This work is supported in part by NIH-P41 P41-RRO3155 and NIH P50-GM076516 (grant to EG), and Fondazione Monte dei Paschi di Siena (grant to FB).

כיול מערכת .1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פונקצית מורחים נקודת כיול (כוחות הביטחון הפלסטיניים) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 10 μl של 30 פתרון חרוז ניאון ננומטר (כ -5 מיקרומטר) ב90 μl של מים מזוקקים ולאחר מכן sonicate הפתרון עבור 20 דקות. חותך ריבוע (1 סנטימטר x 1 סנטימטר) חתיכת agarose ג&#39;ל (3%) והפיקדון 10 μl של הפתרון בחלק העליון של הג&#39;ל. להפוך את פיסת ג&#39;ל על הזכוכית התחתונה של 2 סנטימטר צלחת פטרי ולסחוט את הטיפה על הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את תוכנית ההתקנה של הרכישה, לשים המדגם בעל, להגדיר את חשיפת המצלמה וEMgain (100 אלפיות שניים ו -1,000 הם פרמטרים טובים, אבל לייעל בהתאם למערכת) ולחכות למצלמה כדי להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשיפת מצלמה מוגדרת 100 אלפיות שני, EMgain מצלמה ל1,000, מצב רכישה למסגרת העברה, 100 חזרות ואוטומטיות לשמור את ההגדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בעינית ופוקוס אור מועבר על גבול ג&#39;ל ולאחר מכן להעביר את המטרה למרכז של ג&#39;ל, לשנות את הפוקוס וstart הליך יישור לייזר (בלאס AF, בחר &#39;התקנת TIRF&#39; ובצע את הליך היישור האוטומטי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את שדה הראייה עם כתמים מבודדים אחת, מדויק להתמקד בנקודה בהירה (כי בדרך כלל מייצג המצרפי חרוזים) כנקודת התייחסות, לרכוש 100 מסגרות ולחזור על השלב 5-6 פעמים כדי לרכוש כמה נקודות בודדות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הסדרה נרכשה לתכנית עיבוד נתונים וממוצע הערימה בזמן (איור 1 א) ובחר חרוז בודד אחד. תשמור על עצמך כדי לבחור את הקטן ביותר, כדי למנוע אגרגטים חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את התפוצה שנבחרה בעוצמה (דוגמא לפרופיל חרוזים בודד מוצגת באיור 1 ב &#39;) עם פונקצית גאוס באמצעות הפקודה &quot;gaussfit&quot; (בכלי ICS-Matlab בחומרים בMatlab). ודא טוב לנכון על ידי בדיקת השאריות שהושגו (דוגמא לפרופיל גאוס המצויד עם השאריות המקבילה מוצגת in איור 1 ב). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול מצלמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את המצלמה ולחכות למצלמה כדי להתקרר. הגדרת רכישת המצלמה להגדיר, (כלומר, למצלמה המשמשת לנו להגדיר את החשיפה ל0.5 אלפית שני, EMgain מצלמה ל1,000, מצב רכישה לקצוץ מצב, גודל ההחזר על ההשקעה ל32 x 128, 10,000 חזרות) ולהתחיל את רכישת רקע המצלמה אות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סדרת מסגרת היבוא שנרכש לתכנית עיבוד נתונים. לחשב ולבדוק את העצמה הממוצעת בכל פיקסל על מנת לוודא שהרקע המצלמה הוא כ שטוח באזור הנבחר של השבב. בקצוץ מצב, להסיר הראשון וכמה קווים אופקיים שעבר (3 עד 10 בהתאם לגודל של ROI) עבור כל מסגרת, כי רקע המצלמה בדרך כלל מוטה בקווי הגבול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור היסטוגרמה של הערכים (גם מוגדרת דיגיטלי רמה, DL) בתמונות שנרכשו ערימה (באמצעות &#39;היסטוריה&#39; הפקודה בMatlab) ואת העלילה הלוגריתםשל תוצאת תדר (באמצעות פקודת semilogy בMatlab). דוגמא להפצת DL לרקע מצלמה מוצגת באיור 2. הערה: אם המצלמה עובדת היטב, העלילה תציג שיא כ גאוס (פרופיל פרבולית ביומן בקנה מידה) המייצג את התפלגות ערכים הקשורים לאפס פוטון אחרי דעיכה מעריכית (קו עם שיפוע שלילי ביומן בקנה המידה ) שמייצג את התפלגות ערכים הקשורים לפוטון 1 (איור 2). בפרט, במרכז ואת השונות של פונקצית גאוס מייצגים את המצלמה לקזז וטעייה, בהתאמה, ואילו קבוע הדעיכה של חלק מעריכי מייצג הערכה של DL שהוקצה על ידי המצלמה לכל פוטון יחיד. בMatlab להשתמש בסעיף &quot;CalibrateCamera&quot; של סקריפט בתמיכה בחומרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על הפעולה עבור כל המצלמה שנבחרה EMGain ורווח. </li></ol></li></ol> .2 תוויתהכנת תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את יפוזומים הנדרשים לשילוב שומנים 36, לפזר בנפרד 1 מ&quot;ג של DOPE (1,2-dioleoyl- sn -glycero-3-phosphoethanolamine), 1 מ&quot;ג של DOTAP (1,2-dioleoyl-3-trimethylammonium-פרופאן), ו1 מ&quot;ג של PPE-ATTO488 ב 1 מ&quot;ל של כלורופורם. מערבבים יחד 0.5 מ&quot;ל של תמיסת DOPE, 0.5 מ&quot;ל של תמיסת DOTAP, ו25 μl של פתרון PPE-ATTO488 ויבש תחת ואקום ל24 שעות. הוסף 0.5 מ&quot;ל של HEPES חיץ 20 מ&quot;מ, מערבולת במשך 15 דקות וsonicate ל15 דקות ב 40 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להכין את התא, לשטוף 3 פעמים עם PBS צלחת P100 של המחוברות CHO-K1 (סינית שחלות), להוסיף 1 מ&quot;ל של טריפסין וחנות בחממה במשך 5 דקות. להשעות תאים מנותקים הוספת 9 מ&quot;ל של מדיום DMEM / F12 בתוספת 10% מFBS וזרע 150 μl של פתרון תא בצלחת פטרי המכילה 800 μl של אותו המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות בחממה ל24 שעות ב37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2. עבור התאגדות שומנים, להחליף תאים בינוניים עם 500μl של מדיום סרום ללא; לאחר 30 דקות, להוסיף 2 μl של פתרון ליפוזומים; לאחר 15 לשטוף דקות עם PSB ולהוסיף בינוני DMEM / F12 חדש להדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לTransfection, תאי transfect על פי פרוטוקול Lipofectamine (הוראות יצרן) באמצעות פלסמיד TFR-GFP וחנות hr 24 בחממה לפני ההדמיה. </li></ol> .3 Data Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תוכנית ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי טרמוסטט מיקרוסקופ, 24 שעות לפני הניסוי להפעיל את החממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להחיל את זמן רכישת השגה המהירה ביותר, עבודה בחיישן קצוץ מצב (ראה מבוא) ולהשתמש במצלמה ראשונה להדמיה (מצלמה 1) ומצלמה שנייה כדי לבחור את התא (המצלמה 2). ערכה של הגדרת התצורה מוצגת במשלים איור S1. ואז, כדי ליישר את תור שתי מצלמות על המיקרוסקופ ולחכות למצלמות כדי להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר בשני מצלמות הפרמטרים להדמית אור מועברת (כלומר </em&gt;, 20 אלפיות שני לזמן חשיפה, 1 לEM רווח) ולשים את המיקרוסקופ במצב מואר שדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את הדגימות בבעל ולהתמקד באמצעות עינית, לשלוח האור למצלמה 1 ודחף בעדינות את החריצים המאפשרים אור היחיד בROI המשמש להדמית תא (כאן ROI 32 x 32 פיקסלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז תא באזור נבחר ולשלוח האור למצלמה 2, ולאחר מכן לצייר את ההחזר על ההשקעה בתוכנה ששולטות במצלמה 2 כדי שתהיה לי התייחסות. