We thank Stephan Uphoff for discussions. 
R.C. was supported by Linacre College, Oxford University. A.P. was supported by the German Academic Exchange Service (DAAD), the German National Academic Foundation and EPSRC. M.S. was supported by the Wellcome Trust. A.N.K. was supported by a UK BBSRC grant (BB/H01795X/1), and a European Research Council Starter grant (261227).

<ol>
	<li>Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+green+fluorescent+protein.">The green fluorescent protein.</a> Annu Rev Biochem. 67, 509-544 (1998).</li><li>Leake, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometry+and+turnover+in+single,+functioning+membrane+protein+complexes.">Stoichiometry and turnover in single, functioning membrane protein complexes.</a> Nature. 443, 355-358 (2006).</li><li>Taniguchi, Y., Kawakami, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+HaloTag+protein+to+covalent+immobilization+of+recombinant+proteins+for+single+molecule+force+spectroscopy.">Application of HaloTag protein to covalent immobilization of recombinant proteins for single molecule force spectroscopy.</a> Langmuir. 26, 10433-10436 (2010).</li><li>Xie, X. S., Choi, P. J., Li, G. W., Lee, N. K., Lia, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+approach+to+molecular+biology+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule approach to molecular biology in living bacterial cells.</a> Annual review of biophysics. 37, 417-444 (2008).</li><li>Lee, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+multiplexed+subcellular+RNA+sequencing+in+situ.">Highly multiplexed subcellular RNA sequencing in situ.</a> Science. 343, 1360-1363 (2014).</li><li>Miesenbock, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins.">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394, 192-195 (1998).</li><li>Sauer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+microscopy+coming+of+age:+from+concepts+to+biological+impact.">Localization microscopy coming of age: from concepts to biological impact.</a> J Cell Sci. 126, 3505-3513 (2013).</li><li>Dempsey, G. T., Vaughan, J. C., Hao Chen, K., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+fluorophores+for+optimal+performance+in+localizationbased+super-resolution+imaging.">Evaluation of fluorophores for optimal performance in localizationbased super-resolution imaging.</a> Nat Meth. 8, 1027-1041 (2011).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Meth. 2, 905-909 (2005).</li><li>Landgraf, D., Okumus, B., Chien, P., Baker, T. A., Paulsson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Segregation+of+molecules+at+cell+division+reveals+native+protein+localization.">Segregation of molecules at cell division reveals native protein localization.</a> Nat. Methods. 9, 480-482 (2012).</li><li>Jaitin, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massively+Parallel+Single-Cell+RNA-Seq+for+Marker-Free+Decomposition+of+Tissues+into+Cell+Types.">Massively Parallel Single-Cell RNA-Seq for Marker-Free Decomposition of Tissues into Cell Types.</a> Science. 343, 776-779 (2014).</li><li>Aldridge, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AHT-ChIP-seq:+a+completely+automated+robotic+protocol+for+high-throughput+chromatin+immunoprecipitation.">AHT-ChIP-seq: a completely automated robotic protocol for high-throughput chromatin immunoprecipitation.</a> Genome Biol. 14, R124 (2013).</li><li>Keppler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+general+method+for+the+covalent+labeling+of+fusion+proteins+with+small+molecules+in+vivo.">A general method for the covalent labeling of fusion proteins with small molecules in vivo.</a> Nat Biotechnol. 21, 86-89 (2003).</li><li>Wombacher, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live-cell+super-resolution+imaging+with+trimethoprim+conjugates.">Live-cell super-resolution imaging with trimethoprim conjugates.</a> Nat. Methods. 7, 717-719 (2010).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+strategy+for+the+site-specific+modification+of+proteins+in+vivo.">A new strategy for the site-specific modification of proteins in vivo.</a> Biochemistry. 42, 6735-6746 (2003).</li><li>McNeil, P. L., Murphy, R. F., Lanni, F., Taylor, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+incorporating+macromolecules+into+adherent+cells.">A method for incorporating macromolecules into adherent cells.</a> J Cell Biol. 98, 1556-1564 (1984).</li><li>Clarke, M. S., McNeil, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Syringe+loading+introduces+macromolecules+into+living+mammalian+cell+cytosol.">Syringe loading introduces macromolecules into living mammalian cell cytosol.</a> J Cell Sci. 102, 533-541 (1992).</li><li>Sakon, J. J., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+the+conformation+of+individual+proteins+in+live+cells.">Detecting the conformation of individual proteins in live cells.</a> Nat. Methods. 7, 203-205 (2010).</li><li>Taylor, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electromagnetic+syringe.">Electromagnetic syringe.</a> IEEE Trans. Biomed. Eng. 25, 303-304 (1978).</li><li>Dower, W. J., Miller, J. F., Ragsdale, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+efficiency+transformation+of+E.+coli+by+high+voltage+electroporation.">High efficiency transformation of E. coli by high voltage electroporation.</a> Nucleic Acids Res. 16, 6127-6145 (1988).</li><li>Neumann, E., Schaefer-Ridder, M., Wang, Y., Hofschneider, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+transfer+into+mouse+lyoma+cells+by+electroporation+in+high+electric+fields.">Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields.</a> EMBO J. 1, 841-845 (1982).</li><li>Sustarsic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+delivery+of+fluorescently+labeled+proteins+in+live+bacteria+using+electroporation.">Optimized delivery of fluorescently labeled proteins in live bacteria using electroporation.</a> Histochem Cell Biol. , (2014).</li><li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells.">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat. Methods. 5, 159-161 (2008).</li><li>Sinha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cascade+of+DNA-binding+proteins+for+sexual+commitment+and+development+in+Plasmodium.">A cascade of DNA-binding proteins for sexual commitment and development in Plasmodium.</a> Nature. 000, 1-5 (2014).</li><li>English, B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+investigations+of+the+stringent+response+machinery+in+living+bacterial+cells.">Single-molecule investigations of the stringent response machinery in living bacterial cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, E365-E373 (2011).</li><li>Crawford, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-lived+intracellular+single-molecule+fluorescence+using+electroporated+molecules.">Long-lived intracellular single-molecule fluorescence using electroporated molecules.</a> Biophys J. 105, 2439-2450 (2013).</li><li>Uphoff, S., Reyes-Lamothe, R., Garza de Leon, F., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+DNA+repair+in+live+bacteria.">Single-molecule DNA repair in live bacteria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8063-8068 (2013).</li><li>Uphoff, S., Sherratt, D. J., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+Protein-DNA+Interactions+in+Live+Bacterial+Cells+Using+Photoactivated+Single-molecule+Tracking.">Visualizing Protein-DNA Interactions in Live Bacterial Cells Using Photoactivated Single-molecule Tracking.</a> J Vis Exp. , (2014).</li><li>Hohlbein, J., Gryte, K., Heilemann, M., Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surfing+on+a+new+wave+of+single-molecule+fluorescence+methods.">Surfing on a new wave of single-molecule fluorescence methods.</a> Phys Biol. 7, 031001 (2010).</li><li>Xie, X. S., Yu, J., Yang, W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perspective+-+Living+cells+as+test+tubes.">Perspective - Living cells as test tubes.</a> Science. 312, 228-230 (2006).</li><li>Santoso, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+transitions+in+DNA+polymerase+I+revealed+by+single-molecule+FRET.">Conformational transitions in DNA polymerase I revealed by single-molecule FRET.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 715-720 (2010).</li><li>Hohlbein, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conformational+landscapes+of+DNA+polymerase+I+and+mutator+derivatives+establish+fidelity+checkpoints+for+nucleotide+insertion.">Conformational landscapes of DNA polymerase I and mutator derivatives establish fidelity checkpoints for nucleotide insertion.</a> Nature communications. 4, 2131 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

