Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
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1. 운모 및 슬라이드 준비 <ol><li> 장소 번호 1 ½ (0.17 mm)는 염색 랙에 커버 슬립. </li><li> 60 ° C에서 2 % 세제에 30 분 동안 초음파 처리 </li><li> 탈 이온수로 20 회 반복한다. </li><li> 집게를 사용하여 슬라이드를 제거하고 압축 공기 또는 질소를 사용하여 건조한다. </li><li> 운모 시트를 가위 또는 면도날을 사용하여 10 × 10mm 사각형 조각으로 잘라. </li><li> 면도날을 사용하여 2 ~ 3 얇은 전단지에 각 운모 조각을 잘라. 참고 :이 단계는 날카로운 칼날의 사용을 필요로합니다. </li></ol> 2. 운모 조립 및 장착 상공 회의소 <ol><li> 에탄올로 청소 현미경 유리 슬라이드. </li><li> 광학 접착제를 사용하여 유리 슬라이드에 단계 1.6 절단 운모의 접착제 전단지. 낮은 점도의 접착제가 더 강하를 확산하고 운모를 접착하는 것이 좋습니다. </li><li> , UV 램프에서 10 분을 치료. NOTE : 접착제는 350 ~ 380 ㎚의 범위에서 최대 흡수 및 requ의 추천 에너지로 UV 광에 의해 경화된다전체 치료를위한 IRED 4.5 J / ㎠이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. </li><li> 스카치 테이프로 처음 몇 층을 제거하여 깨끗한 운모 표면을 노출. </li><li> 운모 표면에 광학 접착제의 작은 방울 (~ 20 μm의)를 배치합니다. 참고 :이 단계에서, 낮은 형광도 수준 높은 점성 접착제를 권장합니다. 우리의 경험은 낮은 (2.2 단계) 고점도 접착제의 조합을 사용하는 운모 분할 상당히 효과 (단계 2.7)을 증가 시킨다는 것을 보여 주었다. </li><li> 조심스럽게 기포를 방지, 접착제의 하락에 갓 청소 커버 슬립을 배치, 1 분에 정착 할 수 있습니다. </li><li> , UV 램프에서 10 분을 치료. NOTE :이 단계 후에, 유리 슬라이드, 운모 및 커버 슬립의 샌드위치 (몇 주까지) 시간의 비교적 긴 기간 동안 저장 될 수있다. 운모 표면이 신선한 확인하기 위해, 단지 실제 SLB 준비하기 전에 다음 단계로 진행합니다. 참고: 접착제가 380 ㎚ ~ 350의 범위에서 최대 흡수와 완전 경화에 필요한 에너지를 추천 UV 광에 의해 경화된다 4.5J/cm는 2이다. 그러나, 다른 광원 (접착제 공급 업체에서 제공하는 자료를 참조)이 단계를 사용할 수 있습니다. </li><li> 비디오 같이 exacto 칼을 사용하여 부드럽게 측 유리 슬라이드에서 커버 슬립을 분리. 대부분의 경우에, 운모의 얇고 편평한 층은 커버 슬립에 연결된 상태로 유지된다. (단계 2.4에서 반복) 재사용 할 수 운모 유리 슬라이드에 부착. </li><li> 운모 층이 여전히 커버 슬립에 접착되는 단계 2.8 분할시 완전히 제거되지 않았 음을 확인하기 위해, 육안으로 또는 해부 현미경으로 표면 품질을 확인합니다. 집게에 작은 상처를 만들거나 바늘을 해부하는 것은 운모에서 검출 가능하게 다른 일관성이있는 접착제를 구별하는 데 도움이 될 것입니다. </li><li> 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑의 고무 패킹을 제거하고 광을 사용하여 표면에 거꾸로 뚜껑을 접착제접착제 또는 매니큐어 및 UV 램프를 치료, 또는 공기는 각각 10 분을 건조 할 수 있습니다. 참고 : 샘플 AFM 이미징과 동시에 광 (TIRFM 또는 공 초점)을 준비하는 경우, 1.5 ㎖의 유리 병 뚜껑을 현미경 무대에 AFM 헤드 마운트 너무 작은 수 있습니다. 그 경우, 캡 AFM 헤드 장착에 적합한 큰 직경을 갖는 임의의 플라스틱 O-링에 의해 치환 될 수있다. 실험 운모 표면을 손상시키지 않고, 캡을 제거 요구의 경우, 실리콘 그리스 대신 접착제 또는 매니큐어 사용될 수있다. </li></ol> 3. 지원되는 지질 이중층 (SLB) 형성 <ol><li> 면에 실에 새로 제조 된 리포좀 솔루션을 놓습니다. SLB 형성에 필요한 최소 볼륨 ~ 30 μL입니다. 참고 : 리포좀 및 SLB 형성에 대한 자세한 내용은, 예컨대 가방 등 한 출판 프로토콜을 참조 2014 년 15.. </li><li> 원하는 프로토콜을 사용하여 SLB 형성을 진행합니다. 부화 중이미징, 챔버는 열 블록 또는 용융 온도 이상으로 사용되는 지질을 유지하는 데 필요한 온도를 유지하기 위해 가열 현미경 단에 배치 될 수있다. </li></ol>