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדמיה (איור 3 א) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קודם כל, ליישר את לייזר TIRF בהתאם לנוהל של ההתקנה שלך. בהגדרה שלנו, לבחור את &quot;הגדרת TIRF &#39;ולהתחיל את הליך היישור האוטומטי. כאשר הלייזר מיושר להגדיר 70 ננומטר של עומק חדירה (כ -70 °). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר זמן חשיפה ל70 אלפית שניים וEMGain 100 משני המצלמה 1 והמצלמה 2; לאחר מכן, בחר תא באמצעות מצלמה 1, ולאחר מכן לשלוח את האור במצלמה 2 ובאופן מדויק להתמקד קרום התא. הגדר את החשיפה המינימלית על caMera 2, 1,000 EMGain, חיישן קצוץ מצב, 10 5 חזרות ושמירה אוטומטית מוגדרת כמתאימות קבצים (מערכת תחבורה תמונה גמישה, פורמט שיכול להיות בקלות הצליח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את הרכישה כדי להקליט את סדרת התמונה. שחרר את רווח והמצב הקצוץ, כדי לאפשר ייצוב טמפרטורה לפני הרכישה סלולארי חדש, ולאחר מכן לחזור על שני השלבים האחרונים במטרה לרכוש 8-10 תאים. </li></ol></li></ol> .4 חישוב הממוצע כיכר העקירה מהדמיה (i MSD) הערה: הפרוטוקול הבא יכול להיות מיושם ישירות לנתונים גולמיים. באותו הזמן, כל הפרוטוקול תקף לנתונים רכישות מדומה הן בMatlab ובSimFCS. ניתן למצוא הקישור להדרכות המתאימות בסעיף &#39;חומרי&#39;. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב על ידי Matlab <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייבא את הסדרה נרכשה לMatlab באמצעות ImportImageSeries תסריט. לחשב את העצמה הממוצעת של כל תמונה בזמן באמצעות שיתוףmmand אומר על 2 הממדים הראשונים ולהשתמש בעלילה כדי לראות את הווקטור וכתוצאה מכך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יותר מ10% מphotobleaching הוא הווה, לבטל את הסדרה או להסיר את חלקו הראשון שלהם. אם הוא נמוך, לנסות ולתקן את ההשפעה על תפקוד המתאם על ידי הפחתה לכל תמונה בעוצמה הממוצעת שלה, כפי שמוצג לפני 37. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את העצמה הממוצעת של כל פיקסל באמצעות ממוצע בממד השלישי ותראה את תוצאת תמונה. הערה: תשומת לב מיוחדת הנדרשת על מנת להימנע ממתאמי artifactual. למעשה, כפי שהוצג קודם לטכניקות דומות 38, גבולות תא, כמו גם משלפוחית ​​המוקד יכול להציג את המתאם חזק. אם הבדיקה של התמונה הממוצעת מגלה גבולות תא או החוצה של שלפוחית ​​מוקד, לנסות להוציא את האזור המעורב בדרך אחרת לבטל את הרכישה. כדי לתקן את ההשפעה של מבנים נייחים זה להחסיר את עוצמת הזמנית הממוצעת מכל פיקסל 39. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב tהוא מתאם spatiotemporal (G (ξ, χ, τ)) על ידי שימוש בפונקציה CalculateSTICScorrfunc. הסר G (ξ, χ, 0) כי המתאם בשל רעש הירייה במשטר התאורה נמוך שולט G (0,0,0); המתאם בשל הגלאי שולט G (± 1,0,0), ותנועת חלקיקים בזמן החשיפה יכול לעוות G (ξ, χ, τ) לτ = 0 על ידי הגדלת המותניים נמדדו (אפקט זה נעלם לτ &gt; 0) 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> G הממוצע (ξ, χ, τ&gt; 0), תוך שימוש בזמן bin לוגריתמים כדי להפחית את הרעש על ידי שימוש בפונקציה &quot;LogBinStack&quot; בתמיכה בחומר ולאחר מכן להתאים את G וכתוצאה מכך (ξ, χ, τ) &quot;gaussfit&quot; באמצעות הפונקציה של הכלים ICS-Matlab בחומרים להתאושש i MSD (העמודה השנייה של המערך וכתוצאה מכך). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העלילה σ הושג המותניים (τ) 2 (i MSD) כפונקציה של זמן. אם הנתונים הם רועשים מדי, תנסה להגדיל את מספר acquמסגרות ired, להגדיל את כוח הלייזר, ממוצע יותר G (ξ, χ, τ) יחד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב על ידי SimFCS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את הקבצים שנרכשו עם ImageJ באמצעות תוסף היבואן BioFormat ולשמור סדרה נרכשה כרצף Tiff. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כלי פתוח SimFCS ובחר RICS ובחר קובץ&gt; תמונות מרובות יבוא (S2 איור משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר Fit, להכניס את הפרמטרים לרכישה הנכונות ולסגור את החלון בכושר (S3 איור משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר תצוגה&gt; עוצמה ממוצעת&gt; CH1 ולוודא את נוכחותו של photobleaching (S4 איור משלים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם יותר מ10% מphotobleaching קיים קלפים שנזרקו הסדרה או אם זה עומס אפשרי שוב את התמונה ברצף הסרת החלק הראשון של הסדרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הלבנת זה בחר באפשרות כלים נמוך מ10%&gt; אני MSD&gt; הפרמטרים שנקבע, לבדוק &#39;השתמש בממוצע נע &quot;, שנקבע בפנל את ההחזר על ההשקעה בעזבהחום אדמדם של מסגרת לתשומת הלב משלם הממוצע נע שזמן הכתב הוא גבוה יותר מאשר בפעם דיפוזיה האופיינית (לחלקיקים הנעים בשניות 1 מיקרומטר 2 -1 זמן של 10 שניות הוא ממוצע נע טוב) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרו כלים&gt; iMSD&gt; חישוב i MSD (איור משלים S5) ובכושר ולייצא את i MSD מהפנקס (איור משלים S6). </li></ol></li></ol> .5 חישוב חוק דיפוזיה מi MSD <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתאים כמה נקודות הראשונות להסיק ליירט (σ 0 2) (5 נקודות הן בדרך כלל מספיק, אבל יכולות להיות מצוידות יותר נקודות אם הם מראים התנהגות ליניארית) ולהשוות את הערך הזה עם כוחות הביטחון הפלסטיניים שנמדדו בעבר 2. אם הם דומים, את הדינמיקה של fluorophores המבודד הם עוקבים אחריו. לעומת זאת, אם σ 0 2 &gt;&gt; כוחות הביטחון הפלסטיניים 2 לנסות לרכוש יותר מהר כדי להבטיח שדינמיקה לא מוסתר נמצאות 34. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב את diffusivity לכאורה (האפליקציה D) ועקירה הממוצעת (R) באמצעות משוואות 3 ו -4 (ראה מבוא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האפליקציה D עלילה כפונקציה של R כדי להשיג חוק דיפוזיה השוואה עם מה שנמדד עם וריאציה מקום FCS 12 (איור 3D) המבוססת. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