يمكن أن تختلف العديد من المعلمات أثناء Electroporation للخلية والحصول على البيانات اعتمادا على النظام البيولوجي للاهتمام والطبيعة الدقيقة للتجربة (على مستوى الخلية أو تحليل جزيء واحد). على سبيل المثال، عندما electroporating الحمض النووي في البكتيريا، ،25-5 بمول من شظايا dsDNA المسمى يؤدي إلى كفاءة استيعاب منخفضة، مما يسمح المباشر الكشف عن جزيء واحد (أي.، من دون الحاجة ل photobleaching مسبقا). فوق 5 بمول dsDNA، وخلايا تميل الى ان تكون محملة بالسلاح، وهو نظام أكثر ملاءمة للتحليل وحيدة الخلية. وينبغي أيضا أن تكون جميع السلطات الوطنية المعينة وصفت سابقا من أجل إزالة أي أثر للصبغة خالية من تنقية جل (fluorophore غير رد فعل) من محلول المخزون DNA. الى جانب ذلك، المشاكل المحتملة مع تدهور الحمض النووي، وخاصة للتجارب smFRET، يمكن معالجتها باستخدام السلطات الوطنية المعينة مع الأحماض النووية غير طبيعية، أو الزخارف التي تحمي-نوكلياز خارجية يمكن الوصول إليها مصطلحات مثل الحلقات القاسي. adjustabl آخرالمعلمة الإلكترونية في Electroporation للهي قوة المجال تطبيقها خلال Electroporation لل. انخفاض قوة المجال (~ 1 كيلو فولت / سم) سوف يؤدي إلى انخفاض كفاءة تحميل المناسبة للدراسات جزيء واحد. سوف شدة المجال أعلى (تصل إلى 1.8 كيلو فولت / سم) زيادة كفاءة تحميل. ومع ذلك، هناك علاقة عكسية بين قوة المجال وبقاء الخلية بعد Electroporation لل(انظر الشكل 4). للإشارة، قوة الحقل العادية المستخدمة للبكتيريا والخميرة Electroporation للهي ~ 1.5 كيلو فولت / سم. ثابت الوقت، وهو ما يمثل طول هذا الاضمحلال، معلمة مريحة لمتابعة، ومنذ ذلك الوقت قطرات مستمرة في أقرب وقت يحدث أي ظاهرة الانحناء في كفيت. ضمن إعدادات العادية، يجب أن تكون ثابتة الوقت أكبر من 4 مللي ثانية. وانخفاض القيم يؤدي إلى انخفاض كفاءة التحميل أو الخلايا التالفة حتى غير المحملة. العرض الأكثر electroporators درجة أخرى من الحرية (مثل &quot;اقتطاع النبض&quot; أو &quot;نبض شكل&quot;) التي يمكن تعديلها لضبط كلاتحميل الخلايا وقدرتها على البقاء. طبقنا هذه الطريقة على كل من البكتيريا والخميرة، ولكن يجب أن إجراءات مماثلة تسمح أيضا تدخيل الجزيئات الحيوية وصفت في خلايا الثدييات باستخدام إعدادات electroporator المناسبة منذ الغشاء هو في الواقع أقل تعقيدا (طبقة ثنائية الدهن واحدة) ومنذ Electroporation للتم بالفعل استخدام مع مثل هذه الخلايا 21. عندما استيعاب البروتينات المسمى، يحتاج الى كل صبغة مجانا ليتم إزالتها من Electroporation للسابق وصفت حل الأسهم البروتين. جزيئات الصبغة الحرة، نظرا لحجم أصغر، ويمكن المنضوية تفضيلي على البروتينات من الفائدة، ويصعب التمييز خلال تحليل البيانات (على الرغم من المتوقع أسرع نشرها). كدليل، لعينة من البروتين المسمى عضويا تكون مناسبة ل electroporation، وينبغي أن تكون كمية المتبقية صبغ الحرة أقل من 2٪ (الكشف عنها باستخدام المسح الضوئي فلوري من SDS-PAGE) 22. هذه العملية أهمية خاصة،حيث أن بعض الجزيئات قد التمسك الأغشية الخارجية للبكتيريا electroporated أو الخميرة. وفي هذا الصدد، ينبغي أن عينة السيطرة السلبية عرض كثافة مضان لكل خلية أقل وضوحا من خلايا electroporated، من الناحية المثالية منخفضة تصل إلى مستوى تألق ذاتي للخلايا فارغة (الخلايا التي لم المحتضنة مع أي الجزيئات الحيوية fluorescently