This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

معايرة نظام 1. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقطة انتشار وظيفة (PSF) المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع 10 ميكرولتر من 30 نانومتر حل حبة الفلورية (حوالي 5 ميكرومتر) في 90 ميكرولتر من الماء المقطر ثم يصوتن الحل لمدة 20 دقيقة. قطع مربع (1 سم × 1 سم) قطعة من هلام الاغاروز (3٪) والودائع 10 ميكرولتر من الحل في الجزء العلوي من هلام. إسقاط قطعة من هلام على الزجاج السفلي من 2 سم طبق بتري والضغط الانخفاض على الزجاج. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدوره على الإعداد الاستحواذ، ووضع العينة في حامل، تعيين التعرض الكاميرا وEMgain (100 ميللي ثانية و 1،000 المعلمات هي جيدة ولكن الأمثل وفقا للنظام) وانتظر الكاميرا ليبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط التعرض الكاميرا إلى 100 ميللي ثانية، وكاميرا EMgain إلى 1،000، ووضع إطار لاكتساب نقل، و 100 التكرار والسيارات حفظ الإعداد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام العدسة والتركيز الضوء المرسل على الحدود من هلام ومن ثم نقل إلى مركز الهدف من هلام، وضبط التركيز وستاغ الإجراء محاذاة الليزر (LAS في AF، اختر &#39;الإعداد TIRF &quot;واتبع الإجراء محاذاة السيارات). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العثور على مجال الرؤية مع وجود بقع معزولة واحدة، بدقة التركيز على الفور أكثر إشراقا (التي عادة ما يمثل الخرز مجموع المباراتين) كمرجع، والحصول على 100 لقطة وكرر الخطوة 5-6 مرات من أجل الحصول على العديد من المواقع احدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد سلسلة المكتسبة لبرنامج معالجة البيانات والمتوسط ​​مكدس في الوقت المناسب (الشكل 1A) وحدد حبة واحدة معزولة. رعاية لتحديد أصغر منها لتجنب المجاميع الجسيمات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب كثافة التوزيع المحددة (مثال واحد من الخرز الشخصي ويرد في الشكل 1B) مع وظيفة جاوس باستخدام الأمر &quot;gaussfit&quot; (في أدوات ICS-ماتلاب في المواد في Matlab). تحقق الخير من يصلح عن طريق فحص بقايا الحصول عليها (ويرد مثال الشخصي جاوس المجهزة مع مخلفات المقابلة طن الشكل 1B). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الكاميرا المعايرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشغيل الكاميرا وانتظر الكاميرا ليبرد. تعيين إعداد اقتناء كاميرا، (أي للكاميرا المستخدمة وضعناها التعرض إلى 0.5 ميللي ثانية، وكاميرا EMgain إلى 1،000، وطريقة اكتساب لاقتصاص الوضع، وحجم العائد على الاستثمار إلى 32 × 128، 10،000 التكرار) والبدء في الاستحواذ على الكاميرا الخلفية إشارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استحوذت الواردات سلسلة الإطار إلى برنامج معالجة البيانات. وتفقد حساب متوسط ​​كثافة في كل بكسل من أجل التحقق من أن الكاميرا الخلفية مسطحة تقريبا في المنطقة المحددة للرقاقة. في الوضع المحصولية، وإزالة أولا ومشاركة عدد قليل من خطوط أفقية (3 إلى 10 تبعا لحجم ROI) لكل إطار لعادة منحازة الكاميرا الخلفية في خطوط الحدود. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إنشاء رسم بياني للقيم (أيضا يعرف المستوى الرقمي، DL) في الصور المكتسبة المكدس (باستخدام الأمر &#39;اصمت &quot;في Matlab) ورسم لوغاريتممن الناتج التردد (باستخدام القيادة semilogy في Matlab). ويرد مثال على توزيع DL للكاميرا الخلفية في الشكل 2. ملاحظة: إذا كان يعمل الكاميرا بشكل جيد، سوف المؤامرة تظهر ذروة حوالي جاوس (لمحة مكافئ في نطاق سجل) يمثل توزيع القيم المرتبطة إلى الصفر الفوتون يعقبه الاضمحلال الأسي (خط مع ميل سلبي في نطاق سجل- ) الذي يمثل توزيع القيم المرتبطة إلى 1 الفوتون (الشكل 2). على وجه الخصوص، المركز والتباين وظيفة جاوس تمثل الكاميرا تعويض والخطأ، على التوالي، في حين ثابت الانحلال للجزء الأسي يمثل تقدير DL تعيين بواسطة الكاميرا إلى كل فوتون واحد. في Matlab استخدام قسم &quot;CalibrateCamera&quot; من سيناريو في المواد الداعمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر هذه العملية لجميع الكاميرا المحددة EMGain والربح. </li></ol></li></ol> 2. إعتبرإعداد خلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الليبوزومات اللازمة لدمج 36 الدهون، ويحل بشكل منفصل 1 ملغ من مخدر (1،2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphoethanolamine)، 1 ملغ من DOTAP (1،2-dioleoyl-3-trimethylammonium-البروبان)، و 1 ملغ من