والكتاب ليس لديهم الاعترافات.

1. ميكا وإعداد الشرائح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان رقم 1 ½ (0.17 ملم) coverslips في تلطيخ الرف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يصوتن لمدة 30 دقيقة في 2٪ المنظفات في 60 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل 20 مرات مع الماء منزوع الأيونات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الشرائح باستخدام ملقط وضربة الجافة باستخدام الهواء المضغوط أو النيتروجين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع ورقة الميكا إلى 10 × 10 مم قطع مربعة باستخدام مقص أو شفرة حلاقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قطع كل قطعة الميكا في 2-3 منشورات أرق باستخدام شفرة حلاقة. ملاحظة: يتطلب هذا خطوة استخدام شفرة حادة. </li></ol> 2. الجمعية ميكا وغرفة تصاعد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> شريحة زجاجية مجهرية نظيفة مع الايثانول. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النشرة الغراء من الميكا قطع في الخطوة 1.6 إلى شريحة زجاجية باستخدام لاصق البصرية. وينصح اللزوجة المنخفضة لاصقة لنشر أفضل قطرة والغراء الميكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، 10 دقيقة. يتم الشفاء لاصق بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع أقصى قدر من الاستيعاب في حدود 350 إلى 380NM والطاقة أوصت REQU ملاحظة:IRED للعلاج الكامل هو 4.5 J / سم 2. ومع ذلك، مصادر الضوء مختلفة يمكن استخدامها لهذه الخطوة (انظر المواد المقدمة من قبل المورد لاصق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فضح سطح الميكا نظيفة عن طريق إزالة طبقات القليلة الأولى مع لاصق شفاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة صغيرة (~ 20 ميكرون) من مادة لاصقة البصرية على سطح الميكا. ملاحظة: في هذه الخطوة، وينصح لاصقة عالية اللزوجة مع انخفاض مستوى تألق ذاتي. أظهرت تجربتنا أن استخدام مزيج من انخفاض (الخطوة 2.2) ومواد لاصقة عالية اللزوجة يزيد فعالية بكثير من الميكا تقسيم (الخطوة 2.7). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع بلطف ساترة تنظيفها حديثا على قطرة من مادة لاصقة، وتجنب فقاعات الهواء، والسماح تسوية لمدة 1 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج تحت مصباح الأشعة فوق البنفسجية، 10 دقيقة. ملاحظة: بعد هذه الخطوة، وشطيرة من شريحة زجاجية، والميكا وساترة يمكن تخزينها لفترة طويلة نسبيا من الزمن (تصل إلى بضعة أسابيع). انتقل إلى الخطوة التالية قبل إعداد SLB الفعلية، للتأكد من أن سطح الميكا هو جديد. ملاحظة: يتم الشفاء لاصق بواسطة ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع أقصى قدر من الاستيعاب في حدود 350 إلى 380NM والطاقة اللازمة لعلاج أوصى الكامل هو 4.5J/cm 2. ومع ذلك، مصادر الضوء مختلفة يمكن استخدامها لهذه الخطوة (انظر المواد المقدمة من قبل المورد لاصق). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام سكين exacto، ترجل بلطف ساترة من الشريحة الزجاجية الجانبية كما هو موضح في الفيديو. في معظم الحالات، سوف طبقة رقيقة ومسطحة من الميكا لا تزال تعلق على ساترة. تعلق الميكا لشريحة زجاجية يمكن إعادة استخدامها (اكرر من الخطوة 2.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحقق من جودة سطح بالعين المجردة أو تحت مجهر تشريح، للتأكد من أن طبقة الميكا لا يزال لصقها على ساترة وليس ازالتها بالكامل خلال تقسيم في الخطوة 2.8. سوف يجعل خدش صغير مع ملقط أو إبرة تشريح تساعد على التمييز بين اللاصق الذي لديه الاتساق مختلفة detectably من الميكا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الختم المطاطي من 1.5 مل قارورة غطاء الغراء وغطاء رأسا على عقب إلى السطح باستخدام البصريةلاصقة أو طلاء الأظافر، وعلاج مع مصباح الأشعة فوق البنفسجية، أو السماح الهواء الجاف 10 دقيقة على التوالي. ملاحظة: إذا تم إعداد نموذج لفي وقت واحد البصرية (TIRFM أو متحد البؤر) مع التصوير فؤاد، 1.5 مل قارورة كأب قد تكون صغيرة جدا لتحميل رئيس فؤاد على المسرح المجهر. في هذه الحالة، يمكن استبداله بأي غطاء من البلاستيك يا الدائري بقطر أكبر، ومناسبة للرئيس فؤاد في تصاعد مستمر. في حالة عندما يتطلب التجربة إزالة الغطاء دون الإضرار سطح الميكا، السيليكون الشحوم يمكن استخدامها بدلا من الغراء أو طلاء الأظافر. </li></ol> 3. المدعومة الدهن طبقة ثنائية (SLB) تشكيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع حل الحويصلية الطازجة في الغرفة مع السطح. الحد الأدنى للحجم المطلوب لتشكيل SLB هو ~ 30 ميكرولتر. ملاحظة: للحصول على مزيد من التفاصيل حول الحويصلية وتشكيل SLB، راجع بروتوكولات المنشورة، مثل مثل حقيبة وآخرون 2014 15. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المضي قدما في تشكيل SLB باستخدام بروتوكول المطلوب. أثناء الحضانة ووالتصوير، ويمكن وضعها في غرفة في كتلة الحرارة أو ساخنة المرحلة المجهر للحفاظ على درجة الحرارة المطلوبة للحفاظ على الدهون المستخدمة فوق درجة حرارة انصهارها. </li></ol>