المسمى ولا electroporated، الشكل 2). كما هو الحال مع dsDNA، ترتبط كفاءة استيعاب البروتينات وصفت لكمية الجزيئات الحيوية تضاف إلى الخلايا قبل Electroporation لل. ومع ذلك، غيرها من المعالم، مثل الحجم وتهمة، تلعب دورا في استيعاب. بروتينات صغيرة يحمل الكفاءة استيعاب عالية، في حين أن البروتينات أكبر (تصل إلى 98 كيلو دالتون) يمكن المنضوية بنجاح ولكن مع انخفاض كفاءة (الشكل 5) 26. نقطة isolelectric من البروتين، والتفاعلات المحتملة مع غشاء الخلية وغيرها من المعلمات الفيزيائية أيضاتأثير تحميل خلية أثناء Electroporation لل. ونتيجة لذلك، يحتاج المستخدمون لتحسين تجارب لنظامهم الخاص، مع العلم أن تركيز أولي عالية من البروتين المسمى (&gt; 50 ميكرومتر) سوف يعطي أفضل فرصة لتحميل ناجحة. كما يقدم Electroporation للأداة جديدة لالتشويش وتحليل وظيفة الخلوية عن طريق إدخال البروتينات والجزيئات الحيوية الأخرى إلى خلايا (إما المسمى أو غير المسماة). التجارب T7 RNA البلمرة (الشكل 5C) الحالية مثل هذا المثال على تجربة حيث يمكننا إدخال جزيء حيوي التي يمكن أن تغير التعبير الجيني في الجسم الحي باستخدام Electroporation لل. عند إجراء التجارب مضان جزيء واحد، وعادة ما فضلت TIR إنارة فوق وسائط الإضاءة الأخرى، حيث أنها توفر أفضل نسبة الإشارة إلى الضوضاء التي كتبها fluorophores الوحيدة المثيرة داخل قسم رقيقة فوق سطح ساترة (~ 100 نانومتر). ومع ذلك التصوير المسمى الجزيئات الحيوية نشرها داخل الكائنات الحية الدقيقة التي تعيش قد تعيدكراس الإضاءة أعمق (ما يصل إلى 0.8 ميكرون لكولاي). ويتحقق الإضاءة أعمق في وضع HILO، مع الحفاظ على نسبة عالية إشارة إلى الضوضاء. من ناحية أخرى، والتصوير حقل واسع مهم بشكل خاص لتحليل photobleaching من خطوة حكيمة، حيث كان المستخدم تقدير عدد جزيئات المنضوية بواسطة photobleaching من خلية محملة بالكامل مع قوة الليزر عالية وتقسيم كثافة مضان الخلايا الأولية من شدة وحدوية المنتجة من جزيء واحد (الخطوة photobleaching من واحدة، الشكل 3). مطلوب Widefield التصوير أيضا لتتبع جزيء طويل الأجل من أجل توطين الجزيئات نشرها من الاهتمام حتى لو تغطي مساراتها حجم الخلية بأكمله. في هذا البروتوكول، نقدم كيف Electroporation لل، وهي تقنية قياسية لعلماء الأحياء والكيمياء الحيوية لتقديم الأحماض النووية في خلايا، يشكل طريقة بسيطة لتقديم الجزيئات الحيوية الفلورسنت في مختلف أنواع الخلايا. عشرهو الرواية، وتقنية عالية الإنتاجية وتوفر أداة فريدة من نوعها لمراقبة الجزيئات المسمى في بيئتها الأصلية. في الجزيئات الحيوية بالإضافة المسمى مع fluorophores التي تغطي مجموعة واسعة من الأطوال الموجية، Electroporation للجزيئات يمكن أن يحقق المعدلة مع العديد من المجموعات الكيميائية، مثل النيوكليوتيدات غير طبيعية والأحماض الأمينية، وchelators المعدنية، crosslinkers، والجماعات تتم محاصرة. إذا كان النظام البيولوجي للاهتمام ليست ضرورية في تطوير الخلايا، وترميز الجين للبروتين الهدف يمكن أيضا أن يتم حذف (أو طرقت إلى أسفل)، وضمان أن البروتينات وحظ بعد استيعاب وتمثل جميع (أو أكثر) من تجمع البروتين داخل الخلايا . في جوهرها، Electroporation للأن &quot;زراعة&quot; مرونة في المختبر bioconjugates في الخلايا الحية وبالتالي تستفيد الجهود في مجال البيولوجيا الاصطناعية، وبيولوجيا الأنظمة، والحية الكشف عن جزيء واحد.