PPE-ATTO488 في 1 مل من الكلوروفورم. مزيج معا 0.5 مل من محلول مخدر، و 0.5 مل من محلول DOTAP، و 25 ميكرولتر من الحل PPE-ATTO488 والجافة في ظل فراغ لمدة 24 ساعة. إضافة 0.5 مل من HEPES عازلة 20 ملي، دوامة لمدة 15 دقيقة ويصوتن لمدة 15 دقيقة عند 40 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإعداد الخلية، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني طبق P100 من متكدسة CHO-K1 (الصينية الهامستر المبيض)، إضافة 1 مل من التربسين وتخزينها في الحاضنة لمدة 5 دقائق. تعليق خلايا منفصلة مضيفا 9 مل من DMEM / F12 المتوسطة تستكمل مع 10٪ من FBS والبذور 150 ميكرولتر من الحل خلية في طبق بتري تحتوي على 800 ميكرولتر من نفس المتوسطة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متجر في الحاضنة لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. لإدراجها الدهون، تحل محل الخلايا المتوسطة مع 500ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة. بعد 30 دقيقة، إضافة 2 ميكرولتر من الجسيمات الشحمية حلا؛ بعد 15 دقيقة يغسل مع الحزب الاشتراكى البرازيلى وإضافة جديدة المتوسطة DMEM / F12 للتصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لترنسفكأيشن، وخلايا بالنقل وفقا لبروتوكول Lipofectamine (تعليمات الشركة المصنعة) باستخدام معدل الخصوبة الاجمالي-GFP البلازميد ومخزن 24 ساعة في حاضنة قبل التصوير. </li></ol> 3. الحصول على البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الإعداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل ترموستات المجهر، 24 ساعة قبل التجربة بدوره على الحاضنة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> من أجل تطبيق اكتساب الوقت الأسرع للتحقيق، والعمل في اقتصاص الاستشعار وضع (انظر المقدمة) واستخدام كاميرا الأولى للتصوير (كاميرا 1) والكاميرا الثانية لتحديد الخلية (كاميرا 2). ويرد مخطط التكوين في الإعداد التكميلية الشكل S1. ثم، لتحقيق المواءمة بين اثنين من الكاميرات بدوره على المجهر وانتظر الكاميرات ليبرد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعيين على كل من الكاميرات المعلمات للتصوير الضوء المرسل (أي </em&gt; 20 ميللي ثانية للوقت التعرض، 1 لEM أرباح) ووضع المجهر في وضع مشرق الميدان. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع العينات في حامل والتركيز باستخدام العدسة، وإرسال ضوء إلى الكاميرا 1 وبلطف دفع الشقوق السماح الضوء فقط على العائد على الاستثمار المستخدمة في التصوير الخلية (هنا 32 × 32 بكسل ROI). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الخلايا في المنطقة المحددة وإرسال ضوء إلى الكاميرا 2، ثم رسم العائد على الاستثمار في البرمجيات التي تتحكم الكاميرا 2 من أجل أن يكون مرجعا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير (الشكل 3A) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أولا وقبل كل شيء، محاذاة الليزر TIRF وفقا لإجراءات الإعداد. في الإعداد لدينا، وحدد &quot;الإعداد TIRF&quot; والبدء في إجراء محاذاة السيارات. عندما يتم محاذاة الليزر ضبط 70 نانومتر من عمق الاختراق (حوالي 70 درجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضبط الوقت التعرض ل70 ميللي ثانية وEMGain إلى 100 على كل كاميرا وكاميرا 2 1. ثم، حدد خلية باستخدام كاميرا 1، ثم ترسل الضوء على كاميرا بدقة 2 والتركيز على غشاء الخلية. تحديد الحد الأدنى للتعرض على كاليفورنياميرا 2، 1،000 EMGain، اقتصاص الاستشعار الوضع، 10 5 التكرار ووضع الحفظ التلقائي كما يناسب الملفات (صورة مرنة نظام النقل، وهو الشكل الذي يمكن بسهولة إدارتها). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بدء عملية الاستحواذ لتسجيل سلسلة الصورة. الافراج عن الربح والوضع اقتصاص للسماح تثبيت درجة الحرارة قبل الحصول خلية جديدة، ثم كرر الخطوات الماضيين من أجل الحصول على 8-10 الخلايا. </li></ol></li></ol> 4. احتساب متوسط ​​ميدان المهجرين من التصوير (ط MSD) ملاحظة: بروتوكول التالية يمكن تطبيقها مباشرة على البيانات الخام. في نفس الوقت، وبروتوكول كله صالحا لعمليات استحواذ بيانات محاكاة سواء في ماتلاب وSimFCS. الارتباط إلى الدروس المقابلة يمكن العثور عليها في قسم &quot;المواد&quot;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحساب بواسطة ماتلاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استيراد سلسلة المكتسبة إلى ماتلاب باستخدام ImportImageSeries النصي. حساب متوسط ​​كثافة كل صورة في الوقت المناسب باستخدام المشاركmmand يعني على الأبعاد