מעקב אחר חלקיקים בודדים (SPT) מייצג את אחת מהאסטרטגיות הנפוצות ביותר ללמוד דינמיקה מולקולרית ויש לו את היתרון הגדול של מדידת מסלולי חלקיקים. זה בתורו מאפשר חיטוט ההתנהגות של כמה אפילו חלקיקים שכותרתו במערכת מורכבת. עם זאת, כדי להגיע ליתרון זה SPT בדרך כלל זקוק לצפיפות נמ...

החל מהמודל המקורי &quot;פסיפס נוזל&quot; על ידי זינגר וניקולסון, התמונה של קרום פלזמה סלולארי כבר מעודכנת באופן רציף במהלך העשורים האחרונים על מנת לכלול את התפקיד המתפתח של תחומים שלד תא ושומנים בדם 1,2. התצפיות הראשונות התקבלו על ידי שחזור ניאון לאחר photobleaching הסרת לוט (FRAP) שחלק ניכר של חלבונים בממברנה הוא נייח 3-5. מחקריו החלוציים הללו, למרות שמאוד אינפורמטיבי, סבלו מעניה יחסית ברזולוציה במרחב (מיקרון) וזמן (שניות) של מערכי FRAP. כמו כן, להיות מדידת מיצוע הרכב, FRAP חסר במתן מידע על מולקולה בודדת התנהגות. בהקשר זה, את האפשרות לתייג מולקולה בודדת עם תגים בהירים מאוד (המאפשרים מחקר של המולקולה אחת תהליך דיפוזיה בכל פעם) במיוחד היה מוצלח מאוד. במיוחד, על ידי לחיצה עלרזולוציה של הגישה יחידה חלקיקים מעקב (SPT) ללוח הזמנים מיקרו, Kusumi, et גישה צברה אל. לתכונות ידועות של דינמיקת שומנים וחלבונים שתרמו רב להכרה בתפקידו של שלד קרום מבוסס אקטין בפיזיולוגיה קרום 6 זמן , 7. ממצאים אלה שנוצרו מה שנקרא &#39;כלונסאות וגדר&#39; מודל, שבו דיפוזיה שומנים והחלבונים מוסדרת על ידי שלד מבוסס אקטין. עם זאת, על מנת לקבל גישה לכמות העצומה של מידע המסופק על ידי נושאים רבים ניסיוניים SPT יש לטפל. במיוחד, הליך התיוג מורכב בדרך כלל על ידי צעדים רבים כמו ייצור, טיהור והכנסה של המינים שכותרתו לתוך המערכת. יתר על כן, חברות תקליטים גדולות, כמו נקודות קוונטיות או חלקיקי מתכת, נדרשות לעתים קרובות כדי להגיע ללוח זמנים משנה אלפית השנייה וcrosslinking של מולקולות המטרה על ידי התווית לא ניתן היה להימנע במקרים רבים. לבסוף, מסלולים רביםיש שיירשם כדי שיתאים לקריטריונים סטטיסטיים ובו זמנית בצפיפות נמוכה של התווית נדרש כדי לאפשר מעקב. בהשוואה לSPT, ספקטרוסקופיה מתאם הקרינה (FCS), להתגבר על רבים מחסרונות אלה, מייצגת גישה מאוד מבטיחה ללמוד דינמיקה מולקולרית. למעשה, FCS עובד היטב גם עם תוויות עמומות וצפופות, מה שמאפשר ללמוד את הדינמיקה של מולקולות מתויג חלבון פלואורסצנטי בתאי transfected הזמני. כמו כן, זה מאפשר להגיע לסטטיסטיקה גבוהה בכמות מוגבלת של זמן. לבסוף, למרות הצפיפות &quot;הגבוהה&quot; של תוויות FCS מספק מידע מולקולות בודדות. תודה לכל המאפיינים האלה, FCS מייצגת גישה מאוד פשוטה ויושם בהרחבה ללמוד דינמיקת שומנים וחלבונים הן בממברנות מודל ובשידור חיים תאים 8-10. גישות רבות ושונות הוצעו כדי להגביר את היכולת של FCS כדי לחשוף את הפרטים של דיפוזיה מולקולרית. לדוגמא, זה היה shשלו כי על ידי ביצוע FCS באזורי תצפית שונה בגודל אחד יכול להגדיר תכונות &quot;חוק דיפוזיה FCS&quot; מאיר עיניים מוסתרות של תנועה המולקולרית 11,12. חוץ מזה שהיה שונה בגודל, באזור המוקד היה גם משוכפל 13, עבר בחלל לאורך קווי 14-20 או מצומדות עם מצלמות מהירות 21,22. באמצעות המתאם &#39;מרחב ובזמן &quot;אלה גישות, פרמטרים ביולוגיים רלוונטיים של מספר מרכיבי קרום תוארו כמותית משני קרומי מודל ואלה ביולוגיים בפועל, ובכך תובנה מניבות לארגון המרחבי קרום. עם זאת, בכל FRAP ויישומי FCS שתואר עד כה בגודל של אזור המוקד מייצג מגבלה ברזולוציה מרחבית שלא ניתן להתגבר עליו. שיטות הדמיה ברזולוציה סופר כמה פותחו לאחרונה כדי לעקוף מגבלה זו. חלקם מבוססים על דיוק לוקליזציה, כגון מיקרוסקופיה אופטית סטוכסטיים שחזור (STORM) &lt;sup&gt; 23,24, מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivation (PALM) 25, PALM הקרינה (FPALM) 26, וPALM מעקב חלקיק יחיד (sptPALM) 27: הכמות הגדולה יחסית של פוטונים הנדרשים בכל תמונה, לעומת זאת, מגביל את הרזולוציה של הזמן שיטות אלה לפחות כמה אלפיות השניה, ובכך פוגעות תחולתם in vivo. בניגוד לכך, חלופה מבטיחה להדמיה ברזולוציה סופר נפתח על ידי מרחבית ויסות פליטת הקרינה עם שיטות מגורה דלדול פליטה (STED או מעברים הפיכים saturable אופטי הקרינה (RESOLFT)) 28,29. גישות אלה משלבים עיצוב תצפית הנפח נמוך בהרבה מהמגבלה העקיפה עם האפשרות להשתמש מיקרוסקופי סריקה מהירה ומערכות איתור. בשילוב עם ניתוח תנודות הקרינה, מיקרוסקופיה STED אפשרה לחקור ישירות את דינמיקת spatiotemporal ננומטריים של שומנים וproteins בקרום תא חי 30,31. ניתן להשיג את אותו כמויות הפיזיות של מיקרוסקופיה מבוססת STED ידי ספקטרוסקופיה הותאם מרחב ובזמן מתאם תמונה (STICS 32,33) שיטה שמתאימה ללימוד הדינמיקה של חלבוני fluorescently- מתויג קרום ו / או שומנים בתאים חיים ועל ידי מיקרוסקופ מסחרי. פרוטוקול הניסוי המובא כאן מורכב על ידי כמה צעדים. הראשון דורש הדמיה מהירה של האזור של עניין על הממברנה. לאחר מכן, הערימה של תמונות וכתוצאה מכך משמשת לחישוב פונקציות מתאם מרחב וזמן הממוצע. על ידי התאמת הסדרה של פונקציות מתאם, ניתן להשיג &quot;חוק דיפוזיה &#39;המולקולרי ישירות מהדמיה בצורה של diffusivity לכאורה (אפליקציה D) - לעומת עלילת עקירת -average. עלילה זו באופן ביקורתי תלויה בסביבה נבחנה על ידי המולקולות ומאפשרת הכרה ישירות מצבי דיפוזיה בפועלשל השומנים בדם / החלבון של עניין. בפרטים נוספים, כפי שמוצג 34 בעבר, פונקצית קורלציה אוטומטית מרחב ובזמן של סדרת תמונה שנרכשה באופן ביקורתי תלויה בדינמיקה של המולקולות נעות בסדרת התמונה שנאסף (יש לציין כי באותו ההיגיון ניתן להחיל ברכישת אונליין שבו רק ממד אחד בחלל נחשב). בפרט, אנו מגדירים את פונקצית המתאם הגבוהה ככל: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq1.jpg" width="230" /> (1) בי <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/xyt.jpg" width="50" /> מייצג את עוצמת הקרינה שנמדדה בx העמדה, y ובזמן t, <img fo:content-width=".08in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="8" /> ו <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> מייצג את המרחק בx וכיווני y בהתאמה, <img fo:content-width=".1in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> מייצג את פער הזמן, ו <img fo:content-width=".2in" src="/files/ftp_upload/51994/brackets.jpg" width="20" /> מייצג את הממוצע. פונקציה זו יכולה לבוא לידי ביטוי כמו: <img fo:content-width="2.3in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq2.jpg" width="230" /> (2) שבו &#39;N&#39; מייצגת את המספר הממוצע של מולקולות באזור התצפית, <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/circlex.jpg" width="10" /> מייצגת את פעולת פיתול בחלל, ו <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ex.jpg" width="50" /> מייצג את autocorrelation של המותניים אינסטרומנטלי. זה אחרון יכול להתפרש כמדד של כמה הפוטונים של פולט אחד פרושים במרחב בשל ההתקנה האופטית / הקלטה (פונקצית התפשטות הנקודה שנקרא, כוחות הביטחון הפלסטיניים, גןעצרת מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס). לבסוף, <img fo:content-width=".5in" src="/files/ftp_upload/51994/ext.jpg" width="50" /> מייצג את ההסתברות למצוא חלקיק במרחק <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/e.jpg" width="10" /> ו <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/x.jpg" width="10" /> לאחר השהיה <img fo:content-width=".10in" src="/files/ftp_upload/51994/t.jpg" width="10" /> . אם ניקח בחשבון את דינמיקת diffusive, שבו חלקיקים לנוע באופן אקראי לכל הכיוונים ונתיבים נטו אינם נוכחים, פונקציה זו גם מקורב היטב על ידי פונקצית גאוס בי השונות יכולות להיות מזוהות כממוצעת כיכר העקירה (MSD) של החלקיקים המרגשים . לפיכך, המותניים של פונקצית המתאם (המכונה גם כ <img fo:content-width=".3in" src="/files/ftp_upload/51994/2t.jpg" width="30" /> ), יכול להיות מוגדר כסכום של MSDS החלקיקים ומותני אינסטרומנטלי וניתן למדוד על ידי גאוס בכושרטינג של פונקצית המתאם עבור כל עיכוב זמן. אני MSD נמדד ניתן להשתמש כדי לחשב diffusivity לכאורה של המולקולות נעות <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/dappt.jpg" width="40" /> ועקירה ממוצעת <img fo:content-width=".4in" src="/files/ftp_upload/51994/rt.jpg" width="40" /> כ: <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq3.jpg" width="170" /> (3) <img fo:content-width="1.7in" src="/files/ftp_upload/51994/51994eq4.jpg" width="170" /> (4) שיקולים כמה בהגדרת הניסוי נעשה שימוש יכול להנחות את הקורא בכל הסעיפים הבאים. על מנת לרגש באופן סלקטיבי fluorophores על הקרום הבסיסי של תאי חיים נשתמש תאורה כוללת ההשתקפות פנימית (TIR), תוך שימוש בקרינת TIR מסחרי מיקרוסקופ (TIRF) (ניתן למצוא את פרטים בסעיף החומר). יתר על כן, על מנת לאסוף את ההקרינה דואר נשתמש מטרת הגדלה גבוהה (100x NA 1.47, צמצם מספרי גבוה נדרש לתאורת TIRF) ומצלמת EMCCD (גודל פיזי של פיקסל על מיקרומטר שבב 16). כדי להגיע לגודל פיקסל של 100 ננומטר אנחנו מיישמים עדשת הגדלה נוספת של 1.6x. כפי שנראה להלן, תידרש זמן ברזולוציה מתחת ל -1 msec כדי לתאר כראוי את הדינמיקה של שומני קרום מהירים להלן 100 ננומטר. על מנת להגיע לפתרון זמני זה אנחנו צריכים לבחור אזור של העניין (ROI) קטן יותר מכל השבב של המצלמה (512 x 512). בדרך זו, המצלמה תהיה לקרוא מספר מופחת של קווי הגדלת הרזולוציה הזמן. עם זאת, במשטר קריאה זו מסגרת הזמן יהיה מוגבל על ידי הזמן הנדרש כדי להעביר את החיובים מהחשיפה לשבב הקריאה על המצלמה והיא בדרך כלל בסדר הגודל של אלפיות שנייה לEMCCD 512 x 512 פיקסל. להכות מגבלה זו, טכנולוגיה מתפתחת מאפשרת הסטת ROI-הקווים רק במקום כל המסגרת, with הפחתה יעילה מעשית של הגודל נחשף שבב (הנקרא חיישן קצוץ מצב בEMCCD שלנו). לתצורה זו תהיה אפקטיבית, השבב מחוץ להחזר על ההשקעה חייב להיות מכוסה על ידי כמה חריצים רכובים בנתיב האופטי. הודות להתקנה זו רזולוציה זמן עד ל10 -4 שניות יכולים להיות מושגת. שים לב, עם זאת, כי גישה זו יכולה להיות בשילוב עם setups ניסיוני רב ושונה, כפי שהוסברה בסעיף &quot;הדיון&quot;. הפגנה של השיטה תסופק בתאים חיים, על ידי השימוש בשתי ATTO488 מסומן 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (ATTO488-PPE) וגרסה שכותרתו GFP של קולטן transferrin (GFP- TFR). במקרה של ATTO488-PPE גישה זו יכולה לשחזר בהצלחה יישום D כמעט קבוע כפונקציה של תזוזה ממוצעת המצביעה על דיפוזיה לרוב ללא תשלום, כפי שדווחה בעבר 30,35. בניגוד לכך, TFR-GFP תערוכות D יורד <suב יישום&gt; כפונקציה של תזוזה ממוצעת, המצביעה על דיפוזיה באופן חלקי-מוגבל 6. יתר על כן, במקרה האחרון זה אפשרי לכמת את הדיפוזיה המקומית ואזור הכליאה הממוצע מעל מיקרון רב במישור הקרום.