Name: preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging
Uploaded: 2014-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Yazarlar herhangi bildirimleri var.

1.. Mica ve Slaytlar Hazırlık <ol><li> Sıra No: 1 ½ (0.17 mm) boyama rafa lamelleri. </li><li> 60 ° C&#39;de% 2 deterjan içinde 30 dakika boyunca sonikasyon </li><li> Iyonu giderilmiş su ile 20 kez yıkanır. </li><li> Forseps kullanarak slaytları çıkarın ve sıkıştırılmış hava veya nitrojen kullanarak kuru darbe. </li><li> Mika levha makas veya jilet kullanarak 10 x 10 mm kare parçalar halinde kesilir. </li><li> Jilet kullanarak 2-3 ince broşürler halinde her mika parça kesin. NOT: Bu adım keskin bıçak kullanımını gerektirir. </li></ol> 2.. Mika Montaj ve Montaj Odası <ol><li> Etanol ile temizleyin mikroskobik cam slayt. </li><li> Optik yapıştırıcı kullanılarak cam slayt adım 1.6 kesilmiş mika Tutkal broşür. Düşük viskoziteli yapıştırıcı iyi damla yaymak ve mika tutkal tavsiye edilir. </li><li> , UV lamba altında 10 dk Cure. Not: Yapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve requ önerilen enerji ile UV ışığı ile sertleştirilirTam tedavi için ired 4,5 J / cm 2 &#39;dir. Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir. </li><li> Scotch bant ile ilk birkaç katmanları kaldırarak temiz bir mika yüzey Açığa. </li><li> Mika yüzeye optik yapıştırıcı küçük bir damla (~ 20 mikron) yerleştirin. NOT: Bu aşamada, düşük otofloresan düzeyi ile yüksek viskoziteli yapıştırıcı tavsiye edilir. Deneyimlerimiz düşük (adım 2.2) ve yüksek viskoziteli yapıştırıcı kombinasyonunu kullanarak mika bölme anlamlı etkinliği (adım 2.7) arttırdığını göstermiştir. </li><li> Yavaşça hava kabarcıkları kaçınarak, yapıştırıcı damla üzerine taze temizlenmiş lamel yerleştirin, 1 dakika razı olsun. </li><li> , UV lamba altında 10 dk Cure. NOT: Bu aşamadan sonra cam slayt, mika ve lamel sandviç (birkaç hafta kadar) bir zaman nispeten uzun bir süre boyunca saklanabilir. Mika yüzey taze olduğundan emin olmak için, sadece gerçek SLB öncesi hazırlık sonraki adıma geçin. NOTYapışkan 380nm 350 aralığında maksimum emme ve tam tedavisi için gerekli olan enerji ile önerilen UV ışığı ile sertleştirilir 4.5J/cm 2&#39;dir. Bununla birlikte, farklı ışık kaynakları (yapıştırıcı malzeme, satıcı tarafından sunulan bakınız) Bu adım için kullanılabilir. </li><li> Videoda gösterildiği gibi bir exacto bıçak kullanarak, hafifçe yan cam slayt lamel kaldırılıyor. Çoğu durumda, mika, ince ve düz bir tabaka lamel takılı kalır. (Adım 2.4 tekrarlayın) tekrar edilebilir Mika cam slayt bağlı. </li><li> Mika tabakası hala lamel yapıştırılmış ve adım 2.8 &#39;yarma sırasında tamamen kaldırıldı değildi emin olmak için, çıplak gözle ya da mikroskop altında yüzey kalitesini kontrol edin. Bir forseps ile küçük bir çizik yapma veya iğne diseksiyon mika algılanabilir, farklı bir tutarlılık vardır yapıştırıcı ayırt yardımcı olacaktır. </li><li> 1.5 ml şişe kapağından lastik conta çıkarın ve optik kullanarak yüzeye ters kapağı tutkalyapışkan veya tırnak cilası, ve UV lamba ile tedavi veya hava sırasıyla, 10 dakika kurumasını bekleyin. NOT: örnek AFM görüntüleme ile eş zamanlı optik (TIRFM veya konfokal) için hazırlanmış ise, bir 1.5 ml şişe kapağı mikroskop sahnede AFM baş bağlamaya çok küçük olabilir. Bu durumda, kapak AFM başlığı monte etmek için uygun olan daha büyük bir çapa sahip herhangi bir plastik O-halka ile ikame edilmiş olabilir. Deney mika yüzeye zarar vermeden kapağı çıkarmadan gerektiren bir durumda, silikon yağ yerine, yapıştırıcı veya oje kullanılabilir. </li></ol> 3.. Desteklenen çift katlı lipid (SLB) Oluşumu <ol><li> Yüzeyli odasına taze hazırlanmış lipozom solüsyonu yerleştirin. SLB oluşumu için gerekli olan minimum hacmi ~ 30 ul. NOT: lipozom ve SLB oluşumu hakkında daha fazla bilgi için, örneğin Çanta ark olarak yayınlanan protokolleri, bakınız, 2014 15... </li><li> İstenilen protokolü kullanılarak SLB oluşumu ile devam edin. İnkübasyon sırasında veGörüntüleme, odacık bir ısı-blok veya erime sıcaklığının üstünde kullanılan lipitleri tutmak için gerekli sıcaklığı sağlamak için ısıtıldı mikroskop aşamasında yerleştirilebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Giocondi, M. -. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+topography+of+membrane+domains.">Surface topography of membrane domains.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 703-718 (2010).</li><li>Garcia-Saez, A. J., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surface+analysis+of+membrane+dynamics.">Surface analysis of membrane dynamics.</a> Biochim Biophys Acta. 1798, 766-776 (2010).</li><li>Plochberger, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+slows+down+the+lateral+mobility+of+an+oxidized+phospholipid+in+a+supported+lipid+bilayer.">Cholesterol slows down the lateral mobility of an oxidized phospholipid in a supported lipid bilayer.</a> Langmuir. 26, 17322-17329 (2010).</li><li>El Kirat, K., Morandat, S., Dufr&#234;ne, Y. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+analysis+of+supported+lipid+bilayers+using+atomic+force+microscopy.">Nanoscale analysis of supported lipid bilayers using atomic force microscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1798, 750-765 (2010).</li><li>Szmodis, A. W., Blanchette, C. D., Longo, M. L., Orme, C. A., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermally+induced+phase+separation+in+supported+bilayers+of+glycosphingolipid+and+phospholipid+mixtures.">Thermally induced phase separation in supported bilayers of glycosphingolipid and phospholipid mixtures.</a> Biointerphases. 5, 120-130 (2010).</li><li>Strulson, M. K., Maurer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microcontact+printing+for+creation+of+patterned+lipid+bilayers+on+tetraethylene+glycol+self-assembled+monolayers.">Microcontact printing for creation of patterned lipid bilayers on tetraethylene glycol self-assembled monolayers.</a> Langmuir. 27, 12052-12057 (2011).</li><li>Satriano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+oxidized+polyhydroxymethylsiloxane--a+new+smooth+surface+for+supported+lipid+bilayer+formation.">Plasma oxidized polyhydroxymethylsiloxane--a new smooth surface for supported lipid bilayer formation.</a> Langmuir. 26, 5715-5725 (2010).</li><li>Bag, N., Sankaran, J., Paul, A., Kraut, R. S., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calibration+and+limits+of+camera-based+fluorescence+correlation+spectroscopy:+a+supported+lipid+bilayer+study.">Calibration and limits of camera-based fluorescence correlation spectroscopy: a supported lipid bilayer study.</a> Chemphyschem: a European Journal of Chemical Physics and Physical Chemistry. 13, 2784-2794 (2012).</li><li>Singh, S., Keller, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Atomic+force+microscopy+of+supported+planar+membrane+bilayers.">Atomic force microscopy of supported planar membrane bilayers.</a> Biophysical Journal. 60, 1401-1410 (1991).</li><li>Przybylo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+Diffusion+in+Giant+Unilamellar+Vesicles+Is+More+than+2+Times+Faster+than+in+Supported+Phospholipid+Bilayers+under+Identical+Conditions.">Lipid Diffusion in Giant Unilamellar Vesicles Is More than 2 Times Faster than in Supported Phospholipid Bilayers under Identical Conditions.</a> Langmuir. 22, 9096-9099 (2006).