تعتمد معظم الدراسات مضان داخل الخلايا الحية على اندماج بروتين مع البروتينات الفلورية (FPS)، مثل GFP 1. هذه العلامات الفلورية تسمح دراسات في عدد النسخ، ونمط نشر أو توطين البروتينات المشاركة في عمليات مثل التعبير الجيني أو النقل غشاء 2-7. ضباط الإتصال توفر عالية خصوصية وضع العلامات، وسهل التنفيذ، وتتوفر في مخزون كبير من المتغيرات مع مختلف photophysical والخصائص الكيميائية 1. ومع ذلك، لا تزال fluorophores العضوية في اختيار رئيس للفي التجارب المختبرية نتيجة لزيادة صمود الخاصة بهم (تصل إلى 100 ​​أضعاف أكثر استقرارا من FPS) 8،9، وصغر حجمها (تصل إلى 100 ​​أضعاف حجم أصغر من FPS) وسهولة وضع العلامات ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئ (بشكل رئيسي من خلال استخدام بقايا السيستين). كل هذه العوامل أهمية خاصة لجزيء واحد مضان والحنق يدرس 10. عدة طرق استيعاب تنافسيةجي مزايا العضوية ووضع العلامات في الكشف فيفو أدخلت على مدى العقد الماضي. ومع ذلك، فإن مثل هذه الأساليب إما توظف البروتينية علامات كبيرة نسبيا (العلامات على سبيل المثال، TMP، HALO، أو 20 كيلو دالتون SNAP) 11-14، تتطلب استخدام الأحماض الأمينية غير طبيعية 15، أو تقتصر على الخلايا حقيقية النواة كبيرة، واحدة غشاء (على سبيل المثال. ، كشط التحميل، حقنة التحميل، حقن مكروي) 16-19. يصف هذا البروتوكول رواية، واضحة وعالية الإنتاجية طريقة استيعاب أن الأزواج مزايا العضوية fluorophores مع الملاحظة في الجسم الحي. لتطوير هذه التقنية، فإننا تكييفها الإجراء Electroporation لليشيع استخدامها لتحويل الخلايا مع البلازميدات DNA 20،21 من أجل تحميل الكائنات الحية الدقيقة، مثل E. كولاي أو S. الخباز مع الجزيئات الحيوية وصفت عضويا. يتكون البروتوكول من 4 خطوات بسيطة: حضانة الخلايا مع الجزيئات الحيوية المسمى،Electroporation لل، والانتعاش الخلية، وغسل الخلايا لإزالة الجزيئات الحيوية غير المنضوية. هنا، نقدم هذا البروتوكول Electroporation لل، فضلا عن عمليات التصوير الخلية وتحليل البيانات لدراسة مضان القائم على خلية واحدة جزيء والحنق الإشارات. يعتمد على Electroporation للتفريغ حقل كهربائي عالي الجهد عبر انخفاض الأيونية تعليق خلية قوة لتشكيل غشاء المسام عابرة من خلالها يمكن الجزيئات الحيوية دخول الخلايا (الشكل 1) 20،21. كما هو الحال مع التحول من البكتيريا أو الخميرة مع DNA البلازميد، والخلايا يجب أن تكون مستعدة قبل Electroporation لللضمان electrocompetency بهم. هذا الإجراء، تتكون من عدة خطوات غسل بالماء، ويزيد من نفاذية الغشاء ويقلل من القوة الأيونية من الحل خلية لتجنب الانحناء في كفيت Electroporation لل. في هذا البروتوكول، وخلايا يمكن أن تكون على استعداد كما هو موضح أدناه (انظر بروتوكول: 1.1) أو تم شراؤها من مزود التجاري<html> الصورة. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52208/52208fig1.jpg" /> الشكل 1: تمثيل تخطيطي للبروتوكول استيعاب من اليسار إلى اليمين: إضافة بضع ميكرولتر من الجزيئات الحيوية المسمى إلى قسامة من الخلايا electrocompetent (شظايا الحمض النووي المسمى مضاعف والبكتيريا في هذا المثال)؛ احتضان 1 إلى 10 دقيقة على الجليد ونقل إلى كفيت electroporation قبل المبردة. electroporate ثم قم بإضافة 0.5-1 المتوسطة الغنية مل إلى الخلايا بعد فورا؛ احتضان عند 37 ° C (أو على درجة الحرارة المطلوبة من قبل كائن، على سبيل المثال، 29 درجة مئوية لمدة الخميرة) للسماح للخلايا التعافي. أداء 5 غسل خطوات لإزالة أي المنضوية غير جزيئات الزائدة المسمى. resuspend الكرية النهائي في 100-200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني العازلة وماصة 10 ميكرولتر على لوحة الاغاروز. تغطية لوحة مع ساترة تنظيفها والصورة على المجهر مضان (في وضع حقل واسع أو وضع HILO). الحمار = &quot;jove_content&quot;&gt; يتم تحضين الخلايا Electrocompetent مع الجزيئات الحيوية وصفت قبل Electroporation لل، والتي يمكن تنفيذها باستخدام electroporators القياسية وجدت في معظم المختبرات الكيمياء الحيوية. مباشرة بعد Electroporation لل، يتم تحضين الخلايا في المتوسط ​​الغني السماح شفائهم قبل الغسل (الشكل 1). تتم إزالة الفائض من غير المنضوية-الجزيئات الحيوية وصفت لأول مرة عن طريق الغسيل في العازلة التي تحتوي على نسبة عالية نسبيا من الملح وبعض المنظفات (انظر بروتوكول: 3.3). وجود الملح يعطل التفاعلات كهرباء غير محددة شكلتها غير المنضوية-الجزيئات الحيوية التي وصفت إلا قد عصا على الغشاء الخارجي. وبالمثل، فإن وجود المنظفات في المخزن المؤقت غسل يعطل التفاعلات مسعور غير محددة. في حين استيعاب DNA واضح ومباشر (الشكل 2)، تحتاج الاحتياطات الواجب اتخاذها عند استيعاب البروتينات المسماة باستخدام Electroporation لل. أولا، قد لا تزال تحتوي على عينة الأسهم من البروتين المسمى عضويا نسبة مئوية صغيرة من الصبغة مجانا. جزيئات الصبغة الحرة هي أصغر بكثير من البروتينات، وبالتالي قد يكون داخليا تفضيلي. للتأكد من أن الغالبية العظمى من احظ جزيئات الفلورسنت المنضوية تتوافق مع البروتين من الفائدة، وينبغي أن تتضمن