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1142">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:480px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">iXon Ultra 897</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td>DU-897U-CS0</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Solis</td>
			<td style="width:183px;">Andor</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">CHO-K1</td>
			<td style="width:183px;">ATCC</td>
			<td style="width:119px;">CCL-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATTO 488 labeled PPE</td>
			<td style="width:183px;">ATTO-TEC GmbH</td>
			<td>AD 488-151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOPE</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">850725</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DOTAP</td>
			<td style="width:183px;">Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">890890</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">100X Penicillin-Streptomycin-Glutamine</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10378-016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">DMEM/F-12</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>21331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">HEPES</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-106&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">PBS</td>
			<td style="width:183px;">Gibco</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SimFCS 3.0</td>
			<td style="width:183px;">Globals Software</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>the software can be downloaded here: http://www.lfd.uci.edu/globals/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMI6000 with TIRF modulus</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">LAS AF</td>
			<td style="width:183px;">Leica</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:183px;">Lipofectamine</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Matlab</td>
			<td style="width:183px;">MathWork</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Imagej</td>
			<td style="width:183px;">NIH</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C-terminal GFP tagged Tranferrin Receptor</td>
			<td style="width:183px;">OriGene</td>
			<td>RG200980</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Agar</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>A5306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Chloroform</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">528730</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Latex beads, fluorescent yellow-green, 30 nm</td>
			<td style="width:183px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>L5155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">SONICA Ultrasonic Cleaners</td>
			<td>SOLTEC</td>
			<td style="width:119px;">ETH S3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Petri Dishes</td>
			<td style="width:183px;">Willco</td>
			<td>GWSt-3522</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Bio-Format importer for Matlab</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>http://www.openmicroscopy.org/site/support/bio-formats5/users/matlab/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">ICS-MatLab Tools</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td><a href="https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip">https://www.cellmigration.org/resource/imaging/software/ICSMATLAB_28-02-06.zip</a></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by Matlab Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/icsmatlab/ICSTutorial.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:361px;">Simulation by SimFCS Tutorial</td>
			<td style="width:183px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>https://www.cellmigration.org/resource/imaging/ppt-pdf/RICS%20Simulations.ppt</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