الأولى 2 واستخدام مؤامرة لرؤية ناقلات الناتجة عن ذلك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أكثر من 10٪ من photobleaching من هو الحاضر، تجاهل سلسلة أو إزالة الجزء الأول منها. إذا كان أقل، في محاولة لتصحيح تأثير على وظيفة ارتباط بطرح كل صورة إلى متوسط ​​شدته، كما هو مبين قبل 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب متوسط ​​كثافة كل بيكسل باستخدام الوسط على البعد الثالث، وانظر الصورة الناتجة. مطلوب اهتمام خاص من أجل تجنب الارتباطات مصطنعة: ملاحظة. في الواقع، كما هو موضح سابقا لتقنيات مشابهة 38، حدود الخلية وكذلك من الحويصلات التركيز يمكن أن يعرض ارتباط قوي. إذا كان التفتيش من الصورة متوسط ​​يكشف حدود الخلية أو من الحويصلات التركيز، في محاولة لاستبعاد المنطقة المعنية خلاف ذلك تجاهل عملية الاستحواذ. لتصحيح تأثير هذه الهياكل متحركة طرح متوسط ​​كثافة الزمنية من كل بكسل 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب ركان الارتباط الزماني المكاني (G (ξ، χ، τ)) باستخدام الدالة CalculateSTICScorrfunc. إزالة G (ξ، χ، 0) لأن ارتباط بسبب الضوضاء بالرصاص في نظام الإضاءة المنخفضة يهيمن G (0،0،0). العلاقة بسبب كاشف يهيمن على G (± 1،0،0)، وحركة الجسيمات خلال فترة التعرض يمكن أن تشوه G (ξ، χ، τ) لτ = 0 عن طريق زيادة قياس الخصر (هذا التأثير يختفي لτ &gt; 0) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متوسط ​​G (ξ، χ، τ&gt; 0) استخدام لمرة وبن لوغاريتمي للحد من الضوضاء باستخدام وظيفة &quot;LogBinStack&quot; في دعم المواد ومن ثم تناسب الناتجة G (ξ، χ، τ) باستخدام وظيفة &quot;gaussfit&quot; ل أدوات ICS-ماتلاب في المواد لاسترداد ط MSD (العمود الثاني من المصفوفة الناتجة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رسم σ الحصول الخصر (τ) 2 (ط MSD) بوصفها وظيفة من الزمن. إذا كانت البيانات صاخبة جدا، في محاولة لزيادة عدد acquإطارات IRED، وزيادة قوة الليزر، متوسط ​​أكثر G (ξ، χ، τ) معا. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحساب بواسطة SimFCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح ملفات المكتسبة مع يماغيج باستخدام BioFormat المستورد البرنامج المساعد وحفظ سلسلة المكتسبة وتسلسل المشاجرة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح أداة SimFCS وحدد RICS وحدد ملف&gt; استيراد صور متعددة (التكميلي الشكل S2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر صالح، أدخل المعلمات اقتناء الصحيحة وإغلاق النافذة مناسبا (التكميلي الشكل S3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر عرض&gt; متوسط ​​الكثافة&gt; CH1 والتحقق من وجود photobleaching من (التكميلي الشكل S4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا كان أكثر من 10٪ من photobleaching من هو تجاهل الحاضر سلسلة أو إذا كان من الممكن الحمل مرة أخرى في تسلسل الصور إزالة الجزء الأول من هذه السلسلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إذا تبيض هو أقل من 10٪ اختر الأدوات&gt; ط MSD&gt; تعيين المعلمات، والتحقق من &quot;استخدام المتوسط ​​المتحرك&quot;، تعيين في لوحة دوروا على اليسار وبني مصفر من إطار للمتوسط ​​المتحرك الاهتمام أن الوقت مراسل أعلى من وقت الانتشار المميز (لالجسيمات تتحرك في 1 ميكرون 2 ثانية -1 زمن 10 ثانية هو المتوسط ​​المتحرك جيدا) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اختر الأدوات&gt; iMSD&gt; احسب ط MSD (الشكل التكميلي S5) ومناسبا وتصدير ط MSD من مذكرة منصة (الشكل التكميلي S6). </li></ol></li></ol> 5. حساب القانون الانتشار من ط MSD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تناسب النقاط القليلة الأولى لاستقراء اعتراض (σ 0 2) (5 نقاط وعادة ما تكون كافية ولكن المزيد من النقاط يمكن تركيبها إذا كانت تظهر سلوكا الخطي) ومقارنة هذه القيمة مع قوات الأمن الفلسطينية تقاس سابقا 2. إذا كانت قابلة للمقارنة، وتجري متابعة ديناميات fluorophores معزولة. على النقيض من ذلك، إذا σ 0 2 2 &gt;&gt; PSF محاولة لاكتساب أسرع لضمان أنديناميات لا مخبأة موجودة 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حساب انتشارية واضح (D التطبيق) وتشريد متوسط ​​(R) باستخدام المعادلات 3 و 4 (انظر المقدمة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مؤامرة D التطبيق بوصفها وظيفة من R للحصول على نشر القانون مقارنة مع ما يقاس مع اختلاف بقعة استنادا FCS 12 (الشكل 3D). </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