العينة البروتين الأولية أقل من ~ 2٪ صبغ الحرة (الشكل 5) 22. فائض غير المنضوية-البروتينات وصفت ويمكن أيضا عصا لغشاء الخلية الخارجي بعد Electroporation لل. هذه الظاهرة هو البروتين محددة وتحتاج إلى أن يتم التحقق لكل بروتين جديد. نقترح العديد من الخيارات التي تسمح بإزالة البروتينات غير المنضوية من عينة الخلايا المحملة (انظر بروتوكول: 3.3.3). وأخيرا، ومعلق الخلايا في حجم صغير من العازلة الفوسفات وpipetted على لوحة agarose، والسماح التصوير على المجهر مضان. تجميد على منصات الاغاروز هو simplالبريد وسيلة فعالة لتصوير الخلايا على ساترة دون الإضرار سلامتها. وينبغي أن تتضمن لوحة ثقافة المتوسط ​​المنخفض مضان. التصوير الخلية لا يمكن أن يؤديها إما في widefield، ومجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRF) أو باستخدام HILO (شديدة الميل ورقة مغلفة البصرية) المجهري. في تكوين HILO، شعاع الليزر تخترق أعمق في عينة مما كان عليه في TIRF، ولكن لا إلقاء الضوء على عينة برمتها لwidefield، والسماح لأكبر نسبة الإشارة إلى الضوضاء 23. اعتمادا على القرار قوة الليزر والوقت المستخدم، الجزيئات الحيوية المنضوية يمكن الاعتماد (باستخدام تحليل photobleaching من تدريجي، الشكل 3)، المترجمة، أو 24-28 تتبعها. تدخيل يبني المسمى مضاعف مع زوج الحنق من fluorophores يسمح الكمي من الحنق على حد سواء في خلية واحدة أو مستويات جزيء واحد (الشكل 6). يمكن أن تختلف معايير مختلفةاعتمادا على النتيجة المرجوة والنظام البيولوجي دراستها. أولا، كمية المواد المنضوية في كل خلية يمكن ضبطها عن طريق تغيير تركيز الجزيئات الحيوية وصفت تضاف إلى الخلايا Electroporation للالسابقة (الشكل 2). سوف قوة المجال Electroporation للتؤثر أيضا على حد سواء كفاءة التحميل وبقاء الخلية. كما هو متوقع، في حين أن زيادة كفاءة التحميل مع زيادة قوة المجال، وبقاء خلايا electroporated النقصان (الشكل 4A). يمكن قياسها كميا كل من المعلمات عن طريق تسجيل نسبة تحميلها وتقسيم الخلايا بعد Electroporation لل. هذا الاختبار بقاء إلى جانب التصوير مضان أيضا يتحقق مراقبة الجزيئات الحيوية المنضوية في الخلايا الحية، والسماح المراقبة المستمرة على مدى عدة أجيال (الشكل 4B). باختصار، هذا البروتوكول يسمح تدخيل fluorescently المسمى DNA والبروتين جزيئات فيكولاي أو S. الخباز 26. يمكن تتبع الجزيئات الفردية المسمى مع fluorophores العضوية لقرار الزمانية المكانية عالية لفترات زمنية أمر من حجم أطول من الثانية. وأخيرا، وهذا الأسلوب هو متوافق مع widefield، TIRF والكشف متحد البؤر، فضلا عن برامج الإثارة نابض، مثل ALEX (بالتناوب الليزر الإثارة 28،29).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="834">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:227px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:321px;">ElectroMax DH5-alpha Comptent cells</td>
			<td style="width:227px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">11319-019</td>
			<td>or any other commercial or lab-mage electrocompetant bacteria or yeast.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">EZ Rich Defined Madia</td>
			<td style="width:227px;">Teknova</td>
			<td style="width:119px;">M2105</td>
			<td>low fluorescence rich media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MicroPulser Electroporation Apparatus&#160;</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">165-2100</td>
			<td>or any classical electroporator for microorganism transformation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Certified Molecular Biology agarose</td>
			<td style="width:227px;">Biorad</td>
			<td style="width:119px;">161-3100</td>
			<td>low fluorescence agarose for agarose pad</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:321px;">Microscope coverslips No 1.5 thickness</td>
			<td style="width:227px;">Menzel</td>
			<td style="width:119px;">BB024060SC</td>
			<td>remove background particles by heating slides in furnace at 500 &#176;C for 1h</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Single-molecule fluorescence microscope</td>
			<td style="width:227px;">Home-built</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>described in REFs</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Localization software</td>
			<td style="width:227px;">Custom-written, available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB and C++ software package that can be adapted for localization analysis.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:321px;">Tracking software</td>
			<td style="width:227px;">Available online</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>MATLAB implementation by Blair and Dufresne.&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