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

والكتاب ليس لديهم ما يكشف.

يصف هذا البروتوكول وسيلة لإعداد الأسطح الملساء ورقيقة الميكا لترسب طبقة ثنائية الدهون وعالية الدقة التصوير. تقنية تتطلب الحد الأدنى من المهارات اليدوية، تقتصر في معظمها إلى التفكيك حذرا من الساندويتش الزجاج الميكا من الزجاج (الخطوة 2.8)، وهو أمر حاسم للحصول على سطح ا...

الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار طريقة لإعداد الأسطح الميكا لتصوير عالية الدقة من الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) باستخدام المجهر الضوئي مجموع مضان انعكاس الداخلي (TIRFM) أو المجهري متحد البؤر، والتي يمكن أيضا أن تكون جنبا إلى جنب مع القوة الذرية المجهري (AFM). SLBs هي النموذج المستخدم على نطاق واسع لدراسات عديدة من تجمع الدهون، مرحلة الانفصال، وديناميات مكونات طبقة ثنائية أو تفاعلاتها مع الببتيدات والبروتينات أو غيرها من المركبات 1-5. يمكن استخدامها ركائز مختلفة لتشكيل SLB (أي الزجاج، والميكا، وثاني أكسيد السيليكون، والبوليمرات) تبعا لطبيعة الدراسة 4،6-8. دراسات غشاء نموذجية تعتمد على تقنيات التصوير القائم على الفحص المجهري، مثل TIRFM وفؤاد. وبالتالي، لتصوير TIRFM، سطح الزجاج هو خيار نموذجي لأن الزجاج الشفاف. إعداد كوب من السهل نسبيا، ونوعية النتائج هو في المقام الأوليحدده سطح شامل تنظيف قبل ترسب الدهون الحويصلات. فؤاد بسبب قرار المحورية العالية يتطلب السطوح الميكا. الميكا هو معدن سيليكات، مع ما يقرب من الكمال الانقسام القاعدية. وبالتالي، فإن الميكا المشقوق حديثا مسطح بالذرة، مما يتيح مراقبة الخلافات ارتفاع الغشاء حتى على مقياس متناهي الصغر الفرعية 9. وأظهرت دراسات نشرها باستخدام أساليب مثل التحليل الطيفي علاقة مضان (FCS)، جزيء واحد تتبع (SMT)، والانتعاش بعد مضان photobleaching من (FRAP) مع ذلك، أن ديناميات غشاء الدهون تعتمد اعتمادا كبيرا على نوع من السطحية التي تترسب على أنهم، حيث الزجاج والميكا على نطاق واسع يمكن أن تعطي نتائج متفاوتة 10،11. وتشمل هذه الخلافات ليس فقط معاملات نشر تحقيقات الغشاء، ولكن أيضا للكشف عن السكان منفصلة من الجزيئات نشرها مع أسعار مختلفة، وربما التبديل بين ولايات مختلفة. وبالتالي،المقارنة المباشرة للنتائج التي تم الحصول عليها باستخدام تقنيات TIRFM وفؤاد هو في كثير من الأحيان إشكالية، إلا إذا كان السطح نفسه (في هذه الحالة الميكا) يستخدم. على الرغم من أن هناك بعض الدراسات التي أجريت TIRFM والتصوير فؤاد طبقة ثنائية الميكا على نفس السطح 12،13، ونادرا ما يستخدم لالميكا المجهر الضوئي، ومعظمهم بسبب مشاكل التعامل معها. إعداد الميكا يتطلب القطع باليد الى منشورات رقيقة، والتي يتم بعد ذلك لصقها على ساترة باستخدام لاصق البصرية 12. ولكن هذا الأسلوب يتطلب بعض الممارسة لتحقيق نتائج مرضية. وعلاوة على ذلك، فإن الأسطح التي تم الحصول عليها في كثير من الأحيان مائج وسميكة، مما يجعل من الصعب استخدامها مع مسافة العمل