model for different types of optic neuropathy, including glaucoma.

Una lesione del nervo ottico Modello Crush murini per studiare la sopravvivenza delle cellule gangliari della retina

Injury to the optic nerve can lead to axonal degeneration, followed by a gradual death of retinal ganglion cells (RGCs), which results in irreversible ...

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted area of the brain, neural stem cells proliferate and constantly generate neuroblasts that migrate tangentially in chains along the rostral migratory stream (RMS) to reach the olfactory bulb (OB). Once in the OB, neuroblasts switch to radial migration and then differentiate into mature neurons able to incorporate into the preexisting neuronal network. Proper neuroblast migration is a fundamental step in neurogenesis, ensuring the correct functional maturation of newborn neurons. Given the ability of SVZ-derived neuroblasts to target injured areas in the brain, investigating the intracellular mechanisms underlying their motility will not only enhance the understanding of neurogenesis but may also promote the development of neuroregenerative strategies.
This manuscript describes a detailed protocol for the transfection of primary rodent RMS postnatal neuroblasts and the analysis of their motility using a 3D in vitro migration assay recapitulating their mode of migration observed in vivo. Both rat and mouse neuroblasts can be quickly and efficiently transfected via nucleofection with either plasmid DNA, small hairpin (sh)RNA or short interfering (si)RNA oligos targeting genes of interest. To analyze migration, nucleofected cells are reaggregated in &#39;hanging drops&#39; and subsequently embedded in a three-dimensional matrix. Nucleofection per se does not significantly impair the migration of neuroblasts. Pharmacological treatment of nucleofected and reaggregated neuroblasts can also be performed to study the role of signaling pathways involved in neuroblast migration.

Nucleofection of Rodent Neuroblasts to Study Neuroblast Migration In vitro

Neuroblast migration is a crucial step in postnatal neurogenesis. The protocol described here can be used to investigate the role of candidate regulators of neuroblast migration by employing DNA/small hairpin RNA (shRNA) nucleofection and a 3D migration assay with neuroblasts isolated from the rodent postnatal rostral migratory stream.

Nucleofection di roditori neuroblasti per studiare neuroblasti migrazione<em&gt; In vitro</em

The subventricular zone (SVZ) located in the lateral wall of the lateral ventricles plays a fundamental role in adult neurogenesis. In this restricted ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipolazione genetica delle cerebellare granuli neuroni<em&gt; In Vitro</em&gt; E<em&gt; In Vivo</em&gt; Per studiare neuronale Morfologia e migrazione

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of the olfactory epithelium continuously give rise to new sensory neurons that extend their axons into the olfactory bulb, where they face the challenge to integrate into existing circuitry. Because of this particular feature, the olfactory system represents a unique opportunity to monitor axonal wiring and guidance, and to investigate synapse formation. Here we describe a procedure for in vivo labeling of sensory neurons and subsequent visualization of axons in the olfactory system of larvae of the amphibian Xenopus laevis. To stain sensory neurons in the olfactory organ we adopt the electroporation technique. In vivo electroporation is an established technique for delivering fluorophore-coupled dextrans or other macromolecules into living cells. Stained sensory neurons and their axonal processes can then be monitored in the living animal either using confocal laser-scanning or multiphoton microscopy. By reducing the number of labeled cells to few or single cells per animal, single axons can be tracked into the olfactory bulb and their morphological changes can be monitored over weeks by conducting series of in vivo time lapse imaging experiments. While the described protocol exemplifies the labeling and monitoring of olfactory sensory neurons, it can also be adopted to other cell types within the olfactory and other systems.

The Olfactory System as a Model to Study Axonal Growth Patterns and Morphology In Vivo

We describe a protocol for in vivo labeling of olfactory sensory neurons by electroporation and subsequent confocal laser-scanning or multiphoton microscopy to visualize neuronal morphology and its development over time.

Il sistema olfattivo come modello per studiare gli schemi di crescita assonale e Morfologia<em&gt; In Vivo</em

The olfactory system has the unusual capacity to generate new neurons throughout the lifetime of an organism. Olfactory stem cells in the basal portion of ...

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the study of nerve regeneration and myelination. The glial cells of the peripheral nervous system, Schwann cells (SC), are key facilitators of these processes; it is therefore crucial that the interactions of these cellular components are studied together. Direct contact between DRG neurons and glial cells provides additional stimuli sensed by specific membrane receptors, further improving the neuronal response. SC release growth factors and proteins in the culture medium, which enhance neuron survival and stimulate neurite sprouting and extension. However, SC require long proliferation time to be used for tissue engineering applications and the sacrifice of an healthy nerve for their sourcing. Adipose-derived stem cells (ASC) differentiated into SC phenotype are a valid alternative to SC for the set-up of a co-culture model with DRG neurons to study nerve regeneration. The present work presents a detailed and reproducible step-by-step protocol to harvest both DRG neurons and ASC from adult rats; to differentiate ASC towards a SC phenotype; and combines the two cell types in a direct co-culture system to investigate the interplay between neurons and SC in the peripheral nervous system. This tool has great potential in the optimization of tissue-engineered constructs for peripheral nerve repair.