واحدة تتبع الجسيمات (SPT) يمثل واحدة من الاستراتيجيات الأكثر شيوعا لدراسة ديناميات الجزيئية ولها ميزة كبيرة لقياس مسارات الجسيمات. هذا بدوره يسمح يحقق في سلوك الجسيمات قليلة حتى وصفت في نظام معقد. ومع ذلك، للوصول إلى هذه الميزة SPT يحتاج عادة كثافة منخفضة من التحقيق ومل...

بدءا من النموذج الأصلي &quot;فسيفساء السائل&quot; حسب المغني ونيكلسون، وصورة من الغشاء البلازمي الخلوي قد تم تحديثه بشكل مستمر خلال العقود الماضية من أجل إدراج دور الناشئة في الهيكل الخلوي والدهون المجالات 1،2. تم الحصول على الملاحظات الأولى الانتعاش بعد photobleaching من الفلورسنت (FRAP) إزاحة الستار أن جزءا كبيرا من البروتينات الغشاء هو متحرك 3-5. هذه الدراسات الرائدة، على الرغم مفيدة للغاية، عانى من قرار فقيرة نسبيا في الفضاء (ميكرون) والزمن (ثانية) من الاجهزة FRAP. أيضا، ويجري قياس المتوسط ​​الفرقة، FRAP يفتقر في إعطاء معلومات عن سلوك جزيء واحد. في هذا السياق، وإمكانية لتسمية تحديدا جزيء واحد مع علامات مشرقة جدا (السماح دراسة عملية الانتشار جزيء في وقت واحد) كان ناجحا جدا. بشكل خاص، عن طريق دفعقرار وقت نهج احدة تتبع الجسيمات (SPT) إلى الجدول الزمني ميكروثانية، Kusumi، وآخرون. تمكنت من الوصول إلى ميزات لم تكن معروفة من الدهون والبروتين الديناميات التي أسهمت إلى حد كبير في التعرف على دور القائم على الأكتين هيكل عظمي في غشاء غشاء علم وظائف الأعضاء 6 7. ولدت هذه النتائج ما يسمى في &quot;اعتصام والسور &#39;النموذج، الذي ينظم الدهون والبروتين نشر بواسطة هيكل عظمي القائم الأكتين. ومع ذلك، من أجل الحصول على كمية هائلة من المعلومات التي قدمتها SPT العديد من القضايا التجريبية لا بد من معالجتها. خاصة، وعادة ما تتألف الإجراء وضع العلامات خطوات كثيرة مثل إنتاج وتنقية وإدخال الأنواع المسمى في النظام. وعلاوة على ذلك، والعلامات الكبيرة، مثل نقاط الكم أو الجسيمات النانوية المعدنية، وغالبا ما يطلب للوصول إلى الجدول الزمني ميلي ثانية واحدة فرعية ويشابك من الجزيئات المستهدفة من قبل التسمية لا يمكن تجنبها في كثير من الحالات. أخيرا، العديد من مساراتوقد ليتم تسجيلها لتناسب المعايير الإحصائية وبصورة متزامنة مطلوب كثافة منخفضة التسمية للسماح تتبع. مقارنة SPT، مضان الطيفي الارتباط (FCS)، والتغلب على كثير من هذه السلبيات، يمثل نهجا واعدا جدا لدراسة ديناميات الجزيئية. في الواقع، يعمل FCS جيدا أيضا مع تسميات قاتمة وكثيفة، مما يتيح لدراسة ديناميكية الجزيئات الموسومة بروتين فلوري في خلايا عابر. أيضا، فإنه يتيح الوصول إلى إحصاءات عالية في كمية محدودة من الزمن. وأخيرا، على الرغم من &quot;عالية&quot; كثافة العلامات يوفر معلومات FCS الجزيئات واحدة. بفضل كل هذه الخصائص، FCS يمثل نهجا واضحة جدا وطبقت على نطاق واسع لدراسة الدهون والبروتين ديناميكية في كل من الأغشية ونموذج في الخلايا الحية 8-10. لقد تم اقتراح العديد من الطرق المختلفة لزيادة قدرة FCS للكشف عن تفاصيل الانتشار الجزيئي. على سبيل المثال، كان SHالخاصة التي عن طريق أداء FCS على مختلف المناطق الملاحظة الحجم يمكن لأحد أن تعريف &quot;القانون نشر FCS&quot; ملامح المنير الخفية للحركة الجزيئات 11،12. إضافة إلى كونه تختلف في الحجم، وقد تتكرر مجال التركيز أيضا 13، وانتقل في الفضاء على طول خطوط 14-20 أو مترافق مع الكاميرات سريعة 21،22. باستخدام هذه العلاقة &quot;المكانية والزمانية&quot; النهج، وقد وصفت المعلمات البيولوجية ذات الصلة من عدة مكونات غشاء كميا على كل الأغشية البيولوجية نموذج ومنها الفعلية، وبالتالي البصيرة ذات العوائد إلى غشاء التنظيم المكاني. ومع ذلك، في كل FRAP والتطبيقات FCS وصفها حتى الآن حجم