المنخفضة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية. السطوح الميكا أعدت على النحو المبين في هذا البروتوكول هي رقيقة جدا (~ 220 ميكرون، بما في ذلك سمك ساترة من 170 ميكرون) ومسطحة للغاية، وتجنب &quot;التموج&quot;، وهو أمر حاسم لنجاح عالية الدقة التصوير. يمكن استخدامهالTIRFM أو متحد البؤر الاجهزة. علاوة على ذلك، نفس العينات يمكن نقلها إلى فؤاد، وحتى تصويرها في وقت واحد مع TIRFM / متحد البؤر وفؤاد. الجمع بين هاتين التقنيتين تسمح علاقة مباشرة السلوك نشرها مع هيكل الغشاء طبقة ثنائية 14. لأن الأسطح الميكا والمشقوق حديثا، فهي نظيفة ولا تتطلب وقتا طويلا، وضعف استنساخه، وإجراءات التنظيف يحتمل أن تكون خطرة (تشمل البروتوكولات تنظيف الزجاج عادة المواد الكيميائية مثل البيرانا حل، وحامض الكبريتيك، والصوديوم / البوتاسيوم هيدروكسيد). تصاعد من غرفة صغيرة، كما هو موضح في البروتوكول، ويقلل من حجم الحويصلات المطلوبة لتشكيل طبقة ثنائية فعالة إلى أقل من 50 ميكرولتر. أخيرا، والعملية برمتها التجمع السطح ليست مضيعة للوقت (إعداد تستغرق أقل من 30 دقيقة)، و لا يتطلب درجة عالية من المهارة اليدوية، وكذلك الانقسام الميكا التقليدية ولصق.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="710">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:135px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Bath Sonicator</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">FB15051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Coverslips 24 x 50mm - No H1.5</td>
			<td style="width:135px;">Marienfeld</td>
			<td style="width:119px;">102222</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">DOPC</td>
			<td style="width:135px;">Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:119px;">850357</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Hellmanex III (detergent)</td>
			<td style="width:135px;">Hellma Analytics</td>
			<td style="width:119px;">320.003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Mica V-1 Grade</td>
			<td style="width:135px;">SPI Suppliers</td>
			<td style="width:119px;">1872-CA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (high viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">Optical Adhesive (low viscosity)</td>
			<td style="width:135px;">Norland Products</td>
			<td style="width:119px;">NOA60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sphingomyelin-ATTO647N</td>
			<td style="width:135px;">AttoTec</td>
			<td>AD 647N-171</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:291px;">UV lamp</td>
			<td style="width:135px;">Synoptics Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">GelVue GVM20</td>
			<td>The lamp was set to 100% power</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