Dorsal Root Ganglia Neurons and Differentiated Adipose-derived Stem Cells: An In Vitro Co-culture Model to Study Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) are structures containing the sensory neurons of the peripheral nervous system. When dissociated, they can be co-cultured with SC-like adipose-derived stem cells (ASC), providing a valuable model to study in vitro nerve regeneration and myelination, mimicking the in vivo environment at the injury site.

Gangli neuroni e cellule staminali derivate da tessuto adiposo differenziata: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Co-coltura modello per studiare Peripheral Nerve Regeneration

Dorsal root ganglia (DRG) neurons, located in the intervertebral foramina of the spinal column, can be used to create an in vitro system facilitating the ...

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These neurotropic cancer cells have a unique ability to migrate unidirectionally along nerves towards the central nervous system (CNS). The dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model is a three dimensional (3D) in vitro model frequently used for studying the interaction between neural stroma and cancer cells. In this model, mouse or human cancer cell lines are grown in ECM adjacent to preparations of freshly dissociated cultured DRG. In this article, the DRG isolation protocol from mice, and implantation in petri dishes for co-culturing with pancreatic cancer cells are demonstrated. Five days after implantation, the cancer cells made contact with the DRG neurites. Later, these cells formed bridgeheads to facilitate more extensive polarized, neurotropic migration of cancer cells.

In Vitro Modeling of Cancerous Neural Invasion: The Dorsal Root Ganglion Model

This video article shows the use of the dorsal root ganglia (DRG)/cancer cell model in pancreatic ductal adenocarcinoma.

In Vitro Modellazione di cancerose Neural Invasion: La dorsale della radice Ganglio Modello

One way that solid tumors disseminate is through neural invasion. This route is well-known in cancers of the head and neck, prostate, and pancreas. These ...

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly controlled formation and maintenance of complex neuronal networks are not completely understood thus far. The open questions concerning neurons in health and disease are diverse and reaching from understanding the basic development to investigating human related pathologies, e.g.,&#160;Alzheimer&#39;s disease and&#160;Schizophrenia. The most detailed analysis of neurons can be performed in vitro. However, neurons are demanding cells and need the additional support of astrocytes for their long-term survival. This cellular heterogeneity is in conflict with the aim to dissect the analysis of neurons and astrocytes. We present here a cell-culture assay that allows for the long-term cocultivation of pure primary neurons and astrocytes, which share the same chemically defined medium, while being physically separated. In this setup, the cultures survive for up to four weeks and the assay is suitable for a diversity of investigations concerning neuron-glia interaction.

The Indirect Neuron-astrocyte Coculture Assay: An In Vitro Set-up for the Detailed Investigation of Neuron-glia Interactions

This protocol describes the indirect neuron-astrocyte coculture for compartmentalized analysis of neuron-glia interactions.

La indiretto Neuron-astrociti co-coltura saggio: An<em&gt; In Vitro</em&gt; Set-up per l&#39;indagine dettagliata delle Interazioni neuroni-glia

Proper neuronal development and function is the prerequisite of the developing and the adult brain. However, the mechanisms underlying the highly ...

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, their distinct dendritic morphologies, their specific patterns of axonal connectivity, and their selective firing responses. The molecular and cellular mechanisms responsible for these aspects of differentiation during development are still poorly understood.
Here, we describe combined protocols for labeling and characterizing the structural connectivity and excitability of cortical neurons. Modification of the in utero electroporation (IUE) protocol allows the labeling of a sparse population of neurons. This, in turn, enables the identification and tracking of the dendrites and axons of individual neurons, the precise characterization of the laminar location of axonal projections, and morphometric analysis. IUE can also be used to investigate changes in the excitability of wild-type (WT) or genetically modified neurons by combining it with whole-cell recording from acute slices of electroporated brains. These two techniques contribute to a better understanding of the coupling of structural and functional connectivity and of the molecular mechanisms controlling neuronal diversity during development. These developmental processes have important implications on axonal wiring, the functional diversity of neurons, and the biology of cognitive disorders.

In Utero Electroporation Approaches to Study the Excitability of Neuronal Subpopulations and Single-cell Connectivity

This manuscript provides protocols that use in utero electroporation (IUE) to describe the structural connectivity of neurons at the single-cell level and the excitability of fluorescently labeled neurons. Histology is used to characterize dendritic and axonal projections. Whole-cell recording in acute slices is used to investigate excitability.

Elettroporazione in utero approcci per studiare l&#39;eccitabilità neuronale sottopopolazioni e connettività single-cell

The nervous system is composed of an enormous range of distinct neuronal types. These neuronal subpopulations are characterized by, among other features, ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

Aumento del tempo della risposta alla rete alla stimolazione delle colture cellulari neuronali sulle matrici di microelettrodi

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...