</li><li>Scomparin, C., Lecuyer, S., Ferreira, M., Charitat, T., Tinland, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion+in+supported+lipid+bilayers:+influence+of+substrate+and+preparation+technique+on+the+internal+dynamics.">Diffusion in supported lipid bilayers: influence of substrate and preparation technique on the internal dynamics.</a> Eur Phys J E Soft Matter. 28, 211-220 (2009).</li><li>Oreopoulos, J., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+scanning+probe+and+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Combined scanning probe and total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods. 46, 2-10 (2008).</li><li>Shaw, J. E., Slade, A., Yip, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+in+situ+total+internal+reflectance+fluorescence/atomic+force+microscopy+studies+of+DPPC/dPOPC+microdomains+in+supported+planar+lipid+bilayers.">Simultaneous in situ total internal reflectance fluorescence/atomic force microscopy studies of DPPC/dPOPC microdomains in supported planar lipid bilayers.</a> J Am Chem Soc. 125, 11838-11839 (2003).</li><li>Skaug, M. J., Faller, R., Longo, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlating+anomalous+diffusion+with+lipid+bilayer+membrane+structure+using+single+molecule+tracking+and+atomic+force+microscopy.">Correlating anomalous diffusion with lipid bilayer membrane structure using single molecule tracking and atomic force microscopy.</a> J Chem Phys. 134, (2011).</li><li>Bag, N., Yap, D. H., Wohland, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temperature+dependence+of+diffusion+in+model+and+live+cell+membranes+characterized+by+imaging+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Temperature dependence of diffusion in model and live cell membranes characterized by imaging fluorescence correlation spectroscopy.</a> Biochimica et Biophysica Acta. , (2013).</li><li>Sbalzarini, I. F., Koumoutsakos, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Feature+point+tracking+and+trajectory+analysis+for+video+imaging+in+cell+biology.">Feature point tracking and trajectory analysis for video imaging in cell biology.</a> J Struct Biol. 151, 182-195 (2005).</li><li>Linkert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metadata+matters:+access+to+image+data+in+the+real+world.">Metadata matters: access to image data in the real world.</a> J Cell Biol. 189, 777-782 (2010).</li><li>Schutz, G. J., Schindler, H., Schmidt, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+microscopy+on+model+membranes+reveals+anomalous+diffusion.">Single-molecule microscopy on model membranes reveals anomalous diffusion.</a> Biophys J. 73, 1073-1080 (1997).</li><li>Matysik, A., Kraut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrackArt:+the+user+friendly+interface+for+single+molecule+tracking+data+analysis+and+simulation+applied+to+complex+diffusion+in+mica+supported+lipid+bilayers.">TrackArt: the user friendly interface for single molecule tracking data analysis and simulation applied to complex diffusion in mica supported lipid bilayers.</a> BMC Research Notes. 7, (2014).</li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Bu protokol, lipid iki katmanlı birikimi ve yüksek çözünürlüklü görüntüleme için düz ve ince mika yüzeylerin hazırlanması için bir yöntemi tarif etmektedir. Bu teknik, çok yüksek kalitede bir yüzey elde etmek için mika kritik olan cam mika cam sandviç (adım 2.8), dikkatli sökme sınırlı az manuel beceri gerektirir. Mika yaran olmadan optik yapıştırıcı ayırmak için mümkün olduğu Taze kırılmış mika Denetim zaman optik yapıştırıcı maruz kalan bölgeleri bırakarak, bu noktada g...