وتستخدم على نطاق واسع بدعم طبقات ثنائية الدهون (SLBs) كنموذج لدراسة خصائص الغشاء (مرحلة الانفصال، والتجميع، وديناميات) وتفاعله مع مركبات أخرى، مثل المخدرات أو الببتيدات. ولكن خصائص SLB تختلف تبعا لدعم استخدامها. التقنيات المستخدمة عادة لSLB التصوير والقياسات هي واحدة جزيء المجهري مضان، FCS والقوة الذرية المجهري (AFM). لأن تتم معظم الدراسات التصوير الضوئي خارجا على الدعم الزجاج، في حين يتطلب فؤاد على سطح مستو للغاية (الميكا عموما)، لا يمكن مقارنة النتائج من هذه التقنيات بشكل مباشر، لأن هذا الاتهام ونعومة خصائص هذه المواد تؤثر بشدة نشرها. للأسف، ومستوى عال من البراعة اليدوية اللازمة لقطع ولصق شرائح رقيقة من الميكا إلى شريحة زجاجية يمثل عقبة أمام الاستخدام الروتيني للالميكا لإعداد SLB. على الرغم من أن هذا من شأنه أن يكون وسيلة من خيار، مثل إعداد الميكاالأسطح غالبا ما ينتهي الأمر متفاوتة (متموج) ويصعب الصورة، وخاصة مع المسافة العمل الصغيرة، وارتفاع العدسات الفتحة العددية. ونحن هنا نقدم وسيلة بسيطة وقابلة للتكرار لإعداد رقيقة، والسطوح الميكا شقة لترسب الدهون حويصلة وإعداد SLB. بالإضافة إلى ذلك، لدينا غرفة العرف يتطلب سوى كميات صغيرة جدا من حويصلات لتشكيل SLB. نتائج الإجراء العام في كفاءة الإنتاج، بسيطة وغير مكلفة ذات جودة عالية السطوح الدهون طبقة ثنائية قابلة للمقارنة مباشرة لتلك المستخدمة في الدراسات فؤاد.

سلوك نشر تحقيقات الفلورسنت الدهون في SLBs مختلفة اعتمادا على الركيزة. TIRFM جنبا إلى جنب مع تقنية SMT هي طريقة قيمة لتصور حركات الجسيمات واستخراج معاملات نشرها. وترد إشارات جزيء واحد من تحقيق سفينغوميالين-ATTO647N نشرها في DOPC (1،2-dioleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine) طبقة ثنائية معتمدة عل?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

نقدم طريقة إعداد الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون عالية الدقة المجهر. الميكا شفافة ومسطحة على المقياس الذري، ولكن نادرا ما تستخدم في التصوير بسبب التعامل مع الصعوبات؛ إعداد لدينا في النتائج حتى ترسب ورقة الميكا، ويقلل من المواد المستخدمة في إعداد طبقة ثنائية.

إعداد ميكا المدعومة الدهون طبقات ثنائية لارتفاع القرار المجهر الضوئي التصوير

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Views.  Nanyang Technological University.  نقدم طريقة إعداد الميكا بدعم طبقات ثنائية الدهون عالية الدقة المجهر. الميكا شفافة ومسطحة على المقياس الذري، ولكن نادرا ما تستخدم في التصوير بسبب التعامل مع الصعوبات؛ إعداد لدينا في النتائج حتى ترسب ورقة الميكا، ويقلل من المواد المستخدمة ?...

Video: Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution. Traditionally, multiple experiments are run in parallel, with individual samples removed from the study at sequential time points for evaluation by light microscopy. Several intravital techniques have been developed, with confocal, multiphoton, and second harmonic microscopy all demonstrating their ability to be used for imaging in situ 1. With these systems, however, the required infrastructure is complex and expensive, involving scanning laser systems and complex light sources. Here we present a protocol for the design and assembly of a high-resolution microendoscope which can be built in a day using off-the-shelf components for under US$5,000. The platform offers flexibility in terms of image resolution, field-of-view, and operating wavelength, and we describe how these parameters can be easily modified to meet the specific needs of the end user.
We and others have explored the use of the high-resolution microendoscope (HRME) in in vitro cell culture 2-5, in excised 6 and living animal tissues 2,5, and in human tissues in vivo 2,7. Users have reported the use of several different fluorescent contrast agents, including proflavine 2-4, benzoporphyrin-derivative monoacid ring A (BPD-MA) 5, and fluoroscein 6,7, all of which have received full, or investigational approval from the FDA for use in human subjects. High-resolution microendoscopy, in the form described here, may appeal to a wide range of researchers working in the basic and clinical sciences. The technique offers an effective and economical approach which complements traditional benchtop microscopy, by enabling the user to perform high-resolution, longitudinal imaging in situ.