internalization and observation of fluorescent biomolecules in living microorganisms via electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Watch this Scientific Journal Video about Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation at JoVE.com

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

استيعاب ومراقبة من نيون جزيئات حيوية في الكائنات الدقيقة الحية عبر Electroporation لل

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

internalization-observation-fluorescent-biomolecules-living

Research

JoVE Journal

Biology

16.7K Views.  University of Oxford. Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

Video: Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

Electroporation of Mycobacteria

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly caused by the thick and waxy cell wall, but is compounded by the fact that most molecular techniques have been developed for distantly-related species such as Escherichia coli and Bacillus subtilis. In spite of these obstacles, mycobacterial plasmids have been identified and DNA transformation of many mycobacterial species have now been described. The most successful method for introducing DNA into mycobacteria is electroporation. Many parameters contribute to successful transformation; these include the species/strain, the nature of the transforming DNA, the selectable marker used, the growth medium, and the  conditions for the electroporation pulse. Optimized methods for the transformation of both slow- and fast-grower are detailed here. Transformation efficiencies for different mycobacterial species and with various selectable markers are reported.

Mycobacterial pathogenic strategies remain poorly understood. The slow growth rate of most species, the impenetrable nature of the cell-wall, and the hazards of working with pathogens make mycobacteria difficult to study and are largely responsible for our poor understanding of these organisms. In this video we will demonstrate the technique of electroporation, which involves subjecting cells to a brief high electrical impulse to allow the entry of DNA. It is the most widely used method for introducing DNA into mycobacterial cells.

Electroporation من مايكوباكتيريا

High efficiency transformation is a major limitation in the study of mycobacteria. The genus Mycobacterium can be difficult to transform; this is mainly ...

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

يعيش التصوير خلية من طراز F - أكتين حيوية عن طريق الميكروسكوب الرقطة نيون (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti. 

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the inner ear (fig 1). Hair cells in the developing cochlea, which are the mechanosensory cells of the auditory system, are aligned in one row of inner hair cells and three (in the base and mid-turns) to four (in the apical turn) rows of outer hair cells that span the length of the organ of Corti. Hair cells transduce sound-induced mechanical vibrations of the basilar membrane into neural impulses that the brain can interpret. Most cases of sensorineural hearing loss are caused by death or dysfunction of cochlear hair cells.
An increasingly essential tool in auditory research is the isolation and in vitro culture of the organ explant 1,2,9. Once isolated, the explants may be utilized in several ways to provide information regarding normative, anomalous, or therapeutic physiology. Gene expression, stereocilia motility, cell and molecular biology, as well as biological approaches for hair cell regeneration are examples of experimental applications of organ of Corti explants.
This protocol describes a method for the isolation and culture of the organ of Corti from neonatal mice. The accompanying video includes stepwise directions for the isolation of the temporal bone from mouse pups, and subsequent isolation of the cochlea, spiral ligament, and organ of Corti. Once isolated, the sensory epithelium can be plated and cultured in vitro in its entirety, or as a further dissected micro-isolate that lacks the spiral limbus and spiral ganglion neurons. Using this method, primary explants can be maintained for 7-10 days. As an example of the utility of this procedure, organ of Corti explants will be electroporated with an exogenous DsRed reporter gene. This method provides an improvement over other published methods because it provides reproducible, unambiguous, and stepwise directions for the isolation, microdissection, and primary culture of the organ of Corti.

Primary Culture and Plasmid Electroporation of the Murine Organ of Corti.

This procedure describes a method for the isolation and culture of the murine organ of Corti with or without the spiral limbus and spiral ganglion neurons. We also demonstrate a method for the expression of an exogenous reporter gene in the organ of Corti explant by electroporation.