المنطقة المحورية يمثل الحد في القرار المكانية التي لا يمكن التغلب عليها. وقد وضعت عدة طرق التصوير فائقة الدقة مؤخرا لتجاوز هذا الحد. وتقوم بعض على دقة الترجمة، مثل إعادة الإعمار العشوائية المجهر الضوئي (STORM) &lt;سوب&gt; 23،24، تنشيط ضوئي توطين المجهري (النخيل) 25، PALM مضان (FPALM) 26، واحد الجسيمات تتبع PALM (sptPALM) 27: على كمية كبيرة نسبيا من الفوتونات المطلوبة في كل لقطة، ومع ذلك، يحد القرار وقت هذه الأساليب لعدة ميلي ثانية على الأقل، مما يعيق إمكانية تطبيقها في الجسم الحي. في المقابل، تم فتح بديلا واعدا للقرار التصوير الفاخر وتحوير مكانيا انبعاث مضان مع طرق استنزاف الانبعاث المستحث (STED أو عكسها تشبع التحولات مضان البصرية (RESOLFT)) 28،29. الجمع بين هذه النهج في تشكيل حجم الملاحظة أقل بكثير من الحد حيود مع إمكانية استخدام المجاهر المسح السريع وأنظمة الكشف. في تركيبة مع تحليل مضان التذبذب، STED المجهري يسمح للتحقيق مباشرة ديناميات الزمانية المكانية النانو من الدهون وصroteins في أغشية الخلايا الحية 30،31. ويمكن الحصول على نفس الكميات الفيزيائية المجهر مقرها STED من قبل معدلة المكانية والزمانية صورة ارتباط التحليل الطيفي (عصي 32،33) الطريقة التي هي مناسبة لدراسة ديناميات بروتينات fluorescently الموسومة الغشاء و / أو الدهون في الخلايا الحية وبواسطة المجهر التجاري. ويتكون البروتوكول التجريبي المقدمة هنا خطوات قليلة. أول واحد يتطلب التصوير السريع من منطقة الفائدة على الغشاء. ثم، يتم استخدام كومة الناتجة من الصور لحساب متوسط ​​ظائف علاقة المكانية والزمانية. عن طريق تركيب سلسلة من المهام ارتباط والجزيئي &quot;القانون نشر&quot; يمكن الحصول عليها مباشرة من التصوير في شكل واضح انتشارية (D التطبيق) - مقابل متوسط ​​درجات مؤامرة التهجير. هذه المؤامرة يعتمد بشكل حاسم على البيئة استكشافها من قبل الجزيئات ويسمح تدرك مباشرة وسائط نشر الفعليةمن الدهون / البروتين من الفائدة. في مزيد من التفاصيل، كما هو موضح سابقا 34 وظيفة لصناعة السيارات في العلاقة المكانية والزمانية من سلسلة صورة المكتسبة يعتمد بشكل حاسم على ديناميكية الجزيئات تتحرك في صورة سلسلة جمعها (يرجى ملاحظة أن نفس المنطق يمكن تطبيقه في اقتناء خط حيث يعتبر البعد واحد فقط في الفضاء). على وجه الخصوص، نحدد وظيفة العلاقة على النحو التالي: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) أين <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> يمثل قياس كثافة مضان في موقف X، Y و في الزمن t، <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> و <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> يمثل المسافة في x والاتجاهات ذ التوالي، <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> يمثل تأخر الوقت، و <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> يمثل المعدل. هذه الوظيفة يمكن التعبير عنها على النحو التالي: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) حيث يمثل &#39;N&#39; متوسط ​​عدد الجزيئات في مجال المراقبة، <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> تمثل عملية الالتواء في الفضاء، و <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> يمثل الارتباط الذاتي من الخصر فعال. هذا الأخير يمكن أن تفسر على أنها مقياس لمدى تنتشر الفوتونات من باعث واحد في الفضاء بسبب البصرية / تسجيل الإعداد (ما يسمى انتشار نقطة وظيفة، قوات الأمن الفلسطينية، الجينيحشد يقترب بشكل جيد من قبل وظيفة جاوس). أخيرا، <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> يمثل احتمال لإيجاد الجسيمات على مسافة <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> و <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> بعد فترة زمنية <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . إذا اعتبرنا ديناميكية ناشر، والتي تتحرك الجزيئات بشكل عشوائي في جميع الاتجاهات وصافي التدفقات ليست موجودة، وهذه الوظيفة أيضا يقترب بشكل جيد من قبل وظيفة جاوس حيث يمكن تحديد التباين مثل متوسط ​​ميدان الإزاحة (MSD) للجسيمات تتحرك . وهكذا، فإن الخصر وظيفة ارتباط (ويشار أيضا <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> )، يمكن تعريفها بأنها مجموع الجسيمات المشاكل العضلية الهيكلية والخصر فعال ويمكن قياس نوبة جاوستينغ وظيفة ارتباط لكل تأخير الوقت. ويقاس ط MSD يمكن استخدامها لحساب انتشارية واضح من الجزيئات تتحرك <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> والتشريد متوسط <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> على النحو التالي: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) بعض الاعتبارات على الإعداد التجريبية المستخدمة يمكن أن توجه القارئ طوال الأقسام التالية. من أجل إثارة انتقائي fluorophores على الغشاء القاعدي الخلايا سوف نستخدم مجموع التأمل الداخلي (TIR) ​​إضاءة الحية، باستخدام TIR التجاري مضان (TIRF) المجهر (التفاصيل يمكن العثور عليها في قسم المواد). وعلاوة على ذلك، من أجل جمع عشرالبريد مضان سوف نستخدم هدف تضخم عالية (100X NA 1.47، مطلوب الفتحة العددية العالية للإضاءة TIRF) وكاميرا EMCCD (الحجم الفعلي للبكسل على ميكرون رقاقة 16). ليصل إلى حجم بكسل من 100 نانومتر نطبق عدسة التكبير إضافية من 1.6X. كما هو مبين أدناه، ستكون هناك حاجة إلى حل وقت أقل من 1 مللي ثانية لوصف صحيح ديناميات نسبة الدهون في غشاء بسرعة أقل من 100 نانومتر. من أجل الوصول إلى هذا القرار الزماني نحن بحاجة إلى تحديد المنطقة ذات الاهتمام (ROI) أصغر من شريحة كاملة من الكاميرا (512 x 512). في هذه الطريقة، فإن الكاميرا قراءة انخفاض عدد خطوط زيادة القرار الوقت. ومع ذلك، في هذا النظام قراءات الإطار الزمني سيكون محدودا من الوقت اللازم لتحويل الرسوم من التعرض لرقاقة قراءات على الكاميرا وعادة ما تكون في حدود 512 ميلي ثانية لX 512 بكسل EMCCD. للتغلب على هذا الحد، تكنولوجيا ناشئة تتيح تحويل خطوط العائد على الاستثمار فقط بدلا من الإطار كله، ثإيث انخفاض فعالية العملي لحجم رقاقة يتعرض (اقتصاص دعا الاستشعار الوضع في EMCCD لدينا). لهذا التكوين لتكون فعالة، يجب أن تغطي الشريحة خارج العائد على الاستثمار من قبل اثنين من الشقوق التي تقام في مسار بصري. ويمكن تحقيق ذلك بفضل هذا الإعداد قرار الوقت وصولا الى 10 -4 ثواني. يرجى ملاحظة، مع ذلك، أن هذا النهج يمكن أن يقترن مع العديد من الاجهزة التجريبية المختلفة، كما هو موضح في قسم &#39;نقاش&#39; و. وسوف تقدم دليلا على الأسلوب في الخلايا الحية، وذلك باستخدام كلا من ATTO488 المسمى 1-بالميتويل-2-هيدروكسي SN -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) ومتغير المسمى GFP من مستقبلات ترانسفيرين (GFP- معدل الخصوبة الإجمالي). في حالة ATTO488-PPE هذا النهج يمكن استرداد بنجاح D التطبيق المستمر تقريبا بوصفها وظيفة من النزوح متوسط ​​يدل على نشر معظمها مجانا، كما ذكرت سابقا 30،35. على النقيض من ذلك، يظهر معدل الخصوبة الإجمالي GFP-D لخفض <suب&gt; التطبيق بوصفها وظيفة من متوسط ​​النزوح، مما يشير إلى انتشار تقتصر جزئيا-6. وعلاوة على ذلك، في الحالة الأخيرة فمن الممكن لتحديد ثابت الانتشار المحلي ومتوسط ​​مساحة الحبس على العديد من ميكرون على متن الطائرة الغشاء.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