Mevcut protokolün genel amacı da atomik kuvvet ile kombine edilebilir optik toplam iç yansıma floresan mikroskobu (TIRFM) veya konfokal mikroskopi kullanılarak mika desteklenen lipit tabakalarının (SLBS) yüksek çözünürlüklü görüntüleme için mika yüzeyleri hazırlamak için bir yöntem göstermektir mikroskobu (AFM). SLBS lipid kümeleme, faz ayrılması, peptidler, proteinler veya diğer bileşikler 1-5 ile iki tabakalı bileşenler veya bunların etkileşimleri ve dinamikleri çok sayıda çalışmalar için yaygın olarak kullanılan bir model vardır. Farklı alt tabakalar SLB oluşumu çalışmanın 4,6-8 doğasına bağlı olarak, (örneğin, cam, mika, silikon dioksit, polimerler) için kullanılabilir. Tipik membran çalışmalar, TIRFM ve AFM gibi mikroskopi tabanlı görüntüleme teknikleri, güveniyor. Cam şeffaf olduğu için Böylece TIRFM görüntüleme için, bir cam yüzeyi, tipik bir seçimdir. Cam imalatı nispeten kolay ve sonuçların kalitesi öncelikleönce lipid veziküllerin çökeltilmesinden temizleme ayrıntılı yüzey tarafından belirlenir. Yüksek çözünürlük nedeniyle eksenel AFM mika yüzeyleri gerektirir. Mika mükemmel bazal bölünme yakın olan, bir silikat mineraldir. Böylece, taze yarılmış mika hatta alt-nanometre ölçeğinde 9 zar yükseklik farklarının gözlem sağlayan atomik düz. Örneğin flüoresan korelasyon spektroskopisi (FCS), izleme tek bir molekül (SMT) ve (sıkı bağlamak) ışıkla ağartma sonra floresan kurtarma gibi yöntemler kullanılarak difüzyon çalışmalar, lipid zarı dinamikleri tevdi hangi üzerine yüzey tipine, burada cam büyük ölçüde bağlıdır, ancak gösterdi ve mika yaygın olarak farklı sonuçlar 10,11 verebilir. Bu farklılıklar membran sondaların difüzyon katsayıları, aynı zamanda farklı oranları ile difüzyon parçacıkların ayrı popülasyonlarının algılama ve muhtemelen farklı durumları arasında geçiş sadece içerir. Bu durumda,Aynı yüzey (bu durumda mika) kullanılmadıkça TIRFM ve AFM teknikleri kullanılarak elde edilen sonuçların doğrudan bir karşılaştırma, genellikle sorunludur. TIRFM ve AFM bilayeri görüntüleme aynı mika yüzeye 12,13 yürütülmüştür bazı çalışmalar olmasına karşın, mika nadiren çoğunlukla nedeniyle taşıma problemleri, optik mikroskopi için kullanılır. Mika hazırlık sonra optik yapıştırıcı 12 kullanarak lamel yapıştırılmış ince broşürler, içine elle kesim gerektirir. Bu yöntem, bununla birlikte tatmin edici sonuçlar elde etmek için bazı pratik gerektirir. Dahası, elde yüzeyleri onları zor düşük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile kullanmak için yapım, genellikle dalgalı ve kalın. Bu protokolde tarif edildiği gibi hazırlanmıştır mika yüzeyler çok ince (170 um lamel kalınlığı dahil ~ 220 um) ve son derece düz, başarılı bir yüksek çözünürlüklü görüntüleme için kritik olan &quot;saç, dalgalı&quot; önlenir. Bunlar kullanılabilirTIRFM veya konfokal kurulumları için. Ayrıca, aynı örnekler AFM transfer edilebilir ve hatta TIRFM / konfokal ve AFM ile eş zamanlı olarak görüntülenebilir. Bu iki teknik birleştiren iki katmanlı zar yapısı 14 ile difüzyon davranışı doğrudan bir ilişki sağlar. Mika yüzeyleri taze yarılır, çünkü onlar temiz ve (cam temizleme protokollerinin genellikle Piranha çözüm, sülfürik asit, sodyum / potasyum hidroksit gibi kimyasallar dahil) zaman alıcı, kötü tekrarlanabilir, ve potansiyel olarak tehlikeli temizlik prosedürlerini gerekmez. De tarif edilen bir protokol küçük odası, montajı, en az 50 ul için etkili iki katmanlı oluşumu için gerekli veziküllerin hacmini azaltır. Son olarak, yüzey montaj tüm süreç zaman tüketen geleneksel mika bölünme ve tutkallama işlemi yaptığı gibi, (hazırlık az 30 dakika sürer), ve manuel beceri yüksek derecede gerektirmez değildir.