الابتدائية الثقافة وElectroporation البلازميد الجهاز الفئران كورتي.

In all mammals, the sensory epithelium for audition is located along the spiraling organ of Corti that resides within the conch shaped cochlea of the ...

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging. Cell shape changes in the fly are analogous to those in higher organisms, and they drive tissue morphogenesis. So, in many cases, their study has direct implications for understanding human disease (Table 1)1-5. On the sub-cellular scale, these cell shape changes are the product of activities ranging from gene expression to signal transduction, cell polarity, cytoskeletal remodeling and membrane trafficking. Thus, the Drosophila embryo provides not only the context to evaluate cell shape changes as they relate to tissue morphogenesis, but also offers a completely physiological environment to study the sub-cellular activities that shape cells.
The protocol described here is designed to image a specific cell shape change called cellularization. Cellularization is a process of dramatic plasma membrane growth, and it ultimately converts the syncytial embryo into the cellular blastoderm. That is, at interphase of mitotic cycle 14, the plasma membrane simultaneously invaginates around each of ~6000 cortically anchored nuclei to generate a sheet of primary epithelial cells. Counter to previous suggestions, cellularization is not driven by Myosin-2 contractility6, but is instead fueled largely by exocytosis of membrane from internal stores7. Thus, cellularization is an excellent system for studying membrane trafficking during cell shape changes that require plasma membrane invagination or expansion, such as cytokinesis or transverse-tubule (T-tubule) morphogenesis in muscle.
Note that this protocol is easily applied to the imaging of other cell shape changes in the fly embryo, and only requires slight adaptations such as changing the stage of embryo collection, or using "embryo glue" to mount the embryo in a specific orientation (Table 1)8-19. In all cases, the workflow is basically the same (Figure 1). Standard methods for cloning and Drosophila transgenesis are used to prepare stable fly stocks that express a protein of interest, fused to Green Fluorescent Protein (GFP) or its variants, and these flies provide a renewable source of embryos. Alternatively, fluorescent proteins/probes are directly introduced into fly embryos via straightforward micro-injection techniques9-10. Then, depending on the developmental event and cell shape change to be imaged, embryos are collected and staged by morphology on a dissecting microscope, and finally positioned and mounted for time-lapse imaging on a confocal microscope.

Imaging Cell Shape Change in Living Drosophila Embryos

Early development of the fruit fly, Drosophila melanogaster, is characterized by a number of cell shape changes that are well suited for imaging approaches. This article will describe basic tools and methods required for live confocal imaging of Drosophila embryos, and will focus on a cell shape change called cellularization.

التصوير تغيير الشكل في الخلية الحية ذبابة الفاكهة الأجنة

The developing Drosophila melanogaster embryo undergoes a number of cell shape changes that are highly amenable to live confocal imaging.  Cell shape ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. Maintenance of proteasome activity was implicated in many key cellular processes, like cell's stress response 3, cell cycle regulation and cellular differentiation 4 or in immune system response 5. The dysfunction of the ubiquitin-proteasome system has been related to the development of tumors and neurodegenerative diseases 4, 6. Additionally, a decrease in proteasome activity was found as a feature of cellular senescence and organismal aging 7, 8, 9, 10. Here, we present a method to measure ubiquitin-proteasome activity in living cells using a GFP-dgn fusion protein. To be able to monitor ubiquitin-proteasome activity in living primary cells, complementary DNA constructs coding for a green fluorescent protein (GFP)&#x2013;dgn fusion protein (GFP&#x2013;dgn, unstable) and a variant carrying a frameshift mutation (GFP&#x2013;dgnFS, stable 11) are inserted in lentiviral expression vectors. We prefer this technique over traditional transfection techniques because it guarantees a very high transfection efficiency independent of the cell type or the age of the donor. The difference between fluorescence displayed by the GFP&#x2013;dgnFS (stable) protein and the destabilized protein (GFP-dgn) in the absence or presence of proteasome inhibitor can be used to estimate ubiquitin-proteasome activity in each particular cell strain. These differences can be monitored by epifluorescence microscopy or can be measured by flow cytometry.

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

A method to monitor ubiquitin-proteasome activity in living cells is described. A degron-destabilized GFP- (GFP-dgn) and a stable GFP-dgnFS fusion protein are generated and transduced into the cell using a lentiviral expression vector. This technique allows to generate a stable GFP-dgn/GFP-dgnFS expressing cell line in which ubiquitin-proteasome activity can be easily assessed using epifluorescence or flow cytometry.

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific properties, such as binding affinity, agonist or antagonist behavior, or stability, relative to the native sequence. Protein design lies at the center of current advances drug design and discovery. Not only does protein design provide predictions for potentially useful drug targets, but it also enhances our understanding of the protein folding process and protein-protein interactions. Experimental methods such as directed evolution have shown success in protein design. However, such methods are restricted by the limited sequence space that can be searched tractably. In contrast, computational design strategies allow for the screening of a much larger set of sequences covering a wide variety of properties and functionality. We have developed a range of computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. These include the design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity.
To disseminate these methods for broader use we present Protein WISDOM (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>), a tool that provides automated methods for a variety of protein design problems. Structural templates are submitted to initialize the design process. The first stage of design is an optimization sequence selection stage that aims at improving stability through minimization of potential energy in the sequence space. Selected sequences are then run through a fold specificity stage and a binding affinity stage. A rank-ordered list of the sequences for each step of the process, along with relevant designed structures, provides the user with a comprehensive quantitative assessment of the design. Here we provide the details of each design method, as well as several notable experimental successes attained through the use of the methods.