High-resolution Fiber-optic Microendoscopy for in situ Cellular Imaging

In many biological and clinical situations it is advantageous to study cellular processes as they evolve in their native microenvironment. Here we describe the assembly and use of a low-cost fiber-optic microscope which can provide real time imaging in cell culture, animal studies, and clinical patient studies.

ذات دقة عالية الألياف الضوئية للMicroendoscopy في الموقع الخلوية التصوير

Many biological and clinical studies require the longitudinal study and analysis of morphology and function with cellular level resolution.  ...

Three-dimensional Optical-resolution Photoacoustic Microscopy

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As the mainstays of in vivo three-dimensional (3-D) optical microscopy, single-/multi-photon fluorescence microscopy and optical coherence tomography (OCT) have demonstrated their extraordinary sensitivities to fluorescence and optical scattering contrasts, respectively. However, the optical absorption contrast of biological tissues, which encodes essential physiological/pathological information, has not yet been assessable. 
The emergence of biomedical photoacoustics has led to a new branch of optical microscopy optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM)1, where the optical irradiation is focused to the diffraction limit to achieve cellular1 or even subcellular2 level lateral resolution. As a valuable complement to existing optical microscopy technologies, OR-PAM brings in at least two novelties. First and most importantly, OR-PAM detects optical absorption contrasts with extraordinary sensitivity (i.e., 100%). Combining OR-PAM with fluorescence microscopy3 or with optical-scattering-based OCT4 (or with both) provides comprehensive optical properties of biological tissues. Second, OR-PAM encodes optical absorption into acoustic waves, in contrast to the pure optical processes in fluorescence microscopy and OCT, and provides background-free detection. The acoustic detection in OR-PAM mitigates the impacts of optical scattering on signal degradation and naturally eliminates possible interferences (i.e., crosstalks) between excitation and detection, which is a common problem in fluorescence microscopy due to the overlap between the excitation and fluorescence spectra. 
Unique for optical absorption imaging, OR-PAM has demonstrated broad biomedical applications since its invention, including, but not limited to, neurology5, 6, ophthalmology7, 8, vascular biology9, and dermatology10. In this video, we teach the system configuration and alignment of OR-PAM as well as the experimental procedures for in vivo functional microvascular imaging.

Optical-resolution photoacoustic microscopy (OR-PAM) is an emerging technology capable of imaging optical absorption contrasts in vivo with cellular resolution and sensitivity. Here, we provide a visualized instruction on the experimental protocols of OR-PAM, including system configuration, system alignment, typical in vivo experimental procedures, and functional imaging schemes.

ثلاثي الأبعاد البصرية الميكروسكوب الضوئي الاستبانة

Optical microscopy, providing valuable insights at the cellular and organelle levels, has been widely recognized as an enabling biomedical technology. As ...

Wideband Optical Detector of Ultrasound for Medical Imaging Applications

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic imaging. In medical applications, one of the major limitations of optical sensing technology is its susceptibility to environmental conditions, e.g. changes in pressure and temperature, which may saturate the detection. Additionally, the clinical environment often imposes stringent limits on the size and robustness of the sensor. In this work, the combination of pulse interferometry and fiber-based optical sensing is demonstrated for ultrasound detection. Pulse interferometry enables robust performance of the readout system in the presence of rapid variations in the environmental conditions, whereas the use of all-fiber technology leads to a mechanically flexible sensing element compatible with highly demanding medical applications such as intravascular imaging. In order to achieve a short sensor length, a pi-phase-shifted fiber Bragg grating is used, which acts as a resonator trapping light over an effective length of 350 &#181;m. To enable high bandwidth, the sensor is used for sideway detection of ultrasound, which is highly beneficial in circumferential imaging geometries such as intravascular imaging. An optoacoustic imaging setup is used to determine the response of the sensor for acoustic point sources at different positions.