<table><tbody><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB15051</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips 24 x 50 mm - No H1.5</td><td>Marienfeld</td><td>102222</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850357</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III (detergent)</td><td>Hellma Analytics</td><td>320.003</td><td></td></tr><tr><td>Mica V-1 Grade</td><td>SPI Suppliers</td><td>1872-CA</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (high viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA63</td><td></td></tr><tr><td>Optical Adhesive (low viscosity)</td><td>Norland Products</td><td>NOA60</td><td></td></tr><tr><td>Sphingomyelin-ATTO647N</td><td>AttoTec</td><td>AD 647N-171</td><td></td></tr><tr><td>UV lamp</td><td>Synoptics Ltd.</td><td>GelVue GVM20</td><td>The lamp was set to 100% power</td></tr></tbody></table>

preparation of mica supported lipid bilayers for high resolution optical microscopy imaging

Desteklenen ikili lipid tabakalarıdır (SLBS) yaygın membran özellikleri (faz ayrımı, kümeleme dinamikleri) ve bu tür ilaçların veya peptidler gibi başka bileşikler ile etkileşimi incelemek için bir model olarak kullanılır. Ancak SLB özellikleri, kullanılan desteğine bağlı olarak farklılık gösterir. SLB görüntüleme ve ölçümler için yaygın olarak kullanılan teknikler tek bir molekülün floresan mikroskopi, FCS ve atomik kuvvet mikroskobu (AFM) vardır. AFM son derece düz bir yüzeye (genellikle mika) gerektirir ise en çok optik görüntüleme çalışmaları, bir cam destek üzerinde gerçekleştirildiği için bu maddelerin şarj ve yumuşaklık özellikleri güçlü difüzyon etkileyebilir, çünkü bu teknikleri sonuçları, doğrudan karşılaştırılamaz. Ne yazık ki, cam slayt kesme ve mika ince dilim yapıştırma için gerekli olan el becerisi yüksek SLB hazırlanması için mika rutin kullanımı için bir engel oluşturur. Bu tercih edilen bir yöntem, bu tür hazır mika olmasına karşınyüzeyleri sık sık özellikle küçük çalışma mesafesi, yüksek sayısal diyafram lensler ile, düzensiz (dalgalı) ve görüntü zor olarak bitirmek. Burada vezikül lipid birikimi ve SLB hazırlanması için, ince, düz bir mika yüzeylerin hazırlanması için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem sunarlar. Ayrıca, bizim ölçüye oda SLB veziküller formasyonu için sadece çok küçük miktarlar gerektirir. AFM çalışmalarda kullanılan doğrudan karşılaştırılabilir olan yüksek kaliteli lipid iki katmanlı yüzeylerin, etkili, basit ve ucuz bir üretim genel prosedürü ile sonuçlanır.

SLBS floresan lipid sondaların difüzyon davranışı alt maddeye bağlı olarak farklıdır. SMT tekniği ile birleştirilmiş TIRFM parçacık hareketleri görselleştirme ve difüzyon katsayıları ayıklamak için değerli bir yöntemdir. Bir DOPC cam ve mika üzerinde desteklenen (1,2-dioleoil-sn-glisero-3-fosfokolin) iki katmanlı olarak bir difüzyon Sfingomiyelin-ATTO647N prob tek molekül sinyalleri bağlı hareketli şekilde gösterilir. Burada yer yüzeyi mika edilen protokole göre hazırlandı. Op...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging at JoVE.com

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır.