from fast fluorescence imaging to molecular diffusion law on live cell membranes in a commercial microscope

זה הפך להיות ברור יותר ויותר כי הפריסה המרחבית והתנועה של רכיבי קרום כמו שומנים וחלבונים הם גורמי מפתח בוויסות של פונקציות רבות תאיות. עם זאת, בשל הדינמיקה מהירה והמבנים הזעירים המעורבים, נדרשת רזולוציה מרחב ובזמן גבוהה מאוד כדי לתפוס את ההתנהגות האמיתית של מולקולות. כאן אנו מציגים את פרוטוקול הניסוי ללימוד הדינמיקה של חלבוני פלזמה קרום fluorescently שהכותרת ושומנים בתאים חיים עם רזולוציה spatiotemporal גבוהה. יש לציין, גישה זו אינה צריכה לעקוב אחר כל מולקולה, אך היא מחשבת התנהגות אוכלוסייה תוך שימוש בכל המולקולות באזור נתון של הקרום. נקודת המוצא היא הדמיה מהירה של אזור נתון על הממברנה. לאחר מכן, פונקצית autocorrelation מרחב ובזמן מוחלטת מחושבת מקשרת תמונות שנרכשו בהגדלת עיכובי זמן, למשל כל 2, 3, n חזרות. ניתן להוכיח כי הרוחבשל השיא של עליות פונקצית autocorrelation מרחבית בהגדלת עיכוב זמן כפונקציה של תנועת חלקיקים עקב דיפוזיה. לכן, ראוי של הסדרה של פונקציות autocorrelation מאפשר לחלץ את החלבון בפועל מתכוון עקירה מרובעת מההדמיה (iMSD), כאן מוצג בצורה של diffusivity לכאורה נגד עקירה ממוצעת. זה מניב מבט כמותית של הדינמיקה הממוצעת של מולקולות בודדות עם דיוק ננומטר. על ידי שימוש בגרסת GFP-tagged של transferrin קולטן (TFR) וATTO488 המסומנת 1-palmitoyl-2-הידרוקסי sn -glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) ניתן לצפות ברגולצית spatiotemporal של דיפוזיה חלבון והשומנים על אזורי קרום מיקרומטר בגודל בטווח זמן מיקרו ל-מילי שניות.