Optical detection of ultrasound is impractical in many imaging scenarios because it often requires stable environmental conditions. We demonstrate an optical technique for ultrasound sensing in volatile environments with miniaturization and sensitivity levels appropriate for optoacoustic imaging in restrictive scenarios, e.g. intravascular applications.

النطاق العريض للكشف عن الموجات فوق الصوتية البصرية للتطبيقات التصوير الطبي

Optical sensors of ultrasound are a promising alternative to piezoelectric techniques, as has been recently demonstrated in the field of optoacoustic ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

عالية الدقة تحليل الزمانية المكانية من مستقبلات حيوية من قبل جزيء واحدة الإسفار الميكروسكوب

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

مضان تبريد لالقريبة من الأشعة تحت الحمراء Fluorophore-مغلفة Liposomal كأداة لل<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير الضوئي

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

قوة الذرية المجهر التصوير وقوة التحليل الطيفي لدعم الدهن طبقات ثنائية

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

صالحة يجند نانو الكتلة في الدهن طبقة ثنائية المعتمدة

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the optical mean free path (~1 mm in skin) with high resolution. By combining optical absorption contrast with the high spatial resolution of ultrasound in a single modality, this technique can penetrate deep tissues. Photoacoustic microscopy systems can have either a low acoustic resolution and probe deeply or a high optical resolution and probe shallowly. It is challenging to achieve high spatial resolution and large depth penetration with a single system. This work presents an AR-OR-PAM system capable of both high-resolution imaging at shallow depths and low-resolution deep-tissue imaging of the same sample in vivo. A lateral resolution of 4 &#181;m with 1.4 mm imaging depth using optical focusing and a lateral resolution of 45 &#181;m with 7.8 mm imaging depth using acoustic focusing were successfully demonstrated using the combined system. Here,&#160;in vivo&#160;small-animal blood vasculature imaging is performed to demonstrate its biological imaging capability.

Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging

Here a switchable acoustic resolution (AR) and optical resolution (OR) photoacoustic microscopy (AR-OR-PAM) system capable of both high resolution imaging at shallow depth and low resolution deep tissue imaging on the same sample in vivo is demonstrated.

للتحويل الصوتية والبصرية القرار المجهر الضوئي ل<em&gt; في فيفو</em&gt; الحيوانات الصغيرة الدم الأوعية الدموية التصوير

Photoacoustic microscopy (PAM) is a fast-growing invivo imaging modality that combines both optics and ultrasound, providing penetration beyond the ...

High Resolution 3D Imaging of the Human Pancreas Neuro-insular Network

Using traditional histological methods, researchers are hampered in their ability to image whole tissues or organs in large-scale 3D. Histological sections are generally limited to &#60;20 &#181;m as formalin fixed paraffin section on glass slides or &#60;500 &#181;m for free-floating fixed sections. Therefore, extensive efforts are required for serial sectioning and large-scale image reconstruction methods to recreate 3D for samples &#62;500 &#181;m using traditional methods. In addition, light scatters from macromolecules within tissues, particularly lipids, prevents imaging to a depth &#62;150 &#181;m with most confocal microscopes. To reduce light scatter and to allow for deep tissue imaging using simple confocal microscopy, various optical clearing methods have been developed that are relevant for rodent and human tissue samples fixed by immersion. Several methods are related and use protein crosslinking with acrylamide and tissue clearing with sodium dodecyl sulfate (SDS). Other optical clearing techniques used various solvents though each modification had various advantages and disadvantages. Here, an optimized passive optical clearing method is described for studies of the human pancreas innervation and specifically for interrogation of the innervation of human islets.

Here, we present a protocol to image human pancreas sections in three dimensions (3D) using optimized passive clearing methods. This manuscript demonstrates these procedures for passive optical clearing followed by multiple immunofluorescence staining to identify key elements of the autonomic and sensory neural networks innervating human islets.