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J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

이 프로토콜은 지질 이중층 증착 및 고해상 이미징 부드럽고 얇은 운모 표면의 제조 방법을 설명한다. 기술은 주로 고품질 운모 표면을 얻기위한 중요한 유리 운모 - 유리 샌드위치 (단계 2.8)의 세세한 제외에 한정되는 최소한의 수동 기술을 필요로한다. 운모는 클 리빙없이 광학 접착제에서 분리하는 것이 가능하기 때문에 갓 절단 운모의 검사는 항상 광학 접착제의 노출 된 영역을 남기고,이 시?...

본 프로토콜의 전반적인 목표는 원자 힘과 결합 될 수있는 광학 전반사 형광 현미경 (TIRFM) 또는 공 초점 현미경을 이용한 운모지지 지질 이중층 (SLB 수)의 고해상도 영상화 운모 표면의 제조 방법을 도시하는 것이다 현미경 (AFM). 유동화 증권 지질 클러스터링, 상 분리, 펩티드, 단백질 또는 다른 화합물 1-5 이중층 구성 요소 또는 상호 작용의 역학의 수많은 연구를위한 널리 사용되는 모델입니다. 다른 기판은 SLB 형성 연구 4,6-8의 특성에 따라 (즉, 유리, 운모, 이산화 규소, 중합체)에 사용될 수있다. 분리막 연구는 TIRFM 및 AFM 같은 현미경을 기반 영상 기술에 의존하고 있습니다. 유리는 투명하기 때문에 이에 TIRFM 이미징, 유리 표면은 일반적인 선택이다. 유리의 제조가 비교적 용이하고, 결과의 품질은 주로이전에 지질 소포의 증착 청소 철저한 표면에 의해 결정된다. 높은 축 방향의 해상도에 의한 AFM은 운모 표면을 필요로한다. 운모는 완벽한 기초 분열 부근으로, 규산염 광물이다. 따라서, 갓 절단 운모 심지어 서브 - 나노 미터 스케일 (9)에 막 고저차의 관찰을 허용, 원자 적으로 평면이다. 이러한 형광 상관 분광법 (FCS), 추적 단일 분자 (SMT) 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 방법을 사용하여 확산 연구는 지질 막 역학들이 퇴적되는에 표면의 유형, 이에 유리에 크게 의존하지만 보여 주었다 운모는 매우 다양한 결과 10, 11를 줄 수 있습니다. 이러한 차이는 멤브레인 프로브의 확산 계수뿐만 아니라, 서로 다른 속도로 확산 입자의 분리 된 집단의 검출 및 가능한 다른 상태 사이의 전환뿐만 있습니다. 따라서,동일한 표면 (이 경우 운모에) 사용되지 않는 TIRFM 및 AFM 기술을 사용하여 얻어진 결과의 직접적인 비교가 종종 문제가된다. TIRFM 및 AFM 이중층 이미징이 같은 운모 표면 (12, 13)에 실시 된 일부 연구가 있지만, 운모는 거의 대부분 때문에 처리 문제, 광학 현미경에 사용되지 않습니다. 운모 준비는 광학 접착제 (12)를 사용하여 커버 슬립에 붙어있다 얇은 전단지,에 손으로 절단을 필요로한다. 그러나이 방법은 만족스러운 결과를 달성하기 위해 연습이 필요합니다. 더욱이, 얻어진 표면은 그들 어려운 낮은 작동 거리, 높은 개구 수 렌즈를 사용할 수 있도록, 흔히 물결 두껍다. 이 프로토콜에 기술 된 바와 같이 제조 된 운모의 표면은 매우 얇은 (170 μM의 coverslip에 두께를 포함하여 ~ 220 μm의) 매우 평면, 성공 고해상도 이미징을위한 중요하다 &quot;파상&quot;를 피하는. 그들은 사용될 수있다TIRFM 또는 공 촛점 설정하십시오. 또한, 동일한 시료를 AFM에 전달 될 수 있고, 심지어 TIRFM / 촛점과 AFM과 동시에 이미지화. 이러한 두 가지 기술을 결합하면 이중층 막 구조물 (14)과 확산 거동의 직접적인 상관 관계를 허용한다. 운모 표면이 갓 절단되어 있기 때문에, 그들은 깨끗하고 (유리 청소 프로토콜은 일반적으로 같은 피라니아 솔루션, 황산, 나트륨 / 수산화 칼륨 등 화학 물질을 포함한다) 시간이 많이, 제대로 재현하고, 잠재적으로 위험한 청소 절차가 필요하지 않습니다. 또한이 프로토콜에 설명 작은 챔버의 설치​​, 50 미만 μL에 효과적인 이중층의 형성에 필요한 소포의 양을 줄일 수 있습니다. 마지막으로, 표면 어셈블리의 전체 프로세스는 시간 소모적 종래의 운모 벽개 및 부착을 마찬가지로, (제조 미만 30 분 소요), 및 서, 고도의 기술을 필요로하지 않는 것이다.