על מנת לכייל את המותניים אינסטרומנטלי, את דמותו של ננו חרוז ניאון בודד יכולה להיות מדד כמתואר בשלב פרוטוקול 1.1. תמונת ניאון אופיינית של חרוזים אלה מוצגת באיור 1. ההולם של חלוקת עוצמה על ידי פונקצית גאוס 2D נותן בחזרה שאריות טובות ומאפשר מדידת המותניים אינסטרומ...

Watch this Scientific Journal Video about From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope at JoVE.com

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

from-fast-fluorescence-imaging-to-molecular-diffusion-law-on-live

Research

JoVE Journal

Bioengineering

11.3K Views.  Scuola Normale Superiore. Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Video: From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of the Drosophila larva makes it an attractive model organism for live imaging studies. However, an important challenge for live imaging techniques is to noninvasively immobilize and position an animal on the microscope. This protocol presents a simple and easy to use method for immobilizing and imaging Drosophila larvae on a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic device, which we call the 'larva chip'. The larva chip is comprised of a snug-fitting PDMS microchamber that is attached to a thin glass coverslip, which, upon application of a vacuum via a syringe, immobilizes the animal and brings ventral structures such as the nerve cord, segmental nerves, and body wall muscles, within close proximity to the coverslip. This allows for high-resolution imaging, and importantly, avoids the use of anesthetics and chemicals, which facilitates the study of a broad range of physiological processes. Since larvae recover easily from the immobilization, they can be readily subjected to multiple imaging sessions. This allows for longitudinal studies over time courses ranging from hours to days. This protocol describes step-by-step how to prepare the chip and how to utilize the chip for live imaging of neuronal events in 3rd instar larvae. These events include the rapid transport of organelles in axons, calcium responses to injury, and time-lapse studies of the trafficking of photo-convertible proteins over long distances and time scales. Another application of the chip is to study regenerative and degenerative responses to axonal injury, so the second part of this protocol describes a new and simple procedure for injuring axons within peripheral nerves by a segmental nerve crush.

Using Microfluidics Chips for Live Imaging and Study of Injury Responses in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are an attractive model system for live imaging due to their translucent cuticle and powerful genetics. This protocol describes how to utilize a single-layer PDMS device, called the &#39;larva chip&#39; for live imaging of cellular processes within neurons of 3rd instar Drosophila larvae.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

Live imaging is an important technique for studying cell biological processes, however this can be challenging in live animals. The translucent cuticle of ...

A Microfluidic Technique to Probe Cell Deformability

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an efficient manner. Typically, data for ~102 cells can be acquired within a 1 hr experiment. An automated image analysis program enables efficient post-experiment analysis of image data, enabling processing to be complete within a few hours. Our device geometry is unique in that cells must deform through a series of micron-scale constrictions, thereby enabling the initial deformation and time-dependent relaxation of individual cells to be assayed. The applicability of this method to human promyelocytic leukemia (HL-60) cells is demonstrated. Driving cells to deform through micron-scale constrictions using pressure-driven flow, we observe that human promyelocytic (HL-60) cells momentarily occlude the first constriction for a median time of 9.3 msec before passaging more quickly through the subsequent constrictions with a median transit time of 4.0 msec per constriction. By contrast, all-trans retinoic acid-treated (neutrophil-type) HL-60 cells occlude the first constriction for only 4.3 msec before passaging through the subsequent constrictions with a median transit time of 3.3 msec. This method can provide insight into the viscoelastic nature of cells, and ultimately reveal the molecular origins of this behavior.

We demonstrate a microfluidics-based assay to measure the timescale for cells to transit through a sequence of micron-scale constrictions.