Mika hazırlanması Yüksek Çözünürlüklü Optik Mikroskopi Görüntüleme için lipit tabakalarının Desteklenen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

preparation-mica-supported-lipid-bilayers-for-high-resolution-optical

Research

JoVE Journal

Bioengineering

13.3K Görüntüleme.  Nanyang Technological University.  Biz yüksek çözünürlüklü mikroskopi için mika desteklenen lipit katmanlarını hazırlamanın bir yöntem mevcut. Mica bir atomik ölçekte şeffaf ve düz, ancak nadiren nedeniyle zorluklar ele görüntülenmesinde kullanılan; bizim hazırlık mika tabakanın da birikimi ile sonuçlanır, ve iki katmanlı hazırlanmasında kullanılan malzemeyi azaltır. 

Video: Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported Planar Bilayers for the Formation of Study of Immunological Synapses and Kinapse

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions between lymphocytes and antigen presenting cells, we use Ni2+-chelating lipids to anchor recombinant cell adhesion and MHC proteins to the upper leaflet of a bilayer with poly-histidine tags. Planar bilayers are generated by preparing lipid, treating the glass surfaces where the bilayer will form, and then forming the bilayer in a specialized chamber containing a flow-cell where the lymphocytes will be added.  Then, bilayers are charged with Ni and his-tagged recombinant proteins are added.  Finally,  lymphocytes are injected into the flow cell and TIRF microscopy can be used to image synapse formation and the mechanisms that control T cell locomotion, sites of receptor sorting,  and sites of receptor degradation.

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse. Here, we show methods for anchoring cell adhesion proteins known to modulate synapse formation to the upper leaflet of the lipid bilyer and visualize synapse formation using TIRF microscopy.

İmmünolojik Sinapslar ve Kinapse Eğitim Oluşumu için desteklenen Düzlemsel Bilayers

Supported planar bilayers are powerful tools that can be used to model the molecular interactions in an immunological synapse.   To mimic the interactions ...

Biyoloji

Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Bir Çekçek tabanlı Meclisi Yöntemi ile Biomembrane Mikroarray&#39;ler oluşumu

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Biyomühendislik

Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Atomik Kuvvet Mikroskobu Görüntüleme ve Desteklenen Lipid Bilayers Kuvvet Spektroskopisi

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

Solvent destekli çift katlı lipid (SALB) Yöntemi ile biyomembran Fabrikasyon

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Planar on Tek Molekül Floresans Mikroskopi bilayers Desteklenen

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Super-resolution Imaging of the Natural Killer Cell Immunological Synapse on a Glass-supported Planar Lipid Bilayer

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has been in the study of immunological synapse formation, due to the ability of the glass-supported planar lipid bilayers to mimic the surface of a target cell while forming a horizontal interface. The recent advances in super-resolution imaging have further allowed scientists to better view the fine details of synapse structure. In this study, one of these advanced techniques, stimulated emission depletion (STED), is utilized to study the structure of natural killer (NK) cell synapses on the supported lipid bilayer. Provided herein is an easy-to-follow protocol detailing: how to prepare raw synthetic phospholipids for use in synthesizing glass-supported bilayers; how to determine how densely protein of a given concentration occupies the bilayer's attachment sites; how to construct a supported lipid bilayer containing antibodies against NK cell activating receptor CD16; and finally, how to image human NK cells on this bilayer using STED super-resolution microscopy, with a focus on distribution of perforin positive lytic granules and filamentous actin at NK synapses. Thus, combining the glass-supported planar lipid bilayer system with STED technique, we demonstrate the feasibility and application of this combined technique, as well as intracellular structures at NK immunological synapse with super-resolution.

We describe here a combination of the glass-supported lipid bilayer technique of forming immunological synapses with the super-resolution imaging technique of stimulated emission depletion (STED) microscopy. The goal of this protocol is to provide users with the instructions necessary to successfully carry out these two techniques.