<table><tbody><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (detergent)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-1 Grade</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (high viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (low viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>The lamp was set to 100% power</td></tr></tbody></table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

지원되는 지질 이중층 (SLB 수)가 널리 막 특성 (상 분리, 클러스터링, 역학)과 같은 약물이나 펩티드 등의 다른 화합물과의 상호 작용을 연구하기위한 모델로 사용된다. 그러나 SLB 특성 사용 지원에 따라 다르다. SLB 이미징 및 측정에 일반적으로 사용되는 기술들은 단일 분자 형광 현미경, FCS 및 원자 힘 현미경 (AFM)이다. AFM은 매우 평탄한 표면 (일반적으로 운모)를 필요로하는 동안 대부분의 광학 이미징 연구가 유리 지지체 상에 실시되기 때문에 이들 재료의 충전 및 평활성 속성 강하게 확산 영향 때문에, 이러한 기술의 결과는, 직접 비교 될 수 없다. 불행하게도, 유리 슬라이드에 절단 및 운모의 얇은 조각을 접착제로 붙이기에 필요한 손재주의 높은 수준의 SLB 준비를위한 운모의 일상적인 사용에 장애물을 선물한다. 이 선택의 방법, 이러한 준비 운모 것입니다 있지만표면은 종종 특히 작은 작동 거리, 높은 수치 조리개 렌즈로, 요철 (물결 모양) 및 이미지에 어려운 끝나게. 여기에서 우리는 지질 소포 증착 및 SLB의 제조에 대해 얇고 편평한 운모 표면을 제조하기위한 간단하고 재현 가능한 방법을 제시한다. 또한, 우리의 사용자 정의 만든 챔버는 SLB 형성 소포 만 아주 작은 볼륨을 필요로합니다. AFM 연구에서 사용 된 것과 직접 필적 고품질 지질 이중층 표면의 효율적인 간단하고 저렴한 생산 전체적인 절차 결과.

SLB 수있는 지질 형광 프로브의 확산 동작은 기판에 따라 다르다. SMT 기술과 결합 된 TIRFM는 입자의 움직임을 시각화하고 그들의 확산 계수를 추출하기위한 중요한 방법이다. DOPC 유리와 운모 지원 (1,2 - dioleoyl-SN-글리세로 -3 - 포스 포 콜린) 이중층에 확산 핑고 마이 엘린 - ATTO647N 프로브의 단일 분자 신호는 첨부 된 애니메이션 그림에 표시됩니다. 운모 표면은 여기에 제시된 프로토콜에 따라...

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Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다.

운모의 준비 고해상도 광학 현미경 이미징 지질 이중층 지원

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K 조회수.  Nanyang Technological University.  우리는 고해상도 현미경 운모지지 지질 이중층을 제조하는 방법을 제시한다. 운모는 원자 규모에서 투명하고 평면이지만, 거의 때문에 어려움을 처리하는 영상에서 사용되지; 우리의 준비는 운모 시트도 증착 결과 및 이중층의 제조에 사용되는 물질을 감소시킨다. 

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Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

면역 시냅스와 Kinapse 연구의 형성을위한 지원 평면 Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

연구

생물학

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

스퀴지 기반의 조립 방법과 생체막 마이크로 어레이의 형성

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

생체공학

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

원자 힘 현미경 이미징 및 지원 지질 이중층의 힘 분광학

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

용매를 이용한 지질 이중층 (SALB) 방법에 의해 생체막 제작

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

평면에 단일 분자 형광 현미경은 이중층 지원

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

유리 - 지원 평면 지질 이중층에 자연 살해 세포 면역 시냅스의 슈퍼 해상도 이미징

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

면역학 및 감염병학

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

단일 분자 확산 및 폴리머가 밀집된 지질 막에서의 조립

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

생화학

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

분자 상호 작용 연구를 위한 세포 모방 지원 및 중단된 지질 이중층 모델의 조립

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

지지된 지질 이중층에 대한 막으로 묶인 최소 액틴 피질의 재구성

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: A Microscopy-Based In Vitro Technique to Investigate Septin Assembly on Biological Membrane Mimics

Source: Curtis, B. N. et al. <a href="https://www.jove.com/v/64090">Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we demonstrate a procedure to investigate septin organization on a glass-supported lipid bilayer in vitro using total internal reflection fluorescence microscopy.

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: 생물학적 막 모방체에 대한 셉틴 어셈블리를 조사하기 위한 현미경 기반 체외 기술

Source: Curtis, B. N. et al. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (2022)
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