أصبح من الواضح بشكل متزايد أن التوزيع المكاني وحركة مكونات غشاء مثل الدهون والبروتينات هي عوامل أساسية في تنظيم العديد من الوظائف الخلوية. ولكن نظرا لديناميكية سريعة وهياكل صغيرة المعنية، مطلوب قرار المكانية والزمانية عالية جدا للقبض على السلوك الحقيقي من الجزيئات. هنا نقدم بروتوكول تجريبي لدراسة ديناميات البروتينات والدهون البلازما غشاء fluorescently المسمى في الخلايا الحية لقرار الزمانية المكانية عالية. والجدير بالذكر، لا يحتاج هذا النهج لتتبع كل جزيء، لكنه يحسب سلوك السكان الذين يستخدمون جميع الجزيئات في منطقة معينة من الغشاء. نقطة البداية هي التصوير السريع في منطقة ما على غشاء. بعد ذلك، يتم احتساب المكانية والزمانية وظيفة كاملة الارتباط الذاتي ربط الصور المكتسبة في زيادة تأخير الوقت، على سبيل المثال كل 2، 3، ن التكرار. فمن الممكن إثبات أن العرضمن ذروة المكانية زيادات ظيفة الارتباط الذاتي في زيادة تأخير الوقت بوصفها وظيفة من حركة الجسيمات بسبب نشر. لذا، من المناسب من سلسلة من الوظائف تمكن الارتباط الذاتي لاستخراج البروتين الفعلي يعني تشريد مربع من التصوير (iMSD)، قدم هنا في شكل واضح انتشارية مقابل متوسط ​​النزوح. هذه تعطي الرأي الكمي من متوسط ​​ديناميكية الجزيئات واحدة مع دقة نانومتر. باستخدام متغير GFP الموسومة من مستقبلات ترانسفيرين (TFR) وATTO488 المسمى 1-بالميتويل-2-هيدروكسي SN -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) فمن الممكن لمراقبة تنظيم الزماني المكاني للبروتين والدهون نشر على المناطق غشاء ميكرون الحجم في نطاق الوقت الجزئي لملي ثانية.