Bir Cam destekli Planar çift katlı lipid Doğal Öldürücü Hücre İmmünoloji Synapse Süper çözünürlüklü Görüntüleme

The glass-supported planar lipid bilayer system has been utilized in a variety of disciplines. One of the most useful applications of this technique has ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction with lipids employ naked bilayer membranes. Such systems lack the complexities of crowding by membrane-embedded proteins and glycans and exclude the associated volume effects encountered on cellular membrane surfaces. Also, the negatively charged glass surface onto which the lipid bilayers are formed prevents the free diffusion of transmembrane biomolecules. Here, we present a well-characterized polymer-lipid membrane as a mimic for crowded lipid membranes. This protocol utilizes polyethylene glycol (PEG)-conjugated lipids as a generalized approach for incorporating crowders into the supported lipid bilayer&#160;(SLB). First, a cleaning procedure of the microscopic slides and coverslips for performing single-molecule experiments is presented. Next, methods for characterizing the PEG-SLBs and performing single-molecule experiments of the binding, diffusion, and assembly of biomolecules using single-molecule tracking and photobleaching are discussed. Finally, this protocol demonstrates how to monitor the nanopore assembly of bacterial pore-forming toxin Cytolysin A (ClyA) on crowded lipid membranes with single-molecule photobleaching analysis. MATLAB codes with example datasets are also included to perform some of the common analyses such as particle tracking, extracting diffusive behavior, and subunit counting.

Here, a protocol to perform and analyze the binding, mobility, and assembly of single molecules on artificial crowded lipid membranes using single-molecule total internal reflection fluorescence (smTIRF) microscopy is presented.

Tek Moleküllü Difüzyon ve Polimer Kalabalık Lipid Membranlara Montaj

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Biyokimya

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

Moleküler Etkileşimlerin Çalışması için Desteklenen ve Askıya Alınan Lipid Bilayer Modellerinin Hücre Taklit Montajı

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane with the underlying actin cortex. In the past decades, reconstituted, minimal systems based on supported lipid bilayers in combination with actin filament networks have proven to be very instrumental in unraveling basic mechanisms and consequences of membrane-tethered actin networks, as well as in studying the functions of individual membrane-associated proteins. Here, we describe how to reconstitute such active composite systems in vitro that consist of fluid supported lipid bilayers coupled via membrane-associated actin-binding proteins to dynamic actin filaments and myosin motors that can be readily observed via total internal reflection fluorescence microscopy. An open-chamber design allows one to assemble the system in a step-by-step manner and to systematically control many parameters such as linker protein concentration, actin concentration, actin filament length, actin/myosin ratio, as well as ATP levels. Finally, we discuss how to control the quality of the system, how to detect and troubleshoot commonly occurring problems, and some limitations of this system in comparison with the living cell surface.

This protocol describes the formation of supported lipid bilayers and the addition of cytoskeletal filaments and motor proteins to study the dynamics of reconstituted, membrane-tethered cytoskeletal networks using fluorescence microscopy.

Membrana Bağlı Minimal Aktin Kortekslerinin Desteklenen Lipid Çift Katmanlı Üzerinde Yeniden Sulandırılması

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Planar Supported Lipid Bilayer Assay: A Microscopy-Based In Vitro Technique to Investigate Septin Assembly on Biological Membrane Mimics

Source: Curtis, B. N. et al. <a href="https://www.jove.com/v/64090">Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions.</a> J. Vis. Exp. (2022)
In this video, we demonstrate a procedure to investigate septin organization on a glass-supported lipid bilayer in vitro using total internal reflection fluorescence microscopy.

Düzlemsel Destekli Lipid Bilayer Deneyi: Biyolojik Membran Mimiklerinde Septin Montajını Araştırmak İçin Mikroskopi Tabanlı İn Vitro Teknik

Source: Curtis, B. N. et al. Reconstitution of Septin Assembly at Membranes to Study Biophysical Properties and Functions. J. Vis. Exp. (2022)
In this ...