טכניקת Microfluidic לחקור deformability הסלולרי

Here we detail the design, fabrication, and use of a microfluidic device to evaluate the deformability of a large number of individual cells in an ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

Live Cell Imaging during Mechanical Stretch

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in their capability for measuring responses in real time in live cells or viable tissue. A protocol was developed with the use of a cell actuator to distend live cells grown on or tissues attached to an elastic substrate while imaging with confocal and atomic force microscopy (AFM). Preliminary studies show that tonic stretching of human bronchial epithelial cells caused a significant increase in the production of mitochondrial superoxide. Moreover, using this protocol, alveolar epithelial cells were stretched and imaged, which showed direct damage to the epithelial cells by overdistention simulating one form of lung injury in vitro. A protocol to conduct AFM nano-indentation on stretched cells is also provided.

A novel imaging protocol was developed using a custom motor-driven mechanical actuator to allow the measurement of real time responses to mechanical strain in live cells. Relevant to mechanobiology, the system can apply strains up to 20% while allowing near real-time imaging with confocal or atomic force microscopy.

הדמיה של תא חי במהלך מכאני למתוח

There is currently a significant interest in understanding how cells and tissues respond to mechanical stimuli, but current approaches are limited in ...

Fluorescence Recovery after Merging a Droplet to Measure the Two-dimensional Diffusion of a Phospholipid Monolayer

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after merging (FRAM). FRAM adopts the same principles as the fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) technique, especially for measuring fluorescence recovery after bleaching a specific area, but FRAM uses a drop coalescence instead of photobleaching dye molecules to induce a chemical potential gradient of dye molecules. Our technique has several advantages over FRAP: it only requires a fluorescence microscope rather than a confocal microscope equipped with high power lasers; it is essentially free from the selection of fluorescence dyes; and it has far more freedom to define the measured diffusion area. Furthermore, FRAM potentially provides a route for studying the mixing or inter-diffusion of two different surfactants, when the monolayers at a surface of droplet and at a flat air/water interface are prepared with different species, independently.

We present a new technique to measure the lateral diffusion of a surface active species at the fluid-fluid interface by merging a droplet monolayer onto a flat monolayer.

שחזור הקרינה לאחר מיזוג אגל למדוד דיפוזיה דו ממדים של חד שכבתי פוספוליפידים

We introduce a new method to measure the lateral diffusivity of a surfactant monolayer at the fluid-fluid interface, called fluorescence recovery after ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem cell (iPS) emerged as a new method in regenerative medicine. Although this tissue regeneration is promising, contamination with unwanted cells during tissue cultures is a major concern. Moreover, there is a safety concern regarding tumorigenicity after transplantation. Therefore, there is an urgent need for eliminating specific cells without damaging other cells that need to be protected, especially in established tissue. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture in vitro with near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT) without damaging non-targeted cells. This technique enables the elimination of specific cells from mixed cell cultures or tissues.

Eliminating specific cells without damaging other cells is extremely difficult, especially in established tissue, yet there is an urgent need for a cell elimination method in the tissue engineering field. Here, we present a method for specific cell elimination from a mixed 3D cell culture using near infrared photoimmunotherapy (NIR-PIT).

ביעור Cell סלקטיבי מן תרבות 3D מעורבת באמצעות טכניקה האדומה קרוב Photoimmunotherapy

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Growth of Human and Sheep Corneal Endothelial Cell Layers on Biomaterial Membranes

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is deleterious for the cells as it reduces their ability to form a mature and functional layer. Here, we present a method for establishing and subculturing human and sheep corneal endothelial cell cultures that minimizes the loss of cell-to-cell contact. Explants of corneal endothelium/Descemet&#39;s membrane are taken from donor corneas and placed into tissue culture under conditions that allow the cells to collectively migrate onto the culture surface. Once a culture has been established, the explants are transferred to fresh plates to initiate new cultures. Dispase II is used to gently lift clumps of cells off tissue culture plates for subculturing. Corneal endothelial cell cultures that have been established using this protocol are suitable for transferring to biomaterial membranes to produce tissue-engineered cell layers for transplantation in animal trials. A custom-made device for supporting biomaterial membranes during tissue culture is described and an example of a tissue-engineered graft composed of a layer of corneal endothelial cells and a layer of corneal stromal cells on either side of a collagen type I membrane is presented.

This protocol describes the critical steps required to establish and grow corneal endothelial cell cultures from explants of human or sheep tissue. A method for subculturing corneal endothelial cells on membranous biomaterials is also presented.

צמיחת הקרנית של האדם והכבשים שכבות של תאי-על ביומטריה

Corneal endothelial cell cultures have a tendency to undergo epithelial-to-mesenchymal transition (EMT) after loss of cell-to-cell contact. EMT is ...

Single-Cell Optical Action Potential Measurement in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically carried out in low throughput. Rapid and ongoing expansion of induced pluripotent stem cell (iPSC) technology presents a new standard in cardiovascular research and alternate methods are now necessary to increase throughput of electrophysiological data at a single cell level. VF2.1Cl is a recently derived voltage sensitive dye which provides a rapid single channel, high magnitude response to fluctuations in membrane potential. It possesses kinetics superior to those of other existing voltage indicators and makes available functional data equivalent to that of traditional microelectrode techniques. Here, we demonstrate simplified, non-invasive action potential characterization in externally paced human iPSC derived cardiomyocytes using a modular and highly affordable photometry system.

Here we describe optical acquisition and characterization of action potentials from induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes using a high-speed modular photometry system.

מדידה פוטנציאלית לפעולה אופטית חד-תאית בקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע מושרים על ידי תאי גזע אנושיים

Conventional intracellular microelectrode techniques to quantify cardiomyocyte electrophysiology are extremely complex, labor intensive, and typically ...