من أجل معايرة الخصر فعال، يمكن للصورة واحدة الفلورسنت النانو حبة يكون الإجراء كما هو موضح في البروتوكول خطوة 1.1. تقدم صورة الفلورسنت نموذجية من هذه الخرز في الشكل 1، وتركيب توزيع كثافة بواسطة دالة جاوس 2D يعطي ظهره مخلفات جيدة ويسمح قياس الخصر دور فعال في 270 نا...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

من السريع إلى التصوير الإسفار الجزيئية قانون إنتشار على أغشية الخلايا الحية في المجهر التجاري

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Views.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Video: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

مضان التصوير عمر الدوار الجزيئية في الخلايا الحية

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

باستخدام رقائق الموائع الدقيقة للتصوير لايف ودراسة الردود الإصابات في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; يرقات

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

تقنية ميكروفلويديك للتحقيق التشوه خلية

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D تتبع المداري في التعديل المجهر ثنائي الفوتون: دراسة تطبيقية على تتبع من بين الخلايا الحويصلات

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

يعيش التصوير خلية خلال الإمتداد الميكانيكية

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

مضان الانتعاش بعد دمج قطرات لقياس انتشار ثنائي الأبعاد من الفوسفوليبيدية واحد رقائق

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

انتقائية القضاء خلية من الثقافة 3D المختلطة باستخدام تقنية الأشعة تحت الحمراء بالقرب من Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

إجراء وسائط تصوير متعددة مع واحد Fluorescence المجهر

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

نمو الإنسان والأغنام القرنية خلايا الخلايا الانبذيلية على الأغشية الحيوية

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

قياس إمكانات العمل البصري أحادي الخلية في خلايا القلب المشتقة من الخلايا الجذعية المتعددة القدرات

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...