Protein WISDOM: A Workbench for In silico De novo Design of BioMolecules

We developed computational de novo protein design methods capable of tackling several important areas of protein design. To disseminate these methods we present Protein WISDOM, an online tool for protein design (<a href="http://www.proteinwisdom.org" target="_blank">http://www.proteinwisdom.org</a>). Starting from a structural template, design of monomeric proteins for increased stability and complexes for increased binding affinity can be performed.

الحكمة البروتين: A منضدة لل<em&gt; في السيليكون</em&gt;<em&gt; دي نوفو</em&gt; تصميم الجزيئات الحيوية

The aim of de novo protein design is to find the amino acid sequences that will fold into a desired 3-dimensional structure with improvements in specific ...

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular transfection technique for testicular mouse cells allows the study of unique processes in spermatogenesis.
The following protocol focuses on transfection of testicular mouse cells with plasmid constructs. Specifically, we used the reporter vector pEGFP-C1, which expresses enhanced green fluorescent protein (eGFP) and also the pDsRed2-N1 vector expressing red fluorescent protein (DsRed2). Both encoded reporter genes were under the control of the human cytomegalovirus immediate-early promoter (CMV).
For performing gene transfer into mouse testes, the reporter plasmid constructs are injected into testes of living mice. To that end, the testis of an anaesthetized animal is exposed and the site of microinjection is prepared. Our preferred place of injection is the efferent duct, with the ultimately connected rete testis as the anatomical transport route of the spermatozoa between the testis and the epididymis. In this way, the filling of the seminiferous tubules after microinjection is excellently managed and controlled due to the use of stained DNA solutions. After observing a sufficient filling of the testis by its colored tubule structure, the organ is electroporated. This enables the transfer of the DNA solution into the testicular&#160;cells. Following 3 days of incubation, the testis is removed and investigated under the microscope for green or red&#160;fluorescence, illustrating transfection success.
Generally, this protocol can be employed for delivering DNA- or RNA- constructs into living mouse testis in order to (over)express or knock down genes, facilitating in vivo gene function analysis. Furthermore, it is suitable for studying reporter constructs or putative gene regulatory elements. Thus, the main advantages of the electroporation technique are fast performance in combination with low effort as well as the moderate technical equipment and skills required compared to alternative techniques.

In Vivo Microinjection and Electroporation of Mouse Testis

This article describes microinjection and electroporation of mouse testis in&#160;vivo as a&#160;transfection technique for testicular mouse cells to study unique processes of spermatogenesis. The presented protocol involves steps of glass capillary preparation, microinjection via the efferent duct, and transfection by electroporation.

في فيفو حقن مكروي و Electroporation ماوس الخصية

This video and article contribution gives a comprehensive description of microinjection and electroporation of mouse testis in vivo. This particular ...

Tracking Drug-induced Changes in Receptor Post-internalization Trafficking by Colocalizational Analysis

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.

Receptor trafficking modulates signaling and cell responsiveness to ligands and is, itself, responsive to cell conditions, including ligand-induced signaling. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing drug-induced receptor trafficking using immunolabeling and colocalizational analysis.

تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational

The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

عالية الدقة التصوير الوقت الفاصل بين وتحليل الآلي للأنيبيب حيوية في المعيشة السري الإنسان خلايا الوريد غشائي

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. To improve the mating efficiency of B. Xylophilus and to increase the chances of mating observation, virgin adults were cultured and used for the investigation. Eggs were obtained by keeping the nematodes in water and allowing the females to lay eggs for 10 min. The second-stage juveniles (J2) were synchronized by incubating the eggs for 24 h at 25 &#176;C in the dark, and the early J4 were obtained by culturing the J2 with grey mold, Botrytis cinerea, for another 52 h. At this time point, most J4 nematodes could be clearly distinguished as being male or female using their genital morphology. The male and female J4 were collected and cultured separately in two different Petri dishes for 24 h to get virgin adult nematodes. A virgin male and a virgin female were paired in a drop of water in the well of a concave slide. The mating behavior was filmed with a video recorder under a stereomicroscope. The whole period of the mating process was 82.8 &#177;3.91 min (mean &#177;SE) and could be divided into 4 different phases: searching, contacting, copulating, and lingering. The mean minutes of duration were 21.8 &#177; 2.0, 28.0 &#177; 1.9, 25.8 &#177; 0.7 and 7.2 &#177; 0.5, respectively. Eleven sub-behaviors were described: cruising, approaching, encountering, touching, hooping, locating, attaching, ejaculating, separating, quiescence, and roaming. Interestingly, obvious intra-sexual competition was observed when one female was grouped with 3 males or one male with 3 females. This protocol is useful and valuable, not only in investigating the mating behavior of B. xylophilus, but also in acting as a reference for ethological studies of other nematodes.

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

A protocol for investigating the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, is presented. Behavioral features of B. xylophilus are described in the mating process.

المراقبة والقياس الكمي للسلوك التزاوج في غابة الصنوبر نيماتودا،<em&gt; Bursaphelenchus